Name: ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: חקור מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים לניטור הרכבת eIF4F והערכת השפעת תרופות על שלמות המרכב. שיטה זו תומכת בפיתוח מעכבי אינטראקציות חלבון-חלבון לחקר סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תקציב הליבה של p53lab (BMSI, A * STAR) ומענק JCO VIP (A * STAR).

קו התא HEK293 שימש לפרוטוקול והיה מתורבת בינוני הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין. התאים היו תרבית ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2 בסביבה לחה.
1. הערכה כמותית של הפרעה מורכבת eIF4F באמצעות eIF4E:eIF4G604-646 השלמה
<ol><li>תרבות תאים והעברה ארעית של eIF4E:eIF4G604-646 השלמה<ol>
<li>השתמש בתאים מופשרים טריים עם פחות מ -20 קטעים לכל הניסויים. ביום הראשון, קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים רגיל וספור את התאים בני קיימא הכולל באמצעות שיטת אי-הכללה כחולהTrypan 13.</li>
		<li>זרעים 6-באר צלחות עם 0.9 - 1.2 x 106 של HEK 293 תאים לבאר ב 2 מ"ל של מדיום צמיחה סטנדרטי. הערה: על מנת להשיג את היעילות הטובה ביותר transfection בתוך קווי התא המצוין לעיל, ודא כי התאים המצולפים הם 70-90% confluent יום לאחר הזריעה.</li>
		<li>בבוקר היום השני, תאים שותף עם SubA-eIF4E ו- eIF4G604-646-SubB פלסמיד באמצעות מגיב transfection מבוסס שומנים (ראה טבלה של חומרים) כמתואר להלן.<ol>
<li>לדלל 9 μL של פתרון מבוסס ליפוזום בצינור המכיל 125 μL של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום (ראה טבלה של חומרים)עבור כל transfection ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
			<li>הכן תערובת הורים של DNA על ידי דילול 3 מיקרוגרם של כל פלסמיד ב 125 μL של מדיום סרום מופחת עבור כל צינור transfection.</li>
			<li>הוסף 12 μL של ריאגנטים משפר לצינור לערבב DNA מאסטר, לערבב היטב ומיד להוסיף את ה- DNA: תערובת מאסטר משפר לכל צינור של ליפוזומים מדוללים ביחס 1:1. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>מוסיפים את קומפלקס הדנ"א-שומנים לכל באר ומדגירה את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ל-24 שעות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בבוקר יום 3, לשטוף כל באר עם 1 מ"ל של PBS.</li>
		<li>הסר את PBS ואת תאי הדגירה בכל באר עם 0.3 מ"ל של טריפסין במשך 5 דקות ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>לנטרל טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום המכיל 0% FCS בכל באר ולהעביר תאים transfected לתוך צינור 15 מ"ל. הערה: פנול אדום יכול להפריע לפעילות לוציפראז; לכן, יש לטפל בתאים משלב זה ואילך במדיום ללא פנול אדום.</li>
		<li>לסובב את התאים במשך 5 דקות ב 290 x g ולשואף את המדיום. Resuspend התאים ב 2 מ"ל של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום המכיל 0% FCS. ספור כמתואר בשלב 1.1.</li>
		<li>זרעים חצץ HEK 293 תאים ב 96 לוחות אטומים היטב בצפיפות של 30,000 תאים לבאר ב 90 μL של בינוני ללא פנול אדום המכיל 0% FCS. על מנת להשיג 3 משכפלים טכניים בתוך אותו ניסוי עבור 3 תרכובות שונות, זרע 60 בארות של הצלחות עם תאים למעט בארות בקצוות.</li>
		<li>מיד לאחר זריעת התאים החצויים, להוסיף 10 μL של 10% פתרון תרכובת DMSO (ראה שלב 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה מורכבת<ol>
<li>הכן פתרונות מלאי מורכבים של 1 מ"מ על ידי המסת תרכובת הריבית ב- 100% DMSO (v/v). על מנת לקבל 3 משכפלים עבור כל טיטרציה מורכבת, להשתמש 8 μL של פתרון 1 מ"מ מורכבים מלאי. הערה: נפח של תרכובת מלאי 1 mM בשימוש הוא יותר ממה שהוא נחוץ. פעולה זו נעשית כדי לקחת בחשבון שגיאות pipetting אם בכלל.</li>
		<li>בצע דילול סדרתי פי 2 של פתרון תרכובת המניה עם 4 μL של מניית 1 מ"מ לתוך 4 μL של 100% DMSO עבור כל נקודת טיטרציה. הערה: לקבלת טיטרציה מורכבת מלאה, בצע 9 דילולים סדרתיים מהמניה ההתחלתית ב- DMSO של 100%. אם תרכובות מרובות צריך להיבדק, להשתמש צלחת 96 גם פיפטה רב ערוצית כדי להקל על צעד זה ואת הדילולים הבאים.</li>
		<li>הוסף 36 μL של מים סטריליים ברמת HPLC עבור כל נקודה של הדילול הטורי פי 2 כדי להכין 40 μL של פתרונות עבודה 10x ב- 10% DMSO (v/v) (כלומר. 100 מיקרומטר עד 0.39 μM 10% סדרת מניות DMSO יוביל לפתרון סופי של 10 מיקרומטר עד 0.039 מיקרומטר, ב 1% DMSO כאשר הוסיף לתאים). באשר לבקרת טיפול, גם להכין 10% DMSO רק פתרון מלאי במים סטריליים כיתה HPLC.</li>
		<li>הוסף 10 μL של פתרונות עבודה 10x לתאים בצלחת 96 אטום היטב על מנת להניב את הריכוז הסופי המיועד עם ריכוז DMSO שיורית של 1% (v / v) בנפח כולל של 100 μL ודגרת עבור 3 שעות ב 37 °C (70 °F) עם 5% v / v אטמוספרי CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>מבחני השלמה ותכנון של לוציפראז<ol>
<li>לאחר 3 שעות של סימום, להתחיל להכין את ריאגנט מצע לוציפראז על ידי שילוב 1 נפח של מצע עם 19 כרכים של מגיב דילול (ראה הוראות היצרן). הערה: מבחני לוציפראז מבוצעים באמצעות ערכה מסחרית זמינה (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף מיד 25 μL של מגיב מצע.</li>
		<li>לנער את הצלחת ב 350 סל"ד במשך 50 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להעריך את הזוהר באמצעות קורא צלחת. כדי לעשות זאת, הגדר את קורא המראה על זוהר ואת מסנן הפליטה על 455. השתמש בגובה מדידה של 6.5 מ"מ עם זמן מדידה של 1 s.</li>
		<li>על מנת לתחת את הכדאיות של התא, להוסיף 33 μL של ריאגנט בדיקת הכדאיות ולאחר מכן למדוד מחדש את הזוהר שוב לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות קורא הצלחת.</li>
		<li>להעריך את הזוהר עם קורא הלוחות על ידי הגדרת קורא המראה על Luminescence ואת מסנן הפליטה על 600 ננומטר. השתמש בגובה מדידה של 6.5 מ"מ עם זמן מדידה של 1 s. הערה: הכדאיות מוערכת על ידי מדידת הרמה התאית של ATP על תמוגת התא לפי הוראות היצרן. Multiplexing אפשרי במקרה זה מאז מבחני הכדאיות משתמש לוציפראז שונה עם אורך גל פליטה שונה.</li>
		<li>השתמש בנתונים כדי לקבוע את ערכי ה- IC50 של כל תרכובת לפי עקומה המתאימה את הנתונים למשוואה עקומה תואמת 4 פרמטרים: Y = ((A-D)/(1+(x/C))) + D הערכים המספריים D ו- A חייבים להיות מוגבלים בתהליך התאמת העקומה: D = ערך זוהר על ציר Y עבור אסימפטוט עקומה מינימלי או רמת תגובה תיאורטית מינימלית הצפויה ממחיצת ההשלמה eIF4E:4G. A = ערך זוהר על ציר Y עבור אסימפטוט עקומה מקסימלית או תגובה ברמה תיאורטית מקסימלית הצפויה ממחיצת ההשלמה eIF4E:4G. הערה: הערך עבור התגובה המינימלית נגזר 1% DMSO (v / v) טיפול בקרה ואת הערך עבור התגובה המקסימלית נגזר התגובה המקסימלית של מעכב mTOR זיקה גבוהה כי יש מישור ללא השפעה על הכדאיות של התא.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מתאם eIF4E:eIF4G604-646 עיכוב מבחנים עם הפרעה מורכבת eIF4F בתאים
<ol><li>כדי לאשר כי האות הנמדד על ידי ההסתעפות תואם את ההפרעה הפיזית של אינטראקציה eIF4E-eIF4G על ידי המתחם, תאי זרע כמתואר בשלב 1.1.</li>
	<li>ביום שאחרי, להחליף את המדיום עם 1 מ"ל של מדיום סרום מופחת לא מכיל פנול אדום דגירה במשך 4 שעות עם תרכובת של עניין. להבטיח ריכוז DMSO שיורית של 1% (v / v) בנפח כולל של 1 מ"ל. הערה: על מנת לאפשר בקלות מתאם עם התוצאה, השתמש בריכוזים מורכבים בהתחלה, בנקודת האמצע ונקודת הקצה של עקומת ההשלמה הנמדדת.</li>
	<li>תאי Lyse וביצע m7GTP למשוך למטה כדי לבודד eIF4F ו eIF4E:4EBP1 קומפלקסים. נהלים מפורטים על איך לבצע את הניסוי m7GTP למשוך למטה ניתן למצוא במקום אחר14.</li>
	<li>לזהות m7GTP מאוגד eIF4G, eIF4E ו 4EBP1 רמות החלבון על ידי ניתוח כתם מערבי, ולאחר מכן לתאם הפרעה מורכבת eIF4F עם עיכוב אות בדיקת משלים.</li>
</ol>

<ol><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li>
<li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+translation+machinery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li>
<li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex%3A+a+critical+nexus+for+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li>
<li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis%3A+the+role+of+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4E%3A+A+retrospective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li>
<li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G%3A+comparison+with+eIF4E-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li>
<li>Grüner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li>
<li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).</li>
<li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1%3A+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li>
<li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Translation%22%5BJournal%5D)">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819(2013).</li>
<li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40(2019).</li>
<li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein-protein+interactions+%28PPIs%29%3A+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המתוארת במאמר זה משתמשת בהשלמה מבוססת לוציפראז כדי לפקח כמותית על הרכבה מורכבת של eIF4F באמצעות מדידה ישירה של אינטראקציית eIF4G-eIF4E בתאים חיים. סיפקנו פרטים לשימוש במערכת השלמה eIF4E-eIF4G והראינו גם כי המערכת מדויקת ביותר במדידת ניתוק 4EBP1 בתיווך תרופות של אינטראקציה eIF4E-eIF4G16. על מנת להקל על התפוקה של מבחנים אלה, ההתקנה הניסיונית המתוארת במאמר זה תוכננה לשימוש בפורמט microplate 96 היטב.
לקבלת תוצאות מיטביות, יש לשקול שני שלבים קריטיים בעת ביצוע הבדיקה. ר...

שליטה בביטוי גנים ממלאת תפקיד מרכזי בביצוע נכון של תוכניות תאיות כגון התפשטות צמיחה ובידול. מנגנון בקרה רגולטורי יכול להיות מופעל או ברמה של שעתוק גנים או ברמה של תרגום mRNA. בעשור האחרון, זה הפך להיות יותר ויותר ברור כי שליטה תרגום על ידי אפנון של תהליך החניכה ולא את הצעדים המאוחרים יותר של התארכות וסיום יכול לווסת דק סינתזה של תת קבוצות ספציפיות של חלבונים לשחק מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות.
תרגום מוגבר של mRNAs המעורבים בהישרדות, תגובות אנטי אוטופגיות ואנטי אפופטוטיות היו מעורבות במספר סוגי סרטן וגם נקשרו באופן סיבתי להפעלה חריגה או לביטוי של גורמי ייזום תרגום1.
קומפלקס eIF4F הוא וסת ראשי של ייזום תרגום. על ידי איגוד מבנה הכובע בקצה 5 'של mRNAs, eIF4F הוא נהיגה גיוס mRNA-ריבוזום הראשונית בתורו הגדלת יעילות תרגום mRNA של mRNAs eukaryotic מתורגם חלש2. eIF4F מתווך תרגום של mRNAs הקשורות לסרטן דווחה עבור מודלים סרטניים רבים מחסה הפעלה חריגה של RAS / MAPK או AKT / TOR מסלולים, מה שמרמז כי תאים סרטניים upregulate eIF4F כדי להגביר את הפעילות שלהם פרו-neoplastic. שיבוש של לולאה זו להאכיל קדימה על ידי עיכוב היווצרות מורכבת eIF4F היא ובכך אסטרטגיה טיפולית מבטיחה מאוד3,4.
קומפלקס eIF4F מורכב (i) eIF4E, יחידת המשנה מחייבת הכובע של eIF4F המקיימת אינטראקציה עם מבנה הכובע שנמצא ב- UTR 5 ' של mRNA, (ii) eIF4A, הליקאז RNA ו- (iii) eIF4G, חלבון הפיגום המקיים אינטראקציה הן עם eIF4A והן עם eIF4E ואשר בסופו של דבר מגייס את תת-יחידת ה- 40S ריבוזומלית5. eIF4G שיוך עם eIF4E הוא צעד הגבלת קצב להרכבה של קומפלקסים eIF4F פונקציונלי והוא מוסדר באופן שלילי על ידי חלבוני מחייב eIF4E (4EBPs, חברים 1, 2 ו 3))6. על ידי מתחרה עם eIF4G מחייב eIF4E באמצעות ממשק המורכב רצפי איגוד eIF4E קנוני ולאקנוני 7,8,9 (אזור פורש aa 604-646 על eIF4E אנושי), 4EBP מפחית את המאגר של eIF4E מעורב באופן פעיל בתרגום ומניעת היווצרות מורכבת eIF4F. יחסי הגומלין של אינטראקציות חלבון חלבון אלה מוסדר בעיקר על ידי היעד היונקים של rapamycin (mTOR)בתיווך זרחון של 4EBP. על גירויים מיטוגניים, mTOR ישירות phosphorylates בני משפחת החלבון 4E-BP, הפחתת הקשר שלהם עם eIF4E ובכך, קידום אינטראקציה eIF4E-eIF4G והיווצרות של קומפלקסים eIF4Fפונקציונלי 10.
למרות המאמץ הגדול בפיתוח תרכובות מיקוד שלמות מורכבת eIF4F, חוסר מבחנים מדידת שיבוש ישיר של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים הגביל את החיפוש אחר תרכובות פגע פעיל הסלולר. יישמנו מבחני לוציפראז המבוססים על אנלוגי coelenterazine (למשל, Nanoluc מבוסס משלים assay) כדי לפקח בזמן אמת את המצב של שלמות eIF4F באמצעות האינטראקציה eIF4E-eIF4G. מערכת החלבון המשלים של לוציפראז מורכבת מרסיס חלבון 18 kDa (SubA) ו-11 שברי פפטיד של חומצות אמינו (SubB) המותאמים למינימום שיוך עצמי ויציבות11. לאחר שהתבטא כמוצר היתוך עם eIF4E באורך מלא אנושי ותחום האינטראקציה eIF4E מ eiF4G1 האנושי (aa 604-646), שני חלבוני אינטראקציה יביא את שבר SubA ו SubB לקרבה של זה יגרום להיווצרות של לוציפראז פעיל כי, בנוכחות מצע חדיר לתא, בסופו של דבר יפיק אות זוהר בהיר(איור 1). דיווחנו במקום אחר על הבנייה והאימות של מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 16.
כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להחיל את מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 (זמינה על פי בקשה) כדי למדוד במדויק הפרעות eIF4E-eIF4G בתיווך 4EBP1 בתאים חיים. בנוסף, אנו מדגימים את התועלת שלה על ידי מדידת ההשפעות של מספר מעכבי mTOR כי הם כיום תחת ניסויים קליניים כמו תרופות טיפוליות לסרטןפוטנציאליים 12. בגלל השפעות מחוץ ליעד לעתים קרובות להסוות פעילות ספציפית לסמים, אנו מתארים גם כיצד צדדיות של eIF4E:eIF4G604-646 מדידת המערכת ניתן להרחיב עם מדידות אורתוגונליות של הכדאיות הסלולר לקחת את אלה בחשבון.

<table><tbody><tr><td>293FT תאים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופלייט תרבית תאים 96 באר, F-Bottom</td><td>greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>טיטר תאים Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>לא ניתן ליישום</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 פיפטות רב ערוציות 12 ערוצים 30-300 מ"ל</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 פיפטות רב ערוציות 12 ערוצים 5-50 מ"ל</td><td>תרמו פישר 4662050 מדעי</td><td>FUGENE6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 3000</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI Starter Systems</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I סרום מופחת מדיון, ללא פנול אדום</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>אפנדורף</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>&גמא;-אמינופניל-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור הרכבת eif4f על-ידי מדידת אינטראקציית eif4e-eif4g בתאים חיים

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

היווצרות של קומפלקס eIF4F הוכח להיות צומת במורד הזרם מפתח להתכנסות של מסלולי איתות כי לעתים קרובות לעבור הפעלה oncogenic בבני אדם. eIF4F הוא קומפלקס מחייב כובע מעורב בשלב גיוס mRNA-ריבוזום של ייזום תרגום. במודלים תאיים ופרה-קליניים רבים של סרטן, הסרת הפיקוח על eIF4F מובילה לתרגום מוגבר של תת-קבוצות mRNA ספציפיות המעורבות בהתפשטות סרטן ובהישרדות. eIF4F הוא קומפלקס הטרו-טרימרי שנבנה מתוך eIF4E subunit מחייב כובע, eIF4A הליקאז ואת eIF4G subunit פיגומים. קריטי להרכבה של קומפלקסים פעילים של eIF4F היא אינטראקציית החלבון-חלבון בין חלבוני eIF4E ו- eIF4G. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול למדידת הרכבה eIF4F המפקח על המצב של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים. eIF4e:4G תא מבוסס חלבון חלבון אינטראקציה assay גם מאפשר שינויים המושרה על ידי התרופה בשלמות מורכבת eIF4F להיות מוערך במדויק ואמין. אנו צופים כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת לאימות הפעילות של תרכובות זמינות מסחרית או להקרנה נוספת של תרכובות חדשניות או אופנים כי ביעילות לשבש היווצרות של קומפלקס eIF4F.

על מנת לאמת את הרגישות של מערכת השלמה eIF4E:eIF4G604-646, עיכוב בתיווך 4EBP1 של הרכבה מורכבת eIF4F הוערך באמצעות מעכבי mTOR. על ידי עיכוב mTORC1 זרחון תלוי קינאז של משפחת החלבון 4EBP, עיכוב mTOR משפר את הקשר 4EBP1 ל- eIF4E, ולכן, פירוק eIF4F15. נבדקו שני סוגים של מעכבים שונים מבחינה מכנית של mTOR kinases: rapalogs (למשל, Rapamycin) כי הם מעכבי allosteric של mTORC1 אבל לא mTORC2 ו ATP מעכבים מבוססי תחרותי (למשל, PP242) שנועדו במיוחד מעכב הן mTORC1 ו mTORC...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים שיאפשר למשתמש להעריך הפרעה הנגרמת על ידי סמים של דינמיקה מורכבת eIF4F בפורמטי סינון.

ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

הוויסות של איתות קומפלקס eIF4F קשור לתרגום מוגבר של תת-קבוצות mRNA המעורבות בהתפשטות סרטן ובהישרדות. כאן אנו מתארים מבחני אינטראקציה מבוססי חלבון-חלבון eIF4E-eIF4G המאפשרים לנו להעריך הפרעה הנגרמת על ידי תרופות בשלמות קומפלקס eIF4F בתאים חיים. יש עניין הולך וגובר בפיתוח שיטות המכוונות ביעילות לממשק חלבון-חלבון.חזינו כי מבחני ה-eIF4E-eIF4G PPI שלנו יסייעו בטיפוח אסטרטגיות אלה ובתיקונן. בדיקה זו תספק תוכנית ראשונית אופטימלית עבורה להוביל אופטימיזציה של מעכבי eIF4E-eIF4G. זריעת התא בצורה נכונה וביצוע טרנספקציה של העברה הם ההיבט המאתגר ביותר של מוצר זה מכיוון שהם עשויים לשקף ישירות על דיכוי מערכת הדיווח של PPI.לאחר הפשרה וספירת תאים, זרעו 6 צלחות באר עם תאי HEK 293, תוך שימוש ב -2 מיליליטר של מדיום גידול סטנדרטי לבאר. בבוקר היום השני, עבור כל טרנספקציה מהוקצעת, יש לדלל 9 מיקרוליטר של תמיסה מבוססת ליפוזום בשפופרת המכילה 125 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום. בזמן שהליפוזומים המדוללים דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, הכינו את תערובת המאסטר של ה-DNA על ידי דילול 3 מיקרוגרם מכל פלסמיד ב-125 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת עבור כל צינור טרנספקציה.הוסף 12 מיקרוליטר של ריאגנטים משפרים לתערובת מאסטר DNA 2, ואז ערבב היטב. הוסיפו מיד את התערובת הזו לכל שפופרת של ליפוזומים מדוללים ביחס של 1 ל-1. לאחר דגירה של קומפלקס שומנים DNA זה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, הוסף את הקומפלקס לכל באר מ -6 צלחות הבאר.דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. בבוקר היום השלישי יש לשטוף כל באר עם 1 מיליליטר PBS, ולהוסיף 0.3 מיליליטר טריפסין. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.לאחר הדגירה, נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר לכל באר של מדיום הסרום המופחת ללא פנול אדום. העבירו את התאים המועברים לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-290x G למשך 5 דקות.שאפו את המדיום, והשעו מחדש את כדור התא ב-2 מיליליטר של מדיום הסרום המופחת. זרע את תאי HEK 293 שעברו טרנספטציה בלוחות אטומים של 96 בארות, בצפיפות של 30,000 תאים לבאר ב-90 מיקרוליטר של מדיום. כדי להשיג 3 שכפולים טכניים עבור 3 תרכובות שונות באותו ניסוי, זרע 60 בארות.אל תכלול את הבארות בקצוות. מיד לאחר זריעת התאים המועברים, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת תרכובת DMSO של 10% לכל באר. הכן תמיסות מלאי מורכבות של 1 מילימולרית על ידי המסת כל תרכובת ריבית ב-100% DMSO.על מנת לקבל 3 שכפולים עבור כל טיטרציה של תרכובת, השתמש ב-8 מיקרוליטר מתמיסת מלאי התרכובת של 1 מילי-מולאר. בצע דילול סדרתי כפול של כל תמיסת תרכובת מלאי ב-8 בארות של צלחת PCR של 96 בארות על ידי פיפטינג של 4 מיקרוליטר מהמלאי של 1 מילי-מולרית ל-4 מיקרוליטר של 100% DMSO עבור כל נקודת טיטרציה. השלך את 4 המיקרוליטרים העודפים לאחר הנקודה האחרונה של הדילול הסדרתי הכפול.הוסף 36 מיקרוליטר של מים סטריליים בדרגת HPLC לכל צינור כדי להכין 40 מיקרוליטר של תמיסות דילול טוריות מורכבות פי 10 ב-10% DMSO. כמו כן, הכינו בקרה. 10% DMS רק פתרון מלאי במים סטריליים בדרגת HPLC.הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסות עבודה פי 10 לתאים בצלחת האטומה של 96 בארות על מנת להניב את הריכוז הסופי המיועד, עם ריכוז DMSO שיורי של 1% דגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 3 שעות. לאחר 3 שעות, התחל להכין את מגיב מצע הלוציפראז על ידי שילוב של נפח אחד של מצע עם 19 נפחים של מגיב הדילול. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף מיד 25 מיקרוליטר של מגיב המצע לכל באר של צלחת 96 הבאר עם התאים.נענע את הצלחת על שייקר מסלולי ב -350 סל"ד, למשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להעריך את הזוהר, הנח את הצלחת על קורא צלחות. הגדר את קורא המראה לזוהר ואת מסנן הפליטה ל-455.השתמש בגובה מדידה של 6.5 מילימטרים עם זמן מדידה של שנייה אחת. כדי להעריך את כדאיות התא, הוסף 33 מיקרוליטר של מגיב בדיקת כדאיות לכל באר. לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, הערך את הזוהר עם קורא הלוחות על ידי הגדרת קורא המראה לזוהר ומסנן הפליטה ל-600.השתמש בגובה מדידה של 6.5 מילימטרים ובזמן מדידה של שנייה אחת. השתמש בנתונים מקורא הלוחות כדי לקבוע את ערך ה-IC 50 של כל תרכובת, על ידי התאמת הנתונים למשוואת עקומת ההתאמה של 4 הפרמטרים המתוארת בכתב היד. תאי HEK 293 הועברו עם מערכת ההשלמה eIF4E-eIF4G, ולאחר מכן נסוגו וטופלו במעכבי mTOR.כאשר הזוהר הוערך 4 שעות לאחר הטיפול, PP242 ורפמיצין יצרו שניהם עיכוב תלוי מינון של האות. לא PP242 ולא רפמיצין גרמו לירידה משמעותית בכדאיות התא, מה שמצביע על כך שהירידה בזוהר במערכת ההשלמה eIF4E-eIF4G אינה נובעת ממוות תאים לא ספציפי, אלא מהפרעה באינטראקציה של EIF4E-4G. ניתוח כתמים מערביים, בעקבות ניסוי משיכה m7GTP, הראה כי שיבוש מתווך 4EBP1 של אינטראקציה אנדוגנית eIF4E-eIF4G נמצא בקורלציה עם אות הבדיקה הנמדד eIF4E-eIF4G.PP242 היה מעכב חזק יותר של זרחון כולל של 4EBP1 מאשר רפמיצין. שני המעכבים הראו השפעה על איתות mTOR כרגיל, כאשר רפמיצין פעיל יותר כנגד מצעי mTORC1, ו-PP242 מכוון הן ל-mTORC1 והן ל-mTORC2. ההיבט הקריטי ביותר של מוצר זה הוא זריעת התאים ביום העסקה, זריעה מחדש של התאים בתווך ללא פנול אדום, הערכת הזוהר של בדיקת ההשלמה eIF4E-eIF4G, והפעלת בדיקת הכדאיות על אותה צלחת.ניתן לבצע בדיקת כדאיות משנית כדי להעריך כל תרופת מטרה והשפעות ספציפיות ידועות.

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

בקרת סינתזת חלבונים מתרחשת בעיקר בשלב התחלת התרגום, ליקויים בו קשורים להפרעות מגוונות. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה שלהם, תיארנו כאן פרוטוקול המשתמש בביציות Xenopus laevis המעריך את התרגום של תעתיק mos בנוכחות מוטציה של גורם התחלת התרגום eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

כאן אנו מתארים הליך המאפשר ניתוח מפורט של ההפעלה התלויה בזרחון של גורם השעתוק IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-native-PAGE בשילוב עם אימונובלוט באמצעות נוגדנים מרובים של פוספו-ספציפיות.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאים אנושיים לניתוח גורמי התחלת תרגום הקושרים את מכסה ה-5' של mRNA בתנאי חמצן פיזיולוגיים. שיטה זו משתמשת באנלוגי כובע m7GTP המקושר לאגרוז ומתאימה לחקירת גורמי קשירת כובע ושותפיהם האינטראקטיביים.

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות הדינמיקה המרחבית-זמנית של הפעלת Akt וזרחון בתאי HepG2 חיים. הדמיית העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא כלי רב עוצמה המספק תובנות חשובות לגבי מסלולי איתות אינסולין וויסות מטבולי בתאי סרטן.

הדמיית העברת אנרגיית תהודה של תאים חיים של דינמיקת הפעלת Akt מווסתת מטבולית בתאי HepG2

חקור מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים לניטור הרכבת eIF4F והערכת השפעת תרופות על שלמות המרכב. שיטה זו תומכת בפיתוח מעכבי אינטראקציות חלבון-חלבון לחקר סרטן.

ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

גלה סרטונים נוספים