ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

הוויסות של איתות קומפלקס eIF4F קשור לתרגום מוגבר של תת-קבוצות mRNA המעורבות בהתפשטות סרטן ובהישרדות. כאן אנו מתארים מבחני אינטראקציה מבוססי חלבון-חלבון eIF4E-eIF4G המאפשרים לנו להעריך הפרעה הנגרמת על ידי תרופות בשלמות קומפלקס eIF4F בתאים חיים. יש עניין הולך וגובר בפיתוח שיטות המכוונות ביעילות לממשק חלבון-חלבון.

חזינו כי מבחני ה-eIF4E-eIF4G PPI שלנו יסייעו בטיפוח אסטרטגיות אלה ובתיקונן. בדיקה זו תספק תוכנית ראשונית אופטימלית עבורה להוביל אופטימיזציה של מעכבי eIF4E-eIF4G. זריעת התא בצורה נכונה וביצוע טרנספקציה של העברה הם ההיבט המאתגר ביותר של מוצר זה מכיוון שהם עשויים לשקף ישירות על דיכוי מערכת הדיווח של PPI.

לאחר הפשרה וספירת תאים, זרעו 6 צלחות באר עם תאי HEK 293, תוך שימוש ב -2 מיליליטר של מדיום גידול סטנדרטי לבאר. בבוקר היום השני, עבור כל טרנספקציה מהוקצעת, יש לדלל 9 מיקרוליטר של תמיסה מבוססת ליפוזום בשפופרת המכילה 125 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום. בזמן שהליפוזומים המדוללים דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, הכינו את תערובת המאסטר של ה-DNA על ידי דילול 3 מיקרוגרם מכל פלסמיד ב-125 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת עבור כל צינור טרנספקציה.

הוסף 12 מיקרוליטר של ריאגנטים משפרים לתערובת מאסטר DNA 2, ואז ערבב היטב. הוסיפו מיד את התערובת הזו לכל שפופרת של ליפוזומים מדוללים ביחס של 1 ל-1. לאחר דגירה של קומפלקס שומנים DNA זה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, הוסף את הקומפלקס לכל באר מ -6 צלחות הבאר.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. בבוקר היום השלישי יש לשטוף כל באר עם 1 מיליליטר PBS, ולהוסיף 0.3 מיליליטר טריפסין. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.

לאחר הדגירה, נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר לכל באר של מדיום הסרום המופחת ללא פנול אדום. העבירו את התאים המועברים לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-290x G למשך 5 דקות.

שאפו את המדיום, והשעו מחדש את כדור התא ב-2 מיליליטר של מדיום הסרום המופחת. זרע את תאי HEK 293 שעברו טרנספטציה בלוחות אטומים של 96 בארות, בצפיפות של 30,000 תאים לבאר ב-90 מיקרוליטר של מדיום. כדי להשיג 3 שכפולים טכניים עבור 3 תרכובות שונות באותו ניסוי, זרע 60 בארות.

אל תכלול את הבארות בקצוות. מיד לאחר זריעת התאים המועברים, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת תרכובת DMSO של 10% לכל באר. הכן תמיסות מלאי מורכבות של 1 מילימולרית על ידי המסת כל תרכובת ריבית ב-100% DMSO.

על מנת לקבל 3 שכפולים עבור כל טיטרציה של תרכובת, השתמש ב-8 מיקרוליטר מתמיסת מלאי התרכובת של 1 מילי-מולאר. בצע דילול סדרתי כפול של כל תמיסת תרכובת מלאי ב-8 בארות של צלחת PCR של 96 בארות על ידי פיפטינג של 4 מיקרוליטר מהמלאי של 1 מילי-מולרית ל-4 מיקרוליטר של 100% DMSO עבור כל נקודת טיטרציה. השלך את 4 המיקרוליטרים העודפים לאחר הנקודה האחרונה של הדילול הסדרתי הכפול.

הוסף 36 מיקרוליטר של מים סטריליים בדרגת HPLC לכל צינור כדי להכין 40 מיקרוליטר של תמיסות דילול טוריות מורכבות פי 10 ב-10% DMSO. כמו כן, הכינו בקרה. 10% DMS רק פתרון מלאי במים סטריליים בדרגת HPLC.

הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסות עבודה פי 10 לתאים בצלחת האטומה של 96 בארות על מנת להניב את הריכוז הסופי המיועד, עם ריכוז DMSO שיורי של 1% דגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 3 שעות. לאחר 3 שעות, התחל להכין את מגיב מצע הלוציפראז על ידי שילוב של נפח אחד של מצע עם 19 נפחים של מגיב הדילול. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף מיד 25 מיקרוליטר של מגיב המצע לכל באר של צלחת 96 הבאר עם התאים.

נענע את הצלחת על שייקר מסלולי ב -350 סל"ד, למשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להעריך את הזוהר, הנח את הצלחת על קורא צלחות. הגדר את קורא המראה לזוהר ואת מסנן הפליטה ל-455.

השתמש בגובה מדידה של 6.5 מילימטרים עם זמן מדידה של שנייה אחת. כדי להעריך את כדאיות התא, הוסף 33 מיקרוליטר של מגיב בדיקת כדאיות לכל באר. לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, הערך את הזוהר עם קורא הלוחות על ידי הגדרת קורא המראה לזוהר ומסנן הפליטה ל-600.

השתמש בגובה מדידה של 6.5 מילימטרים ובזמן מדידה של שנייה אחת. השתמש בנתונים מקורא הלוחות כדי לקבוע את ערך ה-IC 50 של כל תרכובת, על ידי התאמת הנתונים למשוואת עקומת ההתאמה של 4 הפרמטרים המתוארת בכתב היד. תאי HEK 293 הועברו עם מערכת ההשלמה eIF4E-eIF4G, ולאחר מכן נסוגו וטופלו במעכבי mTOR.

כאשר הזוהר הוערך 4 שעות לאחר הטיפול, PP242 ורפמיצין יצרו שניהם עיכוב תלוי מינון של האות. לא PP242 ולא רפמיצין גרמו לירידה משמעותית בכדאיות התא, מה שמצביע על כך שהירידה בזוהר במערכת ההשלמה eIF4E-eIF4G אינה נובעת ממוות תאים לא ספציפי, אלא מהפרעה באינטראקציה של EIF4E-4G. ניתוח כתמים מערביים, בעקבות ניסוי משיכה m7GTP, הראה כי שיבוש מתווך 4EBP1 של אינטראקציה אנדוגנית eIF4E-eIF4G נמצא בקורלציה עם אות הבדיקה הנמדד eIF4E-eIF4G.

PP242 היה מעכב חזק יותר של זרחון כולל של 4EBP1 מאשר רפמיצין. שני המעכבים הראו השפעה על איתות mTOR כרגיל, כאשר רפמיצין פעיל יותר כנגד מצעי mTORC1, ו-PP242 מכוון הן ל-mTORC1 והן ל-mTORC2. ההיבט הקריטי ביותר של מוצר זה הוא זריעת התאים ביום העסקה, זריעה מחדש של התאים בתווך ללא פנול אדום, הערכת הזוהר של בדיקת ההשלמה eIF4E-eIF4G, והפעלת בדיקת הכדאיות על אותה צלחת.

ניתן לבצע בדיקת כדאיות משנית כדי להעריך כל תרופת מטרה והשפעות ספציפיות ידועות.