זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אפיטופים נטרול על חלקיקים דמויי וירוס אנטיגן מציגים (VLPs). אימונופרציפיטציה של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגזר VLPs מתבצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים glycoproteins מעטפה בשילוב חלבון חרוזים מגנטיים מצומדים G. VLPs שנתפסו כפופים לאחר מכן SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות חלבון הליבה הנגיפי נוגדנים ספציפיים ל-Gag.

במעבדה שלי, אנו מפתחים מערכות ייצור לווקטורים ויראליים וחלקיקים דמויי וירוס, או חיסונים מבוססי VLP. ה- VLP ללכוד assay מאפשר זיהוי רגיש מאוד של אנטיגנים היעד המוצגים על VLPs. בבדיקה זו, אנו משתמשים בנוגדנים מנטרלים באופן נרחב המכווניים נגד אפיטופי נטרול כדי להוכיח את החשיפה של אפיטופים אלה על פני השטח של VLP.

זוהי הערכת איכות חשובה למועמדים לחיסונים, שכן רק VLPs המציגים אפיטופים רגישים לנטרול יוכלו לעורר תגובת נוגדנים מנטרלת בחיסונים. התחל על ידי השעיית החרוזים המגנטיים על ידי צנרת למעלה ולמטה, או ערבוב על סיבוב ב 50 סל"ד במשך חמש דקות לפחות. בינתיים, להכין את פתרון הנוגדנים המכיל bNABs.

השתמש 10 מיקרוגרם של כל bNAB ב 200 microliters של כריכת נוגדנים חוצץ כביסה לכל תגובה. עבור כל תגובה, להעביר 50 microliters של פתרון חרוז מגנטי לתוך צינור תגובה 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן למקם את הצינורות על מתלה ההפרדה המגנטית. המתן עד החרוזים להתאסף בנשף הצינור כדי להבטיח כי כל החרוזים נאספים, ולאחר מכן להסיר את supernatant.

הסר את המגנט והשהה את החרוזים ב-200 מיקרוליטרים של תמיסת bNAB שהוכן בעבר. דגירה במשך 30 דקות עד שלוש שעות תוך ערבוב על סיבוב ב 50 סל"ד בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, מניחים את צינורות התגובה במתלה ההפרדה המגנטית, ממתינים ומסירים את הסופר-נט.

הסר את הצינורות מהמגנט ולשטוף את החרוזים על ידי השעיה מחדש ב 200 microliters של כריכת נוגדנים חוצץ כביסה. חזור על הכביסה עם כריכת נוגדנים חוצץ כביסה, הסרת מאגר כביסה ככל האפשר בסיום. הוסף את הדגימות ל- bNABs הקשורים חרוזים.

אם נפח הדגימה שנוספה נמצא מתחת למיליליטר אחד, הוסף PBS כדי להתאים את נפח המדגם למיליליטר אחד, ולאחר מכן השהה מחדש את החרוזים על ידי צנרת בעדינות. לדגור על הדגימות והחרוזים במשך 2.5 שעות על סיבוב בטמפרטורת החדר, להבטיח כי החרוזים להישאר השעיה ואת הפתרון מעורבב ביסודיות במהלך הדגירה. מניחים את הצינורות על המגנט ומסירים את supernatant, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים המגנטיים על ידי השעייתם 200 microliters של חוצץ כביסה.

השהו את החרוזים ב-100 מיקרוליטרים של חיץ כביסה והעבירו את המתלים לצינור תגובה נקי ועמיד בחום. מניחים את הצינור על מתלה ההפרדה המגנטית ומסירים את הסופר-טבעי לחלוטין. כדי להכין דגימות STS-PAGE denatured, להשעות את החרוזים ב 20 עד 80 microliters של חוצץ Laemmli ודגורה ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

המשך ישירות עם SDS-PAGE, הצבת הצינורות על מתלה מגנטי כדי להפריד את החרוזים מהפתרון. לחלופין, לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס. תוצאה מייצגת של VLPs שנלכדה לראשונה מכדורי על-טבעיים ותרבית תאים נטולי תאים באמצעות bNABs, ולאחר מכן נחשפה לניתוח כתם מערבי כדי לזהות חלבוני ליבה ויראליים, מוצגת כאן.

החרוזים ששימשו לבדיקת לכידה היו מצופים בשלושה bNABs שונים המכוונים נגד אפיטופי נטרול של גליקופרוטאין ונוגדנים איזוטיים המשמשים כפקדים שליליים. באמצעות חרוזים מצופים נוגדנים איזוטופ, לא ניתן היה לזהות חלבונים Gag בדגימות VLP המכילות VLPs קירחים, כלומר, VLPs Env שלילי, או VLPs מציג Env, המוכיח כי הכריכה הלא מדעית של VLPs חרוזים מצופים נוגדנים אנושיים לא לתווך לכידת VLP. VLPs קירחים גם לא היו קשורים חרוזים מצופים bNABs, וכתוצאה מכך, לא חלבונים Gag היו מזוהים בניתוח כתם מערבי.

לעומת זאת, כל שלושת ה-bNABs לכדו VLPs המציגים חלבוני Env, ולכן, חלבוני Gag זוהו בקלות, מדגים את נוכחותם של אפיטופי נטרול ב- Env-גליקופרוטאין המוצגים על VLPs. חיוני להצלחת ה- assay: ערבוב יסודי של VLPs עם חרוזים מצופים בנוגדנים. זה מושג בצורה הטובה ביותר באמצעות נפחים גדולים יותר מ 500 microliters תחת סיבוב.

לחלופין, ניתן לברוח מ- VLPs שנתפסו בתנאים שאינם מפחיתים. זה מאפשר ניתוח של VLPs המשתמשים מיקרוסקופיה חיסונית אלקטרונית, או את החקירה של האנטיגנים המוצגים באמצעות דף מקורי.