עיבוד מתוקנן עבור בקרות אימונוהיסטוכימיה של כדוריות תאים קבועות בפורמלין, משובצות פרפין.

בקרות כדוריות תאים חיוביות ושליליות המאופיינות היטב עם רמות ביטוי מוגדרות של חלבון או תעתיק חיוניות לפיתוח מבחני אימונוהיסטוכימיה. פרוטוקול זה מתאר תהליך ליצירה ועיבוד של פקדי כדוריות תאים קבועים, משובצים בפרפין. בקרות כאלה יכולות לשמש לאפיון הספציפיות המחייבת תוך פיתוח בדיקה אימונוהיסטוכימית חדשה.

מבחני IHC הם קריטיים למאמצי הגילוי ופיתוח הסמנים הביולוגיים שלנו בתחומים טיפוליים, ופיתוח בקרות מאומתות חיוניים לפיתוח מבחנים אלה. זה חיוני כדי לחמם את הג'ל מבוסס הידרוקסיאתיל אגרוז לפחות 40 מעלות צלזיוס לפני הוספתו לכדור התא. הג'ל חייב להיות מעורבב היטב עם התאים לפני התמצקות.

התחל את הקיבוע של גלולת 293T תאים על ידי הוספת 30 מיליליטר של 10% פורמלין חוצץ ניטרלי לכדור שלושה מיליליטר תא כדי ליצור יחס קיבוע אחד לתא. השהה את התאים על ידי היפוך חוזר ונשנה של צינור 50 מיליליטר הסגור היטב, ואפשר להם להתיישב לילה בטמפרטורת החדר. כדי לשפר את הקיבוע, הגדל את יחס המשטח לנפח על ידי היפוך הצינור למחרת והחייאת התאים.

לאחר 24 שעות של קיבוע, צנטריפוגה של הצינור ב 930 פעמים G בחמש מעלות צלזיוס במשך 10 עד 15 דקות. ודא כי גלולת התא גלויה, והסר את המקבע על ידי decanting או שאיפה בזהירות באמצעות פיפטה העברה סטרילית. הוסיפו ג'ל מותך על בסיס הידרוקסיאתיל אגרוז בטמפרטורה של 40 עד 60 מעלות צלזיוס לכדור ביחס של 1-4 ג'ל לתא.

השתמש בבדיקה נקייה של חמישה אינץ 'ושני מילימטרים עם עין שטופה במי ברז כדי לערבב בעדינות את התוכן של צינור חרוטי 50 מיליליטר, יצירת השעיה אחידה של תאים קבועים בג'ל המותך בתחתית. לאחר השעיה שווה של התאים הקבועים בג'ל המותך, מכסים את צינור הכרוניקה ומניחים אותו על הקרח הרטוב למשך חמש עד 10 דקות. לאחר שכדור הג'ל מתמצק, מניחים בזהירות מיקרוספטולה נקייה לאורך דופן הצינור, וממנפים בעדינות את הכדור מבלי לחדור אותו.

מניחים את הכדור המוצק על נייר הביופסיה. באמצעות מיקרוספטולה נקייה, חתכו את גלולת התא לפרוסות בעובי של ארבעה עד חמישה מילימטרים כדי להתאים לקלטת רקמה של 26 מילימטר על 26 מילימטר על חמישה מילימטרים. מניחים פרוסות כדורי ג'ל בודדות במרכז פיסת נייר ביופסיה.

מקפלים את שני הצדדים הנגדיים, ועוטפים את הפרוסה בנייר לפני שמניחים אותה בקסטת טישו בגודל 26 על 26 על חמישה מילימטרים. סגור את המכסה. הכניסו את קסטת גלולת התאים החתוכים לתוך ריטורט מעבד הרקמות המלא בפורמלין חוצץ ניטרלי ב-10%, ופעלו לפי לוח זמנים קצר לעיבוד.

להטמעת גלולת התא, הנח את הקסטות המעובדות באזור ההחזקה של מרכז ההטבעה. פתח את מכסה קלטת הרקמה, ופתח בזהירות את נייר הביופסיה. מניחים את גלולת התא לתוך תבנית הטמעה חד פעמית קטנה בגודל 15 על 15 מ"מ בצד חתוך כלפי מטה.

תוך כדי החזקה עדינה של גלולת התא בתחתית התבנית עם מלקחיים, יש להוסיף חדירת רקמה של 62 מעלות צלזיוס או להטמיע פרפין לתוך התבנית, המכסה את גלולת התא. מעבירים את התבנית לגוש קר כדי לחזק את הפרפין. התאימו את כדור התא בזמן שהפרפין מתמצק, וקבעו אותו במיקום המתאים בתחתית התבנית.

הסר את המכסה מהקלטת. מניחים את הצד התחתון של הקלטת כלפי מטה על גבי תבנית ההטבעה, ומוסיפים פרפין מותך נוסף לכיסוי הקסטה. כאשר פרפין מתמלא מעל קסטת הרקמה, להחזיר את התבנית לגוש הקור להתמצקות.

הרימו את מקטעי הפרפין שהוכנו באמצעות המיקרוטום הסיבובי מאמבט הציפה על גבי מגלשות טעונות חיובית. מקם את החלק הראשון בחלק העליון של השקופית בתוך גבול ההחלקה והכתם של הכיסוי, ולאחר מכן מקם באופן סדרתי את החלקים הבאים כאחד מתחת לשני. לאחר שתסיים, יבש את המגלשות בתחילה ב 23 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ולאחר מכן ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

גלולת התא המשובצת שהוכנה בשיטה זו הראתה התפלגות תאים שווה לאורך כל הקטע, עם מינימום גושים ואינטראקציות של תאים בכדור. כאשר ההדמיה של חיסונית נעשתה באמצעות הדימינובנזן החום, הכרומוגן ושלושת קווי התאים נצפו רמות שונות של ביטוי גורם השעתוק TEAD בגרעין, החל מ-no, דרך חלש, ועד לביטוי החזק. שילוב כדורי התא במיקרו-מערך אפשר הערכה של בקרות עם רמות ביטוי משתנות באותה שקופית ללא שינוי בפרוצדורות.

כפי שניתן לראות בדוגמה זו, ניתן לראות בקרה שלילית של PEG 10 בתאי גזע עובריים לקויים של עכברים ובקרה חיובית של 293T על ביטוי יתר של PEG 10. הקפדה על כך שהתאים מקובעים כראוי ומופצים בצורה הומוגנית לאורך כדור הג'ל יוצרת בקרת בדיקה סטנדרטית אחידה. כדוריות התאים יכולות לשמש כבקרות באימונוהיסטוכימיה במורד הזרם ובמבחני הכלאה של NC2 עם שיטות סטנדרטיות לאחזור אנטיגן והתוויה.

בקרות גלולות תאים אפשרו פיתוח של מבחני אימונוהיסטוכימיה רבים, במיוחד עבור חלבונים חדשים או בעלי מאפיינים מינימליים. הם משמשים כבקרות מוגדרות היטב שיכולות לעזור לאפיין את ספציפיות הנוגדנים.