Name: איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: למדו לזהות צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS) בתאי Neuro2a חיים ובליזטים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תכונות דיפוזיה של חלבונים הקשורים למחלות ניווניות כמו ALS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.K. נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענק בסיוע למחקר מדעי (C) (#18K06201), על ידי מענק בסיוע של קרן Nakatani לאופני נגד זיהומים חדשים בנגיף הקורונה, על ידי מענק ממשרד אוניברסיטת הוקאידו לפיתוח מנהיגי מחקר עתידיים (L-Station), ומענק בסיוע מקרן Hoansha. M. K. נתמך חלקית על ידי JSPS Grant-in-Aid למחקר מדעי על תחומים חדשניים "כימיה עבור מערכות ביולוגיות צפיפות רב-מולקולריות" (#20H04686), ומענק JSPS למחקר מדעי על תחומים חדשניים "פיזיקת מידע בענייני חיים" (#20H05522).

1. חומרים ריאגנטים
<ol><li>השתמש בפתרונות חינם pyrogenic ובינוני עבור תרבות התא (טבלה 1).</li>
	<li>הכינו פתרונות לניסוי הביוכימי באמצעות מים אולטרה-דקים והשתמשו בהם כ-DNase/RNase ללא תשלום.</li>
	<li>בחר FBS מתאים עבור תרבות התא עם תהליך בדיקה רב. מאחר שמגרש FBS שנבחר משתנה באופן קבוע, אין אפשרות לייצג כאן את הקטלוג ואת מספר הלוט עבור FBS.</li>
	<li>פלסמיד דנ"א<ol>
<li>הכן pmeGFP-N15 לביטוי מונומר eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 עבור ביטוי GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 עבור ביטוי SOD1-G85R-GFP; ו pCAGGS8 כמוביל. הערה: meGFP היא גרסה מונומרית הנושאת מוטציה A206K של GFP משופרת (eGFP). TDP25 הוא קטע מסוף C הקשור ל- ALS של TDP-43. SOD1-G85R הוא מוטציה הקשורה ל- ALS של SOD1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זן תאים<ol>
<li>השתמש בתאי נוירובלסטומה מורין Neuro2a. הערה: תאי Neuro2a יש יעילות transfection גבוהה וחלבונים אקסוגני אקספרס מאוד. עבור ביטוי TDP25, זני תאים בעלי יעילות ביטוי גבוהה כגון נוירו2a או HEK293 תאים נדרשים. בתאי HeLa, TDP25 לא היה מסוגל לבוא לידי ביטוי ביעילות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. תרבות התא ו transfection
<ol><li>הכן צלחת פלסטיק 100 מ"מ גדל Neuro2a תאים חצי משולבת במדיום צמיחה נורמלי. הערה: יש צורך לדגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 48-72 שעות לאחר הזריעה הקודמת עד חצי מפגש הוא הגיע.</li>
	<li>הסר את המדיום.</li>
	<li>הוסף 0.5 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA לתוך צלחת תרבות התא ולהדגיר אותם ב 37 °C (69 °F) במשך 1 דקות.</li>
	<li>מוסיפים 9.5 מ"ל של מדיום צמיחה נורמלי לתוך המנה ולהשעות את התאים המנותקים.</li>
	<li>באמצעות Trypan כחול כדי להכתים את התאים המתים, לספור את מספר התאים באמצעות מונה התא או באופן ידני. לאחר מכן לדלל את התאים במדיום תרבות (1.0 × 105/ מ"ל).</li>
	<li>מוסיפים 2 מ"ל של השעיית תאים לתבשיל פלסטיק 35 מ"מ לתזת תאים או צלחת בסיס זכוכית למדידת תא חי.</li>
	<li>דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך יום אחד.</li>
	<li>התחל את ההכנות הבאות 15 דקות לפני יום ההשתנות.</li>
	<li>הכינו שני צינורות 1.5 מ"ל והוסיפו 100 μL של Opti-MEM I לכל צינור.</li>
	<li>בצינור הראשון, מערבבים 1.0 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (פתרון A). בצינור השני, לערבב 2.5 μL של ליפופקטמין 2000 (פתרון B). הערה: כדי לשמור על יעילות transfection, לשמור על כמות ה-DNA הכוללת זהה. כדי להפחית את רמת הביטוי למדידת FCS בתאים חיים, כמות השבר של DNA פלסמיד עבור ביטוי חלבון צריך להקטין (למשל, 0.2 מיקרוגרם של pmeGFP-N1-SOD1-G85R ו 0.8 מיקרוגרם של תערובת pCAGGS). יתר על כן, לשמור על אותו יחס בין נפח Lipofectamine 2000 ואת כמות ה-DNA פלסמיד.</li>
	<li>מערבבים בעדינות את הפתרון A ו- B על ידי הוספת אחד לשני הצינורים, ולאחר מכן דגירה אותו במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (פתרון C).</li>
	<li>הוסף את הפתרון C למדיום התרבות; ולהדגיר את התאים במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F).</li>
</ol>3. תמוגת תאים והחלפה בינונית
<ol><li>בדוק את ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ שגרתי.</li>
	<li>מוציאים את המדיום בצלחת.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של PBS ב 25 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את המדיום. הסר את PBS.</li>
	<li>מניחים את המנה על צלחת אלומיניום על גבי הקרח כתוש. הערה: אנו משתמשים בצלחת אלומיניום בעובי 1 מ"מ שנחתכה בחנות כלים של יום ראשון או זמינה מסחרית כציוד מעבדה.</li>
	<li>הוסף 200 μL של מאגר תמוגה ב 4 מעלות צלזיוס. לנער את המנה במתינות, כך החיץ מופץ באופן שווה בתחתית המנה.</li>
	<li>לגרד את המנה באמצעות מגרד תאים ולשחזר את lysate עם פסולת תא לא פתורה בצינור חדש 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה הפתרון ב 20,400 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשחזר את supernatant בצינור חדש 1.5 מ"ל ולשמור אותו ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח. הערה: אין להקפיא את הליסאט.</li>
	<li>למדידות תאים חיים, החלף את המדידה לפני המדידה. בדוק את הקובץ המצורף לתא באמצעות מיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה. אשר ביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>4. כיול ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS)
<ol><li>הפעל את המערכת והפעל את תוכנת ההפעלה. הפעל את ארגון+ לייזר (458/477/488/514 ננומטר). לייצב את המערכת לפחות במשך 30 דקות.</li>
	<li>הגדר את הנתיב האופטי: מפצל קרן ראשי: HFT488; מראה דיכרית: NFT600; מסנן מחסום פלואורסצנטי: מסנן פס 505-540 (BP505-540); גלאי: פוטודיודה מפולת שלגים (APD)).</li>
	<li>הגדר את גודל חור הסיכה על-ידי הזנת הערך ישירות (66 מיקרומטר; יחידה אוורירית אחת).</li>
	<li>מוסיפים את הפתרון רודמין 6G (Rh6G) לתוך באר של תא זכוכית כיסוי על הבמה.</li>
	<li>הוסף את המים האולטרה-דקים לטבילה במטרה. אין להשתמש בשמן הטבילה.</li>
	<li>שים את התא על במת המיקרוסקופ. הזז את הבמה למיקום המתאים.</li>
	<li>התמקדו במשטח הזכוכית העליון על ידי מדידת האור המפוזר מפני הזכוכית. לאחר הנמכת העדשה האובייקטיבית לתחתית, סובב את ידית המיקוד בכיוון השעון כדי להתאים. הערה: בדוק את כיוון הפנייה של ידית המיקוד מכיוון שהיא הפוכה בין אלה שנעשו ביפן ובגרמניה.</li>
	<li>הרם את המוקד 200 מיקרומטר מעל משטח הזכוכית העליונה כדי להתבונן בחלק הפנימי של הפתרון.</li>
	<li>לחץ על קצב הספירה ונטר את קצב ספירת הפוטונין.</li>
	<li>הגדל בהדרגה את ערך המסננים הניתנים לכוונון acousto-optic (AOTF) (למשל, שידור לייזר עירור) כך שערך קצב הספירה יהיה יותר מ- 10 kHz.</li>
	<li>לחצו על 'התאמת חור סיכה' ופתחו את אשף התאמת חור הסיכה. מצא את מיקום חור הסיכה עם המספר הגבוה ביותר (שיא) של פוטונים הן בציר x והן בציר y.</li>
	<li>סובב את טבעת התיקון של העדשה האובייקטיבית כך שהערך ספירות לכל מולקולה (CPM) הוא הגבוה ביותר. הערה: מכיוון עובי זכוכית הכיסוי של התא שצוין כאן הוא 0.12-0.17 מ"מ, טבעת התיקון היא סביב המינימום שלה או רק כמה סיבובים ממנו, שבו עלות לאלף חשיפות היא המקסימום שלה.</li>
	<li>הקטן את ערך ה- AOTF בהדרגה כך שערך עלות לאלף חשיפות יהפוך ל- 2-3 קילו-הרץ.</li>
	<li>לרכוש את פונקציית התיקון האוטומטי (ACF) של Rh6G עבור 90 s.</li>
	<li>לאחר השלמת המדידה, לחץ על התאם כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה.</li>
	<li>בחר מודל לפיזור תלת-ממדי (תלת-ממדי) של רכיב אחד עם מצב שלישייה. הערה: Rh6G הוא מונודיספרס ורכיב אחד מפוזר עם מצב שלישייה.</li>
	<li>הגדר את שעת ההתחלה המתאימה על-ידי הזזת הקו האדום. לחץ על התאם הכל ובדוק את סטיית ההתאמה. לאחר ביצוע התאמת העקומה, ודא שזמן הדיפוזיה (DT) ות פרמטר המבנה (SP) נמצאים בערך בטווח של 20-30 מיקרומטר ו- 4-8, בהתאמה.</li>
	<li>זכור את ערך הפרמטר המבני. השתמש בערך SP לניתוח התאמת עקומה של כל מסמכי ה- ACF הנמדדים באותו יום, באותם תנאים אופטיים, ושימוש באותו סוג של צלחת בסיס זכוכית או ערכת זכוכית כיסוי קאמרית על שלב המיקרוסקופ.</li>
</ol>5. מדידת FCS ב- lysate התא
<ol><li>הכן את lysates התא (ראה לעיל).</li>
	<li>מניחים את lysate על תא זכוכית כיסוי. מניחים מכסה כדי למנוע ייבוש ואת מכסה הבמה להצללה קלה.</li>
	<li>הגדר את תנאי הרכישה, עוצמת הלייזר, זמן המדידה והחזרות.</li>
	<li>לחץ על קצב ספירה והתאם את ערך ה- AOTF של הלייזר כך שערך ה- CPM יהפוך ליותר מ- 1 kHz.</li>
	<li>בצע מדידת ניסיון במשך דקה. בדוק אם ACF המחושב מראה משרעת חיובית וריקבון חלק.</li>
	<li>בצע את המדידה העיקרית במשך 5 דקות. הערה: זמן המדידה הכולל גדל בהדרגה עד שצורת ה- ACF אינה משתנה גם אם זמן המדידה מוגדל.</li>
	<li>לחץ על התאם כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה.</li>
	<li>בחרו דגם לפיזור תלת-ממדי דו-רכיבי עם מצב שלישייה. זכור להזין את ערך SP ולשנות את ההגדרה שלו ל"קבוע" ולא "חופשי" לפני שתלחץ על התאם הכל.</li>
	<li>יצא את הטבלה המותאמת כקובץ טקסט המופרד באמצעות טאבים.</li>
	<li>במידת הצורך, יצא את רשומת קצב ACF ו- Count כקובץ טקסט המופרד באמצעות טאבים.</li>
</ol>6. מדידת FCS בתאים חיים
<ol><li>החלף את המדיום במדידה טרייה לפני המדידה.</li>
	<li>השתמש באינקובטור שלב חום. הניחו את צלחת תרבות התאים על במת המיקרוסקופ.</li>
	<li>אשר את המיקוד והמיקום באמצעות המיקרופה הקונפוקלית. בחר את תא המדידה. הגדל והתאם את מיקום התא. השג תמונות פלואורסצנטיות של תא מבטא GFP באמצעות מצב מהירות סריקה איטית.</li>
	<li>בחר מיקום מדידת FCS באמצעות מיקום בסעיף "FCS".</li>
	<li>בחרו לפחות נקודת מדידה אחת של FCS בעזרת הכוונת (איור 1).</li>
	<li>למדוד את ACF במשך 1 דקות. הערה: מכיוון שחלבונים פלואורסצנטיים נוטים להיות פוטובלצ'ים בתאים חיים עקב תנועה איטית בהשוואה לפתרון, זמן המדידה צריך להיות מינימלי. בדרך כלל קשה להשיג ACF בתא בצורה חלקה כמו מדידות פתרון כי מדידה ממושכת תוביל photobleaching של חלבונים פלואורסצנטיים.</li>
	<li>לחץ על התאם כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה באמצעות מודל לפיזור תלת-ממדי של שני רכיבים עם מצב שלישייה. הערה: עבור מדידות תאים חיים, מודל עבור דיפוזיה תלת-ממדית של שני רכיבים עם מצב שלישייה יהיה טוב יותר מכיוון שקשה מבחינה אמפירית להקטין את הערך הריבועי של הצ'י עם מודל דיפוזיה תלת-ממדי של רכיב אחד בשל קיומם של רכיבים ניידים שונים בתא החי. אבל אפילו באמצעות מודל עבור דיפוזיה תלת-ממדית של שלושה רכיבים, רכיבי הדיפוזיה בדרך כלל אינם מופרדים בהשוואה לשימוש במודל עבור שני רכיבים.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).</li>
<li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li>
<li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li>
<li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230(2016).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li>
<li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li>
<li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).</li>
<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

למחברים אלה אין ניגודי אינטרסים.

לגבי כיול המערכת לפני המדידות, יש להשתמש באותן כלי זכוכית המשמשים למדידת הדגימה (למשל, 8 הבארות מכסות תא זכוכית עבור ליזלת תאים ותבשיל בסיס זכוכית 35 מ"מ לתאים חיים). בגלל ספיחה של Rh6G על הזכוכית, הריכוז האפקטיבי שלה עשוי לפעמים להקטין. אם כן, יש להשתמש בתמיסת Rh6G מרוכזת מאוד כגון μM 1 רק להתאמת חור הסיכה. יש להימנע משיעורי ספירת פוטון גבוהים במיוחד כדי להגן על הגלאי (למשל, יותר מ-1,000 קילו-הרץ). יתר על כן, הפתרון המרוכז אינו מתאים לרכישת פונקציית תיקון אוטומטי (לשמור על פחות מ 100 kHz). הכיול של מיקום חור סיכה חשוב. ...

צבירות חלבון המערבות הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, וכן הלאה1 ידועים להיות רעילים יפריע הומאוסטזיס חלבון (פרוטוסטזיס) בתאים ובאיברים, זה יכול אז להוביל להזדקנות2. אישור צבירת החלבון צפוי כאסטרטגיה טיפולית; עם זאת, כימיקלים המונעים היווצרות צבירת חלבונים ואגרגטים של חלבונים משפילים (למשל, מולקולות קטנות או תרופות) עדיין לא הוקמו. יתר על כן, איך צבירת חלבון מפעיל רעילות נשאר חמקמק. לכן, כדי לקדם פרויקטים מחקריים הקשורים לצבירת חלבונים, חשוב להציג נהלי תפוקה גבוהים פשוט כדי לזהות צבירת חלבונים. גילוי צבירת חלבונים באמצעות נוגדנים המזהים את ההתאמה של צבירת חלבונים וצבירה ספציפית לצבירה צבע פלואורסצנטי כבר בשימוש נרחב3. עם זאת, קשה לזהות את הצבירה, במיוחד בתאים חיים באמצעות הליכים קלאסיים כאלה. 
העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) היא הליך לגילוי צבירת חלבונים ושינוי מבני. עם זאת, FRET אינו מסוגל לנתח את דינמיקת החלבון (למשל, דיפוזיה ואוליגומריזציה של חלבון בתאים חיים)3. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט לזיהוי צבירת חלבונים בתמיסה (למשל, ליזלת תאים) ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות (FCS), המודדת את מאפיין הדיפוזיה והבהירות של מולקולות פלואורסצנטיות עם רגישות למולקולותבודדות 4. FCS היא שיטת ספירת פוטון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר (LSM). באמצעות גלאי פוטון רגיש מאוד וחישוב של פונקציית התיקון האוטומטי (ACF) של זמן ההגעה של פוטון, המעבר בזמן ובבהירות של מולקולות הפלואורסצנט בנפח הגילוי נמדד. הדיפוזיה מאטה עם עלייה במשקל מולקולרי; לכן, אינטראקציה בין מולקולרית ניתן להעריך באמצעות FCS. אפילו יותר בעוצמה, עלייה בבהירות של מולקולת הפלואורסצנט מצביעה על הומו-אוליגומריזציה של המולקולות. לכן, FCS הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות צבירת חלבון כזה.

<table><tbody><tr><td>0.25% (w/v) טריפסין-1 ממול/ליטר EDTA&middot; תמיסת 4Na עם פנול אדום (טריפסין-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פלסטיק 100 מ"מ</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>צלחת בסיס זכוכית 35 מ"מ</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>למדידת תאים חיים</td></tr><tr><td>צלחות פלסטיק 35 מ"מ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>צלחת אלומיניום</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>מגרד תאים אובייקטיבי</td></tr><tr><td></td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>קרום מסנן אצטט תאית (0.22 מ"מ)</td> <td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>תא זכוכית כיסוי 8 בארות</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>למדידת תמיסה</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>בינוני בסיסי</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>biosera</td><td></td><td>נדרשת בדיקת אצווה</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>FCS מערכת</td></tr><tr><td>נוירובלסטומה עכברית תאי Neuro2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>קו תאים</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>DNA פלסמיד לנשא הטרנספקציה</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (ופעמים; 100</td>) <td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>DNA פלסמיד עבור TDP25 מתויג עם מונומרי eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>DNA פלסמיד לביטוי מונומר eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>DNA פלסמיד עבור מוטציה G85R הקשורה ל-ALS של SOD1 מתויג עם</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td> eGFP מונומרי <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב אמיוטרופית (ALS), מחלת אלצהיימר (לספירה), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), וכן הלאה. כדי לזהות ולנתח אוליגומרים או אגרגטים של חלבונים מסיסים או מפוזרים, נעשה שימוש בספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS), שיכולה לזהות את מהירות הדיפוזיה והבהירות של חלקיק יחיד עם רגישות למולקולות בודדות. עם זאת, ההליך הנכון והידע לגילוי צבירת חלבונים לא שותפו באופן נרחב. כאן, אנו מראים הליך סטנדרטי של מדידת FCS עבור מאפייני דיפוזיה של חלבונים נוטים לצבירה בתאים ליזאטים חיים: ALS הקשורים 25 kDa קרבוקסיל-מסוף שבר של TAR DNA / RNA מחייב חלבון 43 kDa (TDP25) ו סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). התוצאות הייצוגיות מראות כי חלק אגרגטים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מתויג TDP25 נכלל מעט בחלק מסיס של neuroblastoma מורין Neuro2a תא lysate. יתר על כן, GFP מתויג SOD1 נושאת מוטציה הקשורה ALS מראה דיפוזיה איטית יותר בתאים חיים. בהתאם לכך, אנו מציגים כאן את ההליך לגילוי צבירת החלבון באמצעות נכס הדיפוזיה שלו באמצעות FCS.

ביצענו מדידת FCS של GFP-TDP25 בתא ליסקאט ו- SOD1-G85R-GFP בתאים חיים. בשני המקרים, משרעת חיובית ACFs חלקה הצליחו לרכוש. הראינו כי חלק GFP-TDP25 לידי ביטוי בתאי Neuro2a התאושש בשבר מסיס תחת התנאי המצוין6. בחלק המסיס של lysate התא, מולקולות פלואורסצנטיות בהירות מאוד זוהו ברשומה קצב ספירת פוטון באמצעות FCS (איור 2A, למעלה, חץ). כזה "קוצים (המכונה גם פרץ)" לא נצפו מונומרים GFP ותמיסת צבע פלואורסצנטי כימי מונודיספרס, מה שמרמז כי הקוצים מצביעים על חלבונים אוליגומריים<sup cl...

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

העיקרון הטוב ביותר של ספקטרוסקופיית מתאם הפלואורסצנטיות, FCS, הומצא לראשונה בשנות השבעים. בשנות התשעים, שיפורים חשובים ורבים עבור FCS הוקמה על ידי שילוב עם מיקרוסקופיה של מנגנון confocal. מאז, FCS שימש עבור יישומים רבים ריפוי כימיים ווירוסים, כגון אינטראקציות מולקולריות וניתוח צבירת חלבון.צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות. בהירות פלואורסצנטיות הם חלקיקים בודדים בפעולה בגדלים מולקולריים המוסברים על ידי תכונות דיפוזיה. זה מאוד חשוב במדידת צבירות חלבון כי זה יכול לקבוע מחזורי חיים מוקרנים של מולקולות, אלא גם להבחין בין הומו או פולמריזציה הטרו.כאן, אנו מציגים הליך למדידת דיפוזיה של טרשת לרוחב amyotrophic הקשורים חלבון טופס מצטבר באמצעות FCS ב lysates התא ותאים חיים. הכן צלחת פלסטיק 100 מילימטר גדל Neuro2a תא יושב בנוחות במדיום הצמיחה הרגילה. אשר את מפגש התאים.הסר את המדיום. מוסיפים 3.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין-אדטה לצלחת המחסנית השלישית ומדגירים אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. מוסיפים 9.5 מיליליטר בינוני צמיחה נורמלי לתוך המנה להשעות אותם.השעיית התא מעורבבת עם כחול טריפאן כדי להכתים את התאים המתים. הוסף השעיה לשקופית ספירת התאים. ספור את מספר התאים המשתמשים במונה התאים, או באופן ידני.בדוק את מספר התא החי ואת הכדאיות שלהם. לדלל את התא במדיום שנספר ב 1.0 פעמים 10 לעוצמה של 5 למיליליטר. הוסף שני מיליליטרים של השעיית תאים לתוך צלחת פלסטיק 35 מילימטר עבור תמוגה תא או צלחת שטח צמיחה למדידת תא חי.דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס ליום אחד. למחרת, להכין את התערובת של DNA פלסמיד ואת reagents transfection. מוסיפים את תערובת ההעתקה למדיום הנספר בתאים ומדגירה את התאים במשך 24 שעות.יום אחד לאחר מכן. בדוק את ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ שגרתי. אתה יכול לראות את גופי המרכיב TDP25 בהיר מאוד בתאים.תמוגה של תאים צריכה להתבצע בספסל הביוכימי. מוציאים את המדיום בצלחת. מוסיפים שני מיליליטר של PBS ב 25 מעלות צלזיוס לשטוף כמדיום.הסר את PBS. מניחים את המנה על צלחת אלומיניום על החלק העליון של הקרח כתוש. מיד, מוסיפים את חיץ תמוגה 200 microliter לתוך המנה.מגרדים את המנה באמצעות מגרד תאים. לשחזר את lysate עם פסולת תא לא פתורה בצינור חדש 1.5 מילימטר. צנטריפוגה lysate בארבע מעלות צלזיוס.למדידות תאים חיים, החליפו את המדיום במדידה טרייה לפני המדידה. בדוק את הקובץ המצורף לתא באמצעות מיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה. כמו כן, בדוק את הביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.השתמש במערכת FCS משולבת מיקרוסקופ קונפוקלית. הפעל את לייזר 488 ננומטר. לייצב את המערכת, לפחות, במשך 30 דקות.הגדר את הנתיב האופטי. השתמש לייזר 488 ננומטר עבור האור המיידי. השתמש מפצל קרן מתאים מטרים dichroic.וגם, נתיכים פלואורסצנטיים. בדרך כלל, נשתמש בתאי כיסוי לכיול ומדידות פתרון. בזהירות, קח את תא הכיסוי.מניחים את משטח הזכוכית על נייר ההקרנה של העדשה. יוצקים את כיול FCS. הוסף את פתרון רודמין 6G גם כן.מוסיפים את המים האולטרה-דקים על המטרה. אין להשתמש בשמן. שים את התא על במת המיקרוסקופ.הזז את הבמה למיקום המתאים. צרו את התאמת חור הסיכה ופתחו את אשף התאמת חור הסיכה. נטר את קצב ספירת הפוטונין כתנועה גסה של חור הסיכה עבור כיוון ה- x.התנוחה הבהירה ביותר נקבעה בצדק. לאחר מכן, נטר את קצב ספירת הפוטונין כתנועה עדינה. המיקום הבהיר ביותר נקבע בהצלחה זהו מיקום חור הסיכה עבור x-כיוון.באותו אופן, לחפש את המיקום הבהיר ביותר של חור סיכה עבור y-כיוון. המיקום הבהיר ביותר עבור y-כיוון נקבע גם בהצלחה. מורכבות x ו y המיקום של חור סיכה.עדיף להתאים את מיקום חור הסיכה לפני המדידה של כל יום. כאשר הנתיב החי משתנה, יש להתאים שוב את מיקום חור הסיכה. צור קצב ספירה ונטר את קצב ספירת הטלפונים.עבור למצב הניטור של עלות לאלף חשיפות. ספור את טבעת התיקון של האובייקט שהרצת כך שערך עלות לאלף חשיפות הוא הגבוה ביותר. סגור את חלון שער הספירה.התחל עם מדידת פתרון רודמין 6G. לאחר השלמת המדידה, לחץ על ההתאמה כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה. בחר מודל להתאמת פונקציית המתאם הישנה.עבור רודמין 6G, בחר את המודל עבור 1-רכיב, פיזור תלת מימדי עם מצב שלישייה. הגדר את שעת ההתחלה המתאימה על-ידי הזזת הקו האדום. לחץ על התאם הכל, כדי להתחיל בחישוב ההתאמה.בדוק את סטיית ההתאמה. ודא כי הצדדים מתפרסמים ושליליים, סביב אפס. בדוק את הערכים המותאמים.ודא שזמן הדיפוזיה הוא בערך בטווח של 20-30 מיקרו-שניות. יתר על כן, הפרמטר המבני הוא מארבע עד שמונה. פתחו את החלונית fit ובחרו דגם למדידה.הזינו את אותו ערך פרמטר מבני בדגם לדגימה בחלונית 'התאמה'. ודא שיש להגדיר את הסוג כקבוע. מדידת GFP-TDP25 ב-lysate התא.מניחים את הליסט בתא הכיסוי. מניחים את המכסה כדי למנוע ייבוש של lysate. מניחים את מכסה הבמה להצללה קלה.בלוח הרכישה, הגדר את עוצמת הלייזר, את זמן המדידה ואת החזרות שלו. התחל את הרכישה. יתד נצפתה.ספייק נצפה שוב. היתד מצביע על מולקולות בהירות שעברו בגוף הגילוי. קוצים מצביעים על אוליגומרים או אגרגטים מסיסים.צור התאמה לביצוע ניתוח התאמת עקומה. בחר את המודל עבור דיפוזיה תלת-ממדית דו-רכיבית עם מצב שלישייה. הגדר את שעת ההתחלה המתאימה.לחץ על התאם הכל. בדוק את הערכים המותאמים. SOD1-G85R מתויג במדידת GFP בתא חי.שלא כמו מדידת פתרון, אני ממליץ להשתמש באינקובטור שלב החום. הניחו את צלחת פולחן התאים על במת המיקרוסקופ. אשר את המוקד ואת המיקום באמצעות העין.בחר תא מדידה. הגדלה והתאמת מיקום התא באמצעות מצב סריקה מהיר. השג את תמונת התמונה של התאים באמצעות מצב מהירות הסריקה האיטית.בחרו מיקום למדידת FCS בעזרת הכלי מיקום. הכוונת מציינת את מיקום המדידה. התחל את המדידה.הירידה הקלה של רשומת קצב ספירת הפוטונין מרמזת על פוטובלצ'ינג של GFP. בצע את התאמת העקומה. מוצגות תוצאות מייצגות של GFP-TDP25 ב- lysate של התא.הגרף העליון רישום של שיעור ספירת פוטון. איפה שיש חצים הוא ספייק, מציע אוליגומרים מסיסים ואגרגטים. הגרף האמצעי מייצג את פונקציית המתאם הישנה.הקו האפור מציג את פונקציית המתאם הנמוכה והוותיקת. קו המגנטה מציג את הפונקציה המותאמת. הקווים המנוקדים מציינים את שעות ההתחלה והסיום להתאמה.הטבלה התחתונה מציגה את הערך המותאם. לאחר מכן, מוצגות תוצאות מייצגות של SOD1-G85R-GFP בתא חי. הגרף העליון מייצג תיעוד של שיעור ספירת הפוטונין שלנו.הירידה ההדרגתית של שיעור ספירת הפוטונין המתועד נצפתה, מה שמרמז על פוטובלאצ'ינג של צמיחת GFP למדידות שונות. הסיבה לכך היא מהירות הדיפוזיה האיטית בתאים חיים. הגרף האמצעי מייצג את פונקציית המתאם הישנה של SOD1.הקו האפור מציג את פונקציית המתאם הנמוכה והוותיקת. קו המגנטה מציג את הפונקציה המותאמת. הקווים המנוקדים מציינים את שעות ההתחלה והסיום בהתאמה.הטבלה התחתונה מציגה ערכים מותאמים. כאן אנו מראים לך הליך זה כדי למדוד דיפוזיה מכל תא המשויך TDP-25 ב lysate התא וכל מוטציה של SOD1 בתאים חיים באמצעות FCS. אוליגומרים מסיסים וצבירה ב lysate התא ניתן לראות לעתים קרובות כמו קוצים או התפרצויות.מצד שני, בתאים חיים, קוצים כאלה נצפו לעתים רחוקות, למעט מבנים חיים ברורים. מינים מתפזרים לאט של מוטציה SOD1 של להוסיף בהירות ממוצעת עבור חלקיקים בודדים כגון הומופולימריזציה SOD1 בפנים עבורנו. ההליך המוצג כאן הוא פשוט וכדאי.FCS אינו מכיל קרינה;מצב רדום ישירות. זו רק האמפתיה הדמיון שלך ושלנו.

detection-protein-aggregation-using-fluorescence-correlation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת צבירת חלבונים מבוססת תאים באמצעות מעכבי פרוטאזום, אשר חוסמים את פעילות הפרוטאזום, ומונעים מחלבונים מוטנטיים שאינם מקופלים כהלכה, מאוחים לתווית פלואורסצנטית, לעבור פירוק פרוטאזומלי תלוי יוביקוויטין, המוביל להצטברותם בתוך הציטופלסמה של התא. לאחר מכן מדמיינים את צברי החלבונים ומכמתים אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

סרטון זה מדגים את הטכניקה של ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות (FFS) לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים. חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי בדגימה עוברים דימריזציה באמצעות סוכן כאשר חוקרים אוליגומריזציה של חלבונים באמצעות FFS. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, כאשר החלבונים נעים פנימה והחוצה מנפח התצפית הקטן, ניתוח התנודות בבהירות המולקולות הפלואורסצנטיות מבוצע כדי לקבוע את המצב האוליגומרי של החלבונים.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת האנאיזוטרופיה הפלואורסצנטית כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבון תסמונת שוואכמן-יהלום (SBDS) המתויג פלואורופור לבין גורם התארכות דמוי 1 GTPase (EFL1). על דגירה של חלבוני SBDS עם ריכוזים הולכים וגדלים של EFL1, נצפתה עלייה מתמדת באנאיזוטרופיה, מה שמצביע על אינטראקציה מוצלחת בין שני החלבונים.

זיהוי מבוסס אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית של אינטראקציות חלבון-חלבון

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל,...

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

נוגדנים לאגד היעד הקולטנים על פני השטח של התא יכול להתייעץ קונפורמציה והשינויים קיבוץ באשכולות. שינויים דינמיים אלה יש השלכות על אפיון פיתוח תרופות בתאי המטרה. פרוטוקול זה מנצל מיקרוסקופיה קונפוקלית וספקטרוסקופיה של המתאם תמונה דרך ImageJ/פיג'י לכמת את מידת קולטן קיבוץ באשכולות על פני התא.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

אנו מתארים את היישום של ננו ספקטרוסקופית אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ כוח אטומי כדי להמחיש את תהליך של חלבון הרכבה עצמית לתוך אגרגטים oligomeric ו-עמילואיד fibrils, אשר קשורה היטב התחלתה ופיתוח של מגוון רחב של מחלות ניווניות אנושיות.

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

שיפור פלואורסצנטיות המושרה בחלבון המושרה בחלבון בזמן הוא חיישן קרבה פלואורסצנטי שימושי רגיש לשינויים מבניים מקומיים בחלבונים. כאן אנו מראים שניתן להשתמש בו כדי לחשוף קונפורמציות מקומיות יציבות α-Synuclein, אשר ידוע גם בשם globulared ולא יציב כאשר נמדד באמצעות סרגל FRET לטווח ארוך יותר.

ניצול שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על-ידי חלבון בזמן כדי לזהות קונפורמציות מקומיות יציבות אחת α-Synuclein Monomer בכל פעם

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

למדו לזהות צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS) בתאי Neuro2a חיים ובליזטים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תכונות דיפוזיה של חלבונים הקשורים למחלות ניווניות כמו ALS.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים