הפקת מיקרופלואידים של Lysolipid המכילים טמפרטורה רגישה ליפוזומים

Microfluidics היא טכניקה המתעוררים להכנת ליפוזומים בגודל חלקיקי לכוונון עם רבייה גדולה ומדרגיות. פרוטוקול זה מאפשר ייצור גבוה מתמשך באמצעות תפוקה של ליפוזומים רגישים לטמפרטורה נמוכה להעמסה במשותף עם תרופה כימותרפית כגון דוקסורוביצין וצבע פלואורסצנטי כגון ירוק אינדוקינין. הכנת תאים משתמשת בעיקר בגישה מלמעלה למטה כגון הידרציה של סרט השומנים והבלטה.

זה עדיין מאתגר להכין אצוות גדולות לשחזור עבור יישומים קליניים. יתרון מרכזי של microfluidics הוא היכולת להתמודד עם נפח נוזלי קטן עם שליטה גבוהה במרחב ובזמן תוך כדי פעולה באופן רציף ואוטומטי. הדגמת ההליך עם קלווין צ'ונג תהיה גואנגלונג מא ועמליה רואיז, החוקרים הפוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.

כדי להרכיב את משאבות המזרק, השתמש בכבל רשת המשאבה למשאבה כדי לחבר את יציאת המחשב של משאבת המזרק המשנית ליציאת הרשת של משאבת המזרק הראשית. השתמש במחשב כדי לשאוב כבל רשת כדי לחבר את יציאת המחשב של המשאבה הראשית ליציאה הטורית RS-232 של המחשב. כדי להרכיב את המכשיר microfluidic microfluidic staggard herringbone micromixer, להשתמש אגוז ferrule כדי לחבר צינורות לכל אחד מפרצים ושקעים של המכשיר.

לאחר מכן השתמש אגוז שני ferrule ו הרכבה האיחוד להמיר את הטרמינל של צינורות עבור שני מפרצים למזנון נקבה. כדי להגדיר את תוכנת בקרת המשאבה, השתמש בלחצן ההתקנה של משאבת המזרק כדי להקצות את הכתובת של משאבת המזרק הראשית ומשאבת המזרק המשנית ל- Ad:01 ו- Ad:02 בהתאמה, ולאחר מכן פתח את תוכנת בקרת המשאבה במחשב. שתי משאבות המזרק יש לזהות באופן אוטומטי ואחריו צליל צפצוף.

בחר קוטר 5 סמ"ק של HSW Norm-Ject שווה ל- 12.45 כדי להקצות את הקוטר ל- 12.45 מילימטרים. הגדר את הקצב ל-0.25 מיליליטר לדקה למשאבה אחת ו-0.75 מיליליטר לדקה למשאבה 2. הגדר את עוצמת הקול לכל ערך מעל חמישה מיליליטר ובחר את מצב העירוי עבור שתי המשאבות.

לאחר מכן לחץ על הגדר כדי לאשר את ההגדרות. כדי להכין תערובת שומנים LTSL10 או LTSL10 ICG, להשתמש אחד חמישה מיליליטר luer לנעול מזרק למשוך מיליליטר אחד של תערובת השומנים ועוד חמישה מיליליטר luer לנעול מזרק למשוך לפחות שלושה מיליליטר של פתרון אמוניום סולפט. החלק את אוגן החבית של המזרק למזרק של המשאבה כדי להתקין את המזרקים הטעונים על משאבות המזרק במצב זקוף ולחבר את אוגן הבוכנה של המזרק לבלוק הדחיפה של המשאבה ולעטוף את הקצה השני של סרט החימום ואת גשוש הטמפרטורה עם תרמוסטט סביב המזרק המכיל את תמיסת השומנים.

עוטפים את קצה סרט החימום למזרק המכיל את הפתרון הממימי, מחברים את המזרק המכיל את תערובת השומנים לתוך פתח האתנול, ומחברים את המזרק המכיל את תותבת אמוניום סולפט לתוך פתח המים. כוונן את מיקום הבוכנה כדי להסיר את כל בועות האוויר מהמזרקים לפי הצורך ולחבר ולנתק את סרט החימום במרווחים של 10 שניות עד שהטמפרטורה של המזרקים תגיע לכ-51 מעלות. כאשר תרמוסטט מראה טמפרטורה מתאימה, לחץ על הפעל את כל בתוכנת בקרת המשאבה כדי להפעיל את משאבות המזרק ולבדוק כי זרימת הנוזל הוא ללא בועות אוויר וכל דליפה.

לאסוף את דגימות ליפוזום לתוך בקבוקון ולהשהות או לעצור את עירוי כאשר או מזרק הוא כמעט ריק. Anneal את פתרונות ליפוזום שנאספו באמבט מים 60 מעלות צלזיוס במשך 1-1/2 שעות לפני העברת הפתרונות צינורות דיאליזה לדיאליזה נגד ליטר אחד של 240 מילימולר אמוניום גופרתי לפחות ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז לאחסן את ליפוזומים מטוהרים בארבע מעלות צלזיוס.

עבור טעינה מרחוק של ליפוזומים על ידי שיפוע pH transmembrane, לטעון 25 מיליליטר של HBS על החלק העליון של עמוד כרומטוגרפיה אי הכללה גודל ולאפשר לכל eluent לזרום דרך העמודה. טען מיליליטר אחד של ליפוזומים דיאליזיים לעמוד. כאשר כל פתרון השומנים עבר דרך העמודה, להוסיף 1.5 מיליליטר של HBS טרי לעמודה.

כאשר כל המאגר עבר דרך העמודה, להוסיף שלושה מיליליטר של HBS טרי לעמודה ולאסוף את eluent. לאחר מכן, להוסיף פתרון DOX ב 1:20 DOX:פוספוליפיד יחס טוחנת למיליליטר אחד של פתרון ליפוזום החלפת חיץ בבקבוקון Biju ולמקם את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 1-1/2 שעות. לאחר הטעינה, לטהר את ליפוזומים על ידי גודל הדרת כרומטוגרפיה כפי שהוכח רק.

לחימום בלייזר המושרה שחרור ההדק של תכולת ליפוזום, להגדיר את אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס. כאשר הטמפרטורה התייצבה, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של ליפוזומים טעונים DOX לכל באר של צלחת ברורה של 96 באר וממקמים את הצלחת באמבט המים כשהתחתית שקועה במים. לאחר מכן להגדיר את זרם מערכת הלייזר ל 2.27 אמפס ולהמקם את קולימטור מערכת לייזר חמישה סנטימטרים אנכית מעל פני השטח של צלחת 96 באר.

הפעל את הלייזר ולהשתמש בדיקה טמפרטורת סיבים אופטיים כדי לפקח על הטמפרטורה פעם בדקה. בחמש ו -10 דקות, שאפו 10 מיקרוליטרים של ליפוזומים טעונים DOX מכל באר של צלחת 96 באר ברורה ולהוסיף 190 microliters של HBS לשלוש בארות בודדות של צלחת שחורה 96 באר. כדי להעריך את שחרור התרופה המלאה, יש לערבב 10 מיקרוליטרים של ליפוזומים עם 170 מיקרוליטרים של HBS ו-20 מיקרוליטרים של 1%פתרון דטרגנט טריטון X-100 בשלוש בארות בודדות של צלחת 96 בארות שחורה.

לאחר מכן למדוד את עוצמת פלואורסצנטיות DOX על קורא צלחת. ייצור microfluidic של LTSL4 תוצאות פתרון צמיג דמוי ג'ל מאויר על ידי מספר גדול של בועות אוויר לכודים בעוד הכנת LTSL10 תוצאות היווצרות של נוזל לא צמיג ברור. מדידת פיזור אור דינמית של LTSL10 שהוכנה ב-51 מעלות צלזיוס מדגימה את הקוטר וההתפזרות הצפויים של Z-average המעידים על הצלחת הניסוי.

כאשר LTSL10 מוכן ב 20 מעלות צלזיוס, עם זאת, ליפוזומים גדולים ומפוזרים יותר מתקבלים וכתוצאה מכך מוצר תת אופטימלי. LTSLs שהוכנו על ידי השיטה המקובלת של הידרציה הסרט השומנים עם שקסטרוציישן להדגים יעילות אנקפסולציה DOX של 50-80% עם חישול, LTSL10 שהוכן על ידי microfluidics תוצאות עלייה משמעותית יעילות אנקפסולציה DOX למשמעות של 85% המציין את ההצלחה של טעינה מרחוק של DOX ואת הנוכחות של שיפוע pH transmembrane. פרופיל שחרור DOX של LTSL10 נקבע להיות רגיש לטמפרטורה.

LTSL10 יש מעבר פאזה רחב יחסית עם תחילת ב 41.6 מעלות צלזיוס כי פסגות ב 42.6 מעלות צלזיוס. היעילות של טעינת ICG תלויה בריכוז ICG הראשוני ובגודל ופיזור הדגימות. כמו כן, הקרנה ICG LTSL10 עם לייזר אינפרא אדום כמעט גורם חימום פוטותרמי מפעילה את שחרורו של DOX.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להבטיח זרימת נוזל יציבה כך ערבוב של נוזל ולכן היווצרות של ליפוזומים להישאר להתרבות. חישול Liposome ודיאליזה הם שני שלבים חשובים להבטחת ניסוח ליפוזום יציב עם יכולת טעינה גבוהה. בדיקות in vivo יכול להתבצע גם כדי להעריך LTSL10 ביו הפצה, שחרור סמים, ופעילות נגד סרטן.

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש לייצור microfluidic מוצלח של ליפוזומים ללא כולסטרול המכילים תרמוסמוסמוסים תרמוסנסטיביים עבור יישומי אספקת תרופות.