הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

מאמר זה מייצג תיאור מפורט של אופן השימוש במערך פוטו-דיודות ובצבעים רגישים-למתח כדי לרשום פוטנציאל פעולה ממספר גדול של נוירונים בו זמנית. בהשוואה להדמיית סידן של פעילות עצבית, שהיא עקיפה, הצבעים הרגישים למתח שאנו משתמשים בהם מתעדים פוטנציאל פעולה הדומים ישירות לרישומי אלקטרודות חדים, אך על פני נוירונים רבים בו זמנית. ניתן להתאים את זרימת העבודה של ההדמיה האופטית שלנו כדי להמחיש במהירות את פעילות הרשת עם נוירון יחיד ורזולוציה פוטנציאלית של פעולה בודדת במגוון מערכות חסרי חוליות ואפילו בעלי חוליות לא טרנסגניות.

בנוסף, הדגמת הנהלים בפרוטוקול שלנו תהיה אוון היל מהמעבדה שלי. התחל בהרדמה של בעל חיים Aplysia californica במשקל 40 גרם והצמדת הצד הגחוני כלפי מעלה בכלי דיסקציה מרופד בשעווה. בעזרת מספריים לדיסקציה, בצע חתך בקו האמצע של שניים עד שלושה סנטימטרים לאורך החלק הקדמי ביותר של כף הרגל והצמד את דשי כף הרגל משני צידי החתך כדי לחשוף חלק ממערכת העצבים המרכזית והמסה הבוקאלית.

השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לנתח בזהירות את המסה הבוקאלית, לחשוף את גרעיני המוח, ולנתק את העצבים המעצבנים את גוף החיה כדי לכרות את מערכת העצבים המרכזית, ולהשאיר אורך ארוך של העצב לגירוי. השתמש בסיכות זעירות כדי למקם את מערכת העצבים המרכזית בכלי מרופד באלסטומר מלא במי מלח ולחלחל את המנה במי מלח המועברים דרך מכשיר קירור פלטייר כדי לשמור על טמפרטורת ההכנה על 15 עד 16 מעלות צלזיוס. השתמש במלקחיים ובמספריים של מיקרו-דיסקציה כדי להסיר רקמת חיבור עודפת מהעצבים ולנתח חלק שטחי של הנדן על הגנגליון או הגרעינים להדמיה.

לאחר מכן טבלו את מערכת העצבים המרכזית הנקייה בתמיסה של 0.5% גלוטרלדהיד במי מלח למשך 20 שניות לפני החזרת מערכת העצבים המרכזית לכלי מרופד באלסטומר מלוח כדי לשטוף את עודפי הגלוטראלדהיד. להכנת תמיסת עבודה של צבע רגיש למתח, הוסף 500 מיקרוליטר מי מלח למנה מוצקה שהוכנה בעבר של RH 155 כדי להשיג ריכוז צבע סופי של 0.3 מיליגרם למיליליטר. והשתמש במיקרו-מתקן כף יד כדי להעמיס 200 מיקרוליטר של תמיסה לחתיכת צינור פוליאתילן בקוטר דומה לזה של הגנגליון שיש להכתים.

בעזרת מיקרומניפולטור, הנח בזהירות את קצה הצינור מעל גנגליון המטרה, והורד את הצינור עד שהוא יוצר אטימה צמודה מעל הגנגליון. סובב את כפתור המוליך של המיקרו-דיספנסר כל חמש דקות למשך שעה כדי לכפות יותר צבע על הגנגליון, ובדוק את הדגימה תוך 30 דקות כדי לאשר שמתרחש צביעה נאותה. לאחר הצביעה, תוך שמירה על האורות מעומעמים, הנח חומר חיץ מתאים משמאל ומימין למקום שבו התכשיר יונח בתא ההדמיה המכיל מי מלח, ולאחר מכן טבל את מערכת העצבים המרכזית בתא.

לחץ על חתיכת כיסוי בגודל מתאים מעל הרקמה ולחץ בחוזקה על הכיסוי כדי לשטח את הרקמה מבלי לפגוע בנוירונים. לאחר מכן הנח את תא ההדמיה מתחת למיקרוסקופ מנתח. אם מגרים עצב כדי לעורר תוכנית מוטורית פיקטיבית, יש להמיס בזהירות קטע של צינור פוליאתילן PE100 על להבה תוך משיכה עדינה של שני קצוות קטע הצינור ולחתוך את ההתחדדות המתקבלת בנקודה הרצויה.

לאחר מכן, חבר אורך של צינורות פולימרים גמישים בעלי קירות עבים לקצה האחורי של אלקטרודת יניקה מפוליאתילן. לאחר מכן השתמש בקטע פה כדי ליצור לחץ שלילי ולמשוך נפח קטן של מי מלח דרך הקצה המחודד של אלקטרודת היניקה. צייר את קצה העצב שיש לגרות לתוך האלקטרודה מתחת למיקרוסקופ ואשר כי במי המלח באלקטרודה חסרות בועות שעלולות להפריע להולכה החשמלית.

להדמיה של הגנגליון, העבר את החדר למתקן ההדמיה והתחל זלוף מי מלח דרך תא ההקלטה. הנח בדיקת טמפרטורה ליד התכשיר והגדר את הטמפרטורה בהתאם למין המצולם. הנח חוט כסף כלוריד אחד במורד אלקטרודת היניקה, וודא שהוא יוצר קשר עם מי המלח באלקטרודה והנח חוט כסף כלוריד כסף לתוך מי המלח באמבטיה ליד אלקטרודת היניקה.

הורד את עדשת הטבילה במים לתוך מי המלח וסגור את דיאפרגמת הבסיס. הרם או הורד את מעבה תת-השלב והתאם את המיקוד עד שקצוות הסרעפת יהיו במיקוד חד, ויוצרים תאורת קוהלר. התמקדו באזור ההכנה לתמונה ורכשו תמונה של הגנגליון המעניין עם המצלמה הדיגיטלית הפרפוקלית.

הגדר את מתג ההגברה של לוח הבקרה ל-1X ולחץ על לחצן עוצמת האור במנוחה כדי לבדוק את עוצמת האור הממוצעת במנוחה של הדיודות. כוונן את רמת המתח הנשלחת מממריץ לאספקת החשמל של מנורת LED והמשך לבדוק את רמת עוצמת האור הממוצעת במנוחה עד שהיא תהיה בטווח הרצוי. לאחר מכן הגדר את מתג הרווח של לוח הבקרה ל-100X עבור ההקלטה ובדוק שוב שהקפיץ או שולחן האוויר צפים.

כשהאורות עדיין מעומעמים, הגדר את משך הקובץ, הנתיב והשם בתוכנת ההדמיה ולחץ על קח נתונים כדי להשיג קבצים עד לקיבולת ה-RAM הזמין של המחשב. הקפד להישאר דומם במהלך ההקלטה מכיוון שרעידות קטנות עלולות להכניס חפצים גדולים לנתוני ההקלטה האופטית. כדי להציג את הנתונים מיד לאחר הרכישה, השתמש בפונקציה המונחת על גבי כדי להניח את הנתונים שנאספו על ידי כל 464 הדיודות על תמונת הגנגליון ולחץ על כל אחת מהדיודות המיוצגות בתוכנה כדי להרחיב את הנתונים המוקלטים במסך מעקב נפרד.

כדי להשיג יישור מדויק של הדיודות ביחס לתכשיר, הזן את גורמי ה-X, Y וההגדלה כפי שנקבעו על ידי בדיקת חור סיכה. כדי למקסם את נראות פוטנציאל הפעולה ולשפר את תפוקת הנוירונים למיון ספייק לאחר מכן, הטיל מסנן Butterworth מעבר פס עם חיתוכים של חמישה ו-100 הרץ כדי להסיר את הרעש בתדר הנמוך והגבוה כאחד. כדי לשמור את הנתונים האופטיים המסוננים כקובץ טקסט לניתוח עוקב, במסך הדף, בחר בתיבת המסנן TP.

ותחת לשונית הפלט, בחר שמור דף כ- ASCII. לאחר מכן הזן שם קובץ מתאים בתיבת הדו-שיח שמופיעה. מגע העור עם טורף כוכב הים שלו מפעיל את שחיית המילוט של טריטוניה דיומדיה המורכבת מסדרה קצבית של כיפופי גוף שלמים המניעים אותו למקום מבטחים.

באיור זה מוצגים נתונים גולמיים ומסוננים מ-20 דיודות המתעדות פעילות לפני, במהלך ואחרי גירוי של עצב הדוושה שלוש. מיד לאחר הרכישה, ניתן להציג טופוגרפית את האותות הנמדדים על ידי כל 464 הדיודות של מערך ההקלטה על גבי תמונה של ההכנה בתוכנת ההדמיה. בניתוח זה, מיון ספייק של עקבות הדיודות המסוננות עם ניתוח רכיבים עצמאי, או ICA, הניב 53 עקבות עצביים ייחודיים, 30 מהם מוצגים כאן.

גירוי זנב מרתיע מאוד ל-Aplysia californica מעורר גלים חוזרים ונשנים של תגובת בריחה קצבית דו-חלקית המורכבת מתקופת דהירה של מספר מחזורים של ריאות ראש ומשיכות זנב המניעות את החיה במהירות קדימה ותקופת זחילה שלאחר מכן. בניתוח מייצג זה, דקה אחת לתוך הקלטה אופטית רציפה של 20 דקות, עצב הדוושה תשע עורר כדי לעורר את רצף התוכנית המוטורית של דהירה-זחילה. ההתפלגות המרחבית הגאוסית ההסתברותית של האותות מכל 81 הנוירונים המתועדים מופו על הגנגליון.

הפחתת הממדים שהוחלה על ההקלטה המלאה גילתה כי שלבי הדהירה והזחילה של תוכנית המילוט תפסו אזורים נפרדים ויצרו מסלולים שונים במרחב הרכיבים העיקרי. כאשר מנסים פרוטוקול זה, שיקולים חשובים כוללים: אופטימיזציה של הצביעה, מזעור רעידות וניתוב מספיק אור דרך ההכנה ל-PDA תוך מזעור פוטו-הלבנה של הצבע. דוגמאות לניתוח לאחר הרכישה שחשף תובנות רשת ברמת האוכלוסייה כוללות זיהוי אנסמבל פונקציונלי באמצעות אשכולות קונצנזוס באלגוריתם למידה לא מפוקח והפחתת מימדים באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים.

השילוב של מערכת ההדמיה מבוססת מערך הפוטו-דיודות שלנו והשימוש שלנו בצבעים רגישים למתח סופג מאפשר ניטור של התפתחות הרשת הדינמית לאורך פרקי זמן ממושכים.