הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת המדגם בעת תכנון ניסויים באמצעות MALDI MSI כדי למקסם זיהוי מטבולי ומולקולרי בדגימות ביולוגיות.

ספקטרומטריית מסה של MALDI הדמיה היא התקדמות ייחודית בתחום המטבולומיקה המאפשרת לנו למדוד ולדמיין שפע ותפוצה יחסית של מטבוליטים, המעידים על אורגניזמים, מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. היתרון העיקרי של MALDI Imaging הוא היכולת שלה לזהות מטבוליטים ב-C2 ללא צורך בתיוג. כדי להדגים את ההליך, יש לנו את סמי סומה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה של ד"ר פטרישיה קסיטה.

יוקי צ'ן וקלי ויראסמי, סטודנטים חוקרים מהמעבדה שלי. לאחר הקטיף, הכניסו מיד את הרקמה לחנקן נוזלי, מקוררת, סירת נייר אלומיניום וקופסת פוליסטירן. סגור את מכסה קופסת הפוליסטירן כדי להקפיא את הרקמה למשך 2 עד 10 דקות, בהתאם לגודל הרקמה.

כאשר הרקמה קפואה מספיק, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הסירה ולהעביר את הרקמה המאובטחת בתוך נייר הכסף על קרח יבש לקריוסטט. לפני חיתוך הרקמה, יש להקפיד לא לנשום על המגלשות. השתמש בכפפות ובמד מתח המוגדר להתנגדות כדי לבדוק את המוליכות של המספר המתאים של שקופיות זכוכית מצופות תחמוצת פח אינדיום תואמות MALDI לניתוח.

לאחר התיוג, הניחו את השקופיות על מגבת נייר נקייה וקריוסטט נקי של 70% אתנול מוגדר למינוס 20 מעלות צלזיוס. הנח את דגימת הרקמה לתוך הקריוסטט והגדר את הטמפרטורה של תא הקריוסטט וראש הדגימה, בהתאם לסוג הרקמה. לאחר מתן אפשרות לרקמה להתייצב במשך 30 דקות, השתמש בתרכובת הטמעת רקמות קריו כדי להרכיב את הרקמה לצ'אק.

והנח ונעל להב נקי לתוך הבמה, התאם את מיקום הבמה ואת זווית הדגימה כדי להשיג את זווית החיתוך הרצויה. וחתך את הרקמה עד לגילוי אזור העניין. כאשר הושג האזור הרצוי, השג חלקים בעובי של 10 עד 12 מיקרון, בעזרת מברשת מקוררת מראש כדי לאסוף בזהירות, אך במהירות כל חלק על הצד המסומן של כל שקופית עם רכישתם.

הנח אצבע מתחת לשקופיות כדי לחמם את החלקים, כדי להבטיח הרכבה בטוחה לשקופית. החלקים יהפכו שקופים תוך 5 עד 10 שניות ויהפכו אטומים לאחר כ-30 עד 60 שניות. לאחר איסוף כל החלקים, הנח את השקופיות במחזיק השקופיות והמשיך על קרח יבש למסיר.

לחלופין, ניתן לשאת שקופיות בקופסת ואקום. הנח את השקופיות במשטח עם חומר ייבוש וייבש את השקופיות בוואקום למשך 45 עד 60 דקות. לאחר הייבוש, אם לא משתמשים מיד, הנח את השקופיות לתוך מוביל השקופיות ומלא את הטרנספורטר בחנקן.

אטום את המחזיק עם פרפילם והנח את המחזיק בשקית רוכסן. לאחר מכן הנח את שקית הרוכסן הראשונה בשקית רוכסן שנייה עם תווית המכילה חומר ייבוש למינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון עד שישה חודשים. לאחר התייבשות, השתמש בטוש כסף נקודתי מודגש כדי למקם סימני X על החללים הריקים של השקופיות מחוץ לחלקי הרקמה והשתמש בטוש נקודה עדינה שחור כדי להניח X שחור שני על גבי כל X.טען שקופית אחת לתוך מטרת המתכת של שקופית MALDI והנח כיסוי פלסטיק מעל המגלשה.

מתאר את מיקום הדגימה על מכסה הפלסטיק והנח את השקופית ואת יעד ה-MALDI על פני סורק שטוח. לאחר מכן הצג תצוגה מקדימה של השקופית ובחר את האזור הרצוי. סרוק את השקופית בקנה מידה אפור של 16 סיביות, ב-2,400 נקודות לאינץ' ושמור את התמונה לשימוש מאוחר יותר.

כדי להחיל מטריצה על המגלשות, הפעל יחידת מרסס מטריצה אוטומטית, וודא שהשסתום ממוקם בעומס, והפעל את תוכנת המרסס. בדוק שמאוורר הפליטה פועל כהלכה וודא בלשונית התקשורת שהמערכת מתקשרת כהלכה. הפעל את משאבת הממס ב-100 מיקרוליטר לדקה בלחץ אחורי של כ-500 פאונד לאינץ' מרובע.

והגדר את מיכל החנקן ל-30 פאונד לאינץ' רבוע כדי להתחיל בזרימת אוויר דחוס למרסס המטריצה. כוונן את ווסת הלחץ בחזית המרסס ל-10 פאונד לאינץ' מרובע, והגדר את טמפרטורת פיית המרסס כרצונך. עם השסתום ומיקום העומס, השתמש במזרק כדי לשטוף את הלולאה בשבעה מיליליטר של 70% מתנול לפני מילוי הלולאה בשישה מיליליטר למטריצה.

הנח שקופית זכוכית ריקה לתוך המחזיק והמרסס, הדבק את שני הקצוות כלפי מטה כדי למנוע תנועה ולבדוק שקצב הזרימה והטמפרטורה יציבים. לחץ על התחל כדי להגדיר את טמפרטורת הזרבובית וכדי להתאים את קצב זרימת המשאבה, כך שיתאים לשיטה שנבחרה. העבר את השסתום מעומס לריסוס ולחץ על המשך.

אפשר למערכת לפעול עד הסוף. בסיום התצהיר, העבר את השסתום מריסוס לעומס ולחץ על המשך. בחן את דפוס קידוד המטריצה תחת מיקרוסקופ.

אם נצפתה שכבה אחידה של גביש מטריצה עדינה, הפקידו את המטריצה על שקופיות הדגימה המתאימות כפי שהודגם זה עתה. לאחר שכל המגלשות טופלו, נקה את המערכת בהתאם להוראות היצרן כדי למנוע סתימה של פיית המרסס. כאן, מוצגות תמונות פלט מניתוח נתוני MALDI MS Imaging של ספקטרום פריקת מסה שנבחר מכל מרווח של 100 דלטון, המתארות בבירור את התועלת לזיהוי ספקטרום ממטבוליטים של מולקולות קטנות לשומנים בעלי משקל מולקולרי גבוה.

כל כביש מתאר מפות חום יונים מכבדות המכילות מידע מרחבי וספקטרלי של מין מטבוליט ספציפי על פני שלוש רקמות שנאספו בימים 1, 21 ו-60 לאחר הלידה. חוזקה של מתודולוגיית MALDI MSI היא היכולת להבחין בספציפיות של מינים מסוימים המזוהים על ידי יחס המסה למטען לאבני דרך התפתחותיות או מבנים אנטומיים ספציפיים. בניתוח זה, חלק מהמטבוליטים נצפו מועשרים ביילודים ביום הראשון לאחר הלידה או ביום שלאחר הלידה 60 בוגרים, או מפוזרים באופן אחיד על פני הגילאים שנבדקו.

מינים מולקולריים אחרים נצפו מועשרים במיוחד בחומר אפור, חומר לבן או נוזל עמוד השדרה המוחי והחדרים. נותחה גם ההתפלגות המרחבית של מטבוליטים מייצגים, כולל היפוקסנטין, חומצה גלוטמית, חומצה N-אצטיל אספרטית, חומצה ארכידונית ומספר שומנים. כדי לשמור על נאמנות הסטטה המטבולית, חיתוך דגימה מתאים, אחסון וחתך סיירו הם חיוניים למניעת שינויים מטבוליים מלאכותיים.

לאחר ביצוע ניסוי ה-MALDI שלך, ייתכן שתרצה לאמת את זהות המטבוליטים שמצאת. ניתן להשיג זאת על ידי מיצוי מירקו וכרומטוגרפיה נוזלית טנדם MS. MALDI MS Imaging מקל על חקירה מבוססת מטבולומיקה עם רזולוציה מרחבית ומעניק לחוקרים את ההזדמנות לברר נתונים מטבוליים במדיום כמותי וויזואלי. לאחרונה יש עניין רב בהשפעת התזונה על הפרעות ניווניות של מערכת העצבים, הקשר בין מיקרוביום המעי למוח.

ולכן הייתה חשיבות עצומה לחקר חילוף החומרים במדעי המוח, מהתפתחות נוירולוגית ועד לניוון עצבי. העובדה העיקרית של אינטראקציה בין מעיים למוח. ובהקשר זה הרעיון של מתקן ההדמיה של MALDI יכול באמת לספק טכנולוגיות יוצאות דופן כדי להמחיש את ההשפעה שעשויה להיות למניפולציה ספציפית על המוח.