קביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים בתרבית על ידי Immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הביטוי של סמני התפשטות מעניינים על ידי ניתוחים אימונוציטוכימיים והיסטולוגיים של גושי רקמה משובצים בבלוק תאי טרומבופלסטין-פלזמה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת המפתח לגבי הפתולוגיה הקלינית של חסימת תאים על ידי הרקמות. היתרון העיקרי של שיטה חלופית זו לניתוח אימונוציטוכימי של גושי תאים משובצים בפרפין הוא הפשטות הטכנית של ההליכים.

כאשר צלחת של 100 מילימטר של תרבית תאי HeLa מגיעה למפגש, החלף את הסופרנטנט ב -10 מיליליטר של מדיום תרבית תאי HeLa ללא FBS והחזיר את המנה לחממת תרבית התאים. לאחר 48 שעות, שטפו את התאים עם שני מיליליטר PBS ואחריהם דגירה בשני מיליליטר של 0.25% EDTA בתוספת טריפסין למשך שתיים-שלוש דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים התנתקו, עצרו את התגובה עם חמישה מיליליטר של מדיום שלם והעבירו את תמיסת התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ואחריה שתי שטיפות בשני מיליליטר PBS קר לכל שטיפה. לאחר הכביסה השנייה, החלף את הסופרנטנט במיליליטר אחד של אתנול 95% וערבב את הגלולה על ידי מערבולת. לאחר מכן הניחו את התאים הקבועים על קרח.

כדי להכין גוש תאי פרפין, לאחר איסוף פלזמת EDTA מדם תורם בריא, יש לצנטריפוגה את הדגימות ולהעביר 200 עד 400 מיקרוליטר פלזמה סופרנטנטית לצינורות מיקרופוגה בודדים. לאחר מכן הוסף כ-200 מיקרוליטר פלזמה, כ-200 מיקרוליטר טרומבופלסטין וכ-200 מיקרוליטר של 025 סידן כלורי מולארי לתאי הלה הקבועים. הניחו לתערובות ליצור קרישי תאים בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות, ולאחר מכן שטפו את הקרישים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS תוך סילוק מלא של הקרישים על פיסות בודדות של נייר סינון לח פורמלין לאחר הכביסה השנייה.

עטפו את הקרישים בנייר הסינון והשתמשו בסט סיכות כדי למקם את המטליות בקלטות טישו בודדות במרכז ארבע פיסות נייר לחות פורמלין אחרות. לאחר מכן הכניסו את קלטות הטישו לצנצנות זכוכית המכילות 50 מיליליטר פורמלין חוצץ לקיבוע פורמלין למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר העמיסו את הקסטות למעבד טישו להסרת מים למשך הלילה ומיזוג תאים קבוע.

לפחות שעה לפני סיום הליך העיבוד, הפעל תחנת הטבעה מחוממת כדי להמיס את הפרפין. כאשר תחנת ההטבעה והקריש מוכנים, יש לאשר את נוכחותו של פרפין מותך בתבנית המתכת ולהעביר קריש תאים שנוצר לתוך הפרפין. הכניסו קלטת טישו חדשה ללא המכסה לתבנית המתכת וכסו את הקסטה בפרפין מותך יותר.

תנו לפרפין להתמצק בצלחת קרה למשך 30 עד 60 שניות. לאחר מכן הפרד את קלטת הרקמות מתבנית המתכת. כדי להכין חלקים לניתוח אימונוציטוכימי, אתר את קריש התא בגוש תא פרפין אחד והשתמש במיקרוטום כדי לחתוך את הבלוק לפרוסות בעובי של שלושה עד ארבעה מיקרומטר.

מניחים קטעי פרפין על שקופיות זכוכית מצופות מלח ומכניסים את השקופיות לתנור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כאשר החלקים נדבקו לשקופיות, הסר את הפרפין מהשקופיות ב -15 מיליליטר קסילן למשך ארבע דקות ולאחר מכן ייבוש החלקים עם דגירות אתנול יורדות של שתי דקות ברצף. לאחר הדגירה של 80% אתנול, שטפו את החלקים במים זורמים למשך 10 דקות והרתיחו את השקופיות בצנצנת המכילה 40 מיליליטר של מאגר אחזור tris-EDTA למשך 30 דקות.

בתום הדגירה יש לשטוף את המגלשות שנאספו באנטיגן מתחת למים זורמים ולאחר מכן דגירה של 10 דקות באתנול 95% בארבע מעלות צלזיוס. לאחר ייבוש באוויר, השתמש בעט הידרופובי כדי להקיף את אזור צביעת התאים בכל שקופית. שטפו את המגלשות ב-TBS-T ולאחר מכן דגירה בבלוק מי חמצן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר כל פעילות פרוקסידאז שנותרה.

שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-TBS-T למשך שתי דקות כל שטיפה, ולאחר מכן סמנו את החלקים ב-100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית מערכת הכתמים האימונוציטוכימית המעניינת למשך שעה אחת ואחריה חמש שטיפות TBS-T של שתי דקות. לאחר הכביסה האחרונה, דגרו את השקופיות במשפר נוגדנים ראשוני מהערכה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בתום הדגירה יש לשטוף את החלקים ארבע פעמים ב-TBS-T ולהוסיף כ-200 מיקרוליטר של נוגדן משני המסומן בחזרת פרוקסידאז לאחר השטיפה האחרונה למשך 30 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.

שטפו את החלקים המשופרים חמש פעמים ב-TBS-T טרי ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת דיאמינובנזידין לכל קטע למשך שלוש דקות. שטפו את השקופיות פעמיים ב-TBS-T וסמנו את החלקים ב-100 מיקרוליטר תמיסת המטוקסילין למשך דקה אחת. לאחר מכן שטפו את המגלשות פעם נוספת ב-TBS-T ודגרו את המגלשות ב-95% אתנול למשך שתי דקות ולאחר מכן טבילה אחת באתנול טרי 95% ושתי טבילות ב-100% אתנול.

דגרו את החלקים המיובשים באתנול ב-40 מיליליטר קסילן בצנצנת זכוכית למשך חמש דקות והניחו לשקופיות להתייבש באוויר. לאחר מכן הרכיבו פתק כיסוי על כל שקופית והתבוננו בדגימות תחת מיקרוסקופ אור. צביעת המטוקסילין ואאוזין של הרקמה המוטבעת בפרפין, כפי שהודגם זה עתה, מתגלה בעיקר בגרעיני טאקט וציטופלזמה, מה שמרמז על שימור מורפולוגי מצוין של דגימות התאים בשיטה זו.

גושי תאים מוכנים בצורה גרועה, לעומת זאת, מציגים מורפולוגיה גרועה ותיוג לא סדיר גם אם הדגימות מוכתמות כראוי. חלבון 2 הקשור לשלד הציטולוגי נצפה בדרך כלל בתוך הכרומטין המרוכז, הציר המיטוטי והציטופלזמה. רק התאים עם חלבון הקשור לשלד הציטו שני צביעה בכרומטין המעובה הם תאים מיטוטיים ואילו מעט תאים חיוביים הקשורים לשלד הציטו נמצאים בתוך אוכלוסיית תרבית תאי HeLa הרעבה בסרום.

רוב תאי ה-HeLa המיטוטיים מאוד הם גם חיוביים ל-Ki-67 וצביעה של Ki-67 נראית בגרעיני התא. רק כמחצית מתאי ה-HeLa הרעבים בסרום מבטאים את סמן ההתפשטות הזה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לדלל את התאים לצפיפות מתאימה ליצירת קריש דם טוב. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטה אחרת כמו ניתוח זרימה ציטומטרי של התאים הקבועים כדי לענות על שאלה נוספת לגבי שלב מחזור התא במהלך הסנכרון. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לעתיד בתחום הפתולוגיה של הכבד לחקור פרופיל ביטוי בקו התאים תוך שימור מידע מורפולוגי בתאים מתורבתים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע אימונוציטוכימיה ולהכין בלוקים של טרומבופלסטין בפלזמה מהתאים המתורבתים. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים מסוכנים כמו קסילן עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.