הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

מיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי תא לדוגמא מיועדים לתכולה גבוהה ולא לתפוקה גבוהה. לכן יש לבצע בדיקות הדמיה חיה ברצף ובכך פחות מושפעות מהשונות הסביבתית. מחזיק קורי העכביש שלנו מאפשר ערימה והדמיה בו זמנית של עוברים מרובים, מבטל את השונות הסביבתית ומגדיל את התפוקה.

הרכבת עוברים במחזיק קורי העכביש דורשת עדינות מסוימת. סרטון הסבר אידיאלי להמחשת רצף של מחוות ההתנהלות הקצרות הרבות. לכיול תא הדגימה המבוסס על מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור.

ראשית, יש להנזיל אגרוז aliquot במיקסר חימום בלוק יבש בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. הניחו לאגרוז המומס להתקרר ל-35 מעלות צלזיוס והעבירו 50 מיקרוליטר מהאגרוז לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר. מערבבים 0.5 מיקרוליטר של תמיסת מיקרוספרה פלואורסצנטית עם האגרוז במהירות של 1,400 סיבובים לדקה למשך דקה אחת, וממלאים את החור המחורר של מחזיק קורי העכביש ב-10 מיקרוליטר מתערובת תמיסת המיקרוספרה הפלואורסצנטית של אגרוז.

שאפו כמה שיותר אגרוז עד שיישאר רק סרט אגרוז דק ואפשרו לאגרוז להתמצק למשך 30 עד 60 שניות. מלאו את תא הדגימה במי ברז שעברו חיטוי, והכנסו לאט את מחזיק קורי העכביש לתא הדגימה. הזז את החור המחורר מול עדשת הזיהוי וסובב את המחזיק למצב של 45 מעלות ביחס לצירי התאורה והזיהוי.

מחזיק קורי העכביש לא אמור להיות גלוי בערוץ נורית השידור. עבור לערוץ הקרינה המתאים והתאם את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה, כך שהמיקרוספירות הפלואורסצנטיות יספקו אות מתאים. ציין נפח view המכסה לחלוטין את סרט האגרוז בכיוון רוחבי וחשב את הרזולוציה הצירית המקסימלית האפשרית עבור שילוב עדשות התאורה והזיהוי המתאים כדי להגדיר את מרווח Z.

לאחר מכן, הקלט ערימת Z בדיקה תלת מימדית של המיקרוספירות הפלואורסצנטיות והשווה את ההקרנות המקסימליות של X, Y ו-Z לתרשים הכיול. אם המיקרוספרות נראות מטושטשות, מטושטשות או מעוותות. התאם את מיקומי עדשות התאורה ו/או הזיהוי.

לצורך דה-כוריונציה של עוברים, הוסף שמונה מיליליטר של מי ברז שעברו חיטוי לבארות A1, A2, A3 ו-B3 של צלחת אחת-שש בארות בכל קו. לאחר מכן, הוסיפו שבעה מיליליטר של מי ברז שעברו חיטוי ומיליליטר אחד של תמיסת נתרן היפוכלוריט לבארות B1 ו-B2. מקם את הצלחת הראשונה מתחת למיקרוסקופ סטריאו והכנס את העובר הראשון המכיל מסננת תאים לבאר A1.

שטפו את העוברים בערבוב עדין במשך 30 עד 60 שניות, לפני העברת המסננת לבאר B1. מנערים את הצלחת במרץ למשך 30 שניות, לפני שמעבירים את המסננת לבאר A2. שטפו את העוברים במשך דקה אחת תחת תסיסה עדינה והעבירו את המסננת לבאר B2 לניעור נמרץ עד שרוב העוברים יעברו דה-כוריון לחלוטין.

לאחר מכן, העבירו את המסננת לבאר A3 למשך דקה אחת של שטיפה עדינה, לפני אחסון המסננת של עוברים שעברו דה-כוריון בבאר B3 עד לטיפול בעוברים של קווים אחרים כפי שהודגם. כדי להרכיב את העוברים על מחזיק קורי העכביש, יש להנזיל אליקוט נוסף של אגרוז כפי שהודגם. כאשר האגרוז התקרר, הנח את מחזיק קורי העכביש מתחת למיקרוסקופ הסטריאו והוסף 10 מיקרוליטר מהאגרוז על החור המחורר.

השתמש בקצה הפיפטה כדי לפזר את האגרוז על החור המחורר, לפני שאיבת כמה שיותר אגרוז עד שנשאר רק סרט אגרוז דק. כאשר האגרוז התמצק, השתמש במכחול כדי לקטוף ולהעביר בזהירות את העוברים לסרט האגרוז. סדרו אותם לאורך הציר הארוך של החור המחורר כשהצירים הקדמיים-אחוריים שלהם מיושרים עם הציר הארוך של החור המחורר.

כדי לייצב את העוברים, פיפטה בזהירות 1-2 מיקרוליטר של אגרוז לתוך הפער בין העוברים לסרט האגרוז. כאשר האגרוז התמצק, הכנס לאט את מחזיק קורי העכביש עם העוברים המותקנים לתא הדגימה המלא במאגר התמונה. כדי לצלם את העוברים, ודא שמחזיק קורי העכביש נמצא במצב של 45 מעלות ביחס לצירי התאורה והגילוי ובתעלת אור השידור, העבר את העובר למרכז שדה הראייה.

מחזיק קורי העכביש לא אמור להיות גלוי. לאחר מכן, הזיזו את העובר עם שלב התרגום המיקרו ב-Z עד שהמישור האמצעי של העובר חופף למישור המוקד וקווי המתאר נראים חדים. מבלי לעבור לערוץ הקרינה, הזז את העובר 250 מיקרון לשני הכיוונים כדי לציין את נפח הראייה.

אם נדרשת הדמיה לאורך מספר כיוונים, סובב את העובר כראוי, הבא את העובר למיקוד וציין את נפח הראייה כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, חזור על הליך זה עבור כל שאר העוברים המורכבים. לאחר שנפח הראייה צוין עבור כל העוברים, הגדר את ערוץ הקרינה ופרמטרי זמן-lapse והתחל בתהליך ההדמיה.

עבור בדיקות שנמשכות מספר ימים, שקול לכסות את פתח תא הדגימה לפחות חלקית כדי להפחית את האידוי. לאחר סיום בדיקת ההדמיה, הסר בזהירות את מחזיק קורי העכביש מתא הדגימה והשתמש במברשת קטנה כדי לנתק את העוברים מסרט האגרוז ולהניח את העוברים על שקופית מיקרוסקופ עם תווית מתאימה. הנח את המגלשה בצלחת שליפה לדגירה בתנאי הגידול הסטנדרטיים המתאימים.

ככל שנקודת זמן הבקיעה מתקרבת, בדוק את צלחות האחזור לעתים קרובות והעביר את כל הזחלים שבקעו לבארות בודדות של צלחת של 24 בארות. מלאו את הבארות באמצע הדרך במצע הגידול המתאים, ולאחר מכן דגרו על הזחלים בתנאי הגידול הסטנדרטיים המתאימים. כאשר הפרטים הנצפים מגיעים לבגרות, ספקו שותפים מתאימים להזדווגות ובדקו אם יש צאצאים לאחר מספר ימים.

בסרטון זה ניתן לראות את דינמיקת האותות הפלואורסצנטיים של שלושה עוברים שמקורם בקווי דרוזופילה טרנסגניים שונים לאורך תקופה של יום אחד בערך. דפוס פלואורסצנטי דומה היה צפוי מכיוון שכל הקווים ביטאו EGFP מקומי גרעיני תחת שליטתם של מקדמים פעילים ככל הנראה בכל מקום. עם זאת, תוצאות הדמיה חיה השוואתיות חשפו הבדלים זמניים מרחביים חזקים בדפוסי הביטוי שלא היו השפעות משניות עקב שונות הסביבה.

בניתוח זה של שלושה עוברי טריבוליום הנושאים את אותו טרנסגן מבוסס חזיר. תוצאות הדמיה חיה השוואתיות של תהליך סגירת חלון הסרוזה במהלך גסטרולציה מצביעות על כך שקו המשנה השני מספק אות כללי חזק להפליא משני קווי המשנה האחרים. כפי שנתונים אלה מצביעים, להקשר הגנומי עשויה להיות השפעה חזקה גם על רמת הביטוי של טרנסגנים בטריבוליום.

הגישה שלנו מתאימה היטב לניתוח פנוטיפים של נוקדאון ונוק-אאוט, מכיוון שהיא מאפשרת לדמות עוברי בקרה מסוג בר בו זמנית. הפרוטוקול שלנו יכול לשמש גם כדי להשוות את המורפוגנזה של שני מיני חרקים או יותר. וכך, לקבל תובנות עמוקות יותר על התפתחות ההתפתחות.