Name: קביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים בתרבית על ידי Immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למד ניתוח immunocytochemistry לסמני התמדה בתאי HeLa תוך שימוש בבלוקי תאים מוטבעי פרפין. שיטה זו מציעה פשטות טכנית לצד שימור מורפולוגי מצוין של הדגימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר כדי ק'-מ. ה מרכז הסרטן הלאומי, קוריאה (1510121), קרן מחקר לאומי, קוריאה (לא. NRF-2015R1A2A2A04007432).

פרוטוקול המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה המנהלים של מרכז הסרטן הלאומי, קוריאה (NCCNCS-12-630).
1. משאבות (30 דקות)
<ol><li>עבור התרבות של תאים הלה (CCL-2, בקרת האוויר), להשתמש 10 מ"ל מלאה DMEM בינוני (סרום שור עוברית 10%, 1% עט-דלקת) לצלחת תרבות 100 מ מ. כדי להכין סרום מורעבים תאים הלה, דגירה confluent תאים הלה DMEM ללא סרום שור העובר למשך 48 שעות, כפי שמתואר במחקר הקודם11.</li>
	<li>כדי לנתק את התאים, לשטוף אותם עם 2 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS), וכן להוסיף טריפסין EDTA 0.25% 2 מ"ל לכל מאכל תרבות 100 מ מ. לאחר מכן, תקופת דגירה של 2-3 דקות חממה2 CO ב 37 º C.</li>
	<li>הוסף 5 מ של בינוני DMEM מלאה לצלחת תרבות לבטל את הפעלתה של טריפסין, להעביר את התאים מנותקת צינור 15 מ"ל. לאחר מכן, centrifuge את התאים ב 300 גרם x 10 דקות ליצור גלולה.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר לשטוף את גלולה פעמיים עם PBS קר 2 מ"ל על ידי צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות.</li>
	<li>לאחר הסרת תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל אתנול 95% בגדר תא ומערבבים בגדר תא עם אתנול על-ידי vortexing. לשמור את התאים קבוע על הקרח עד ההכנה אגף.</li>
</ol>2. אגף הכנה (1 h 30 דקות)
<ol><li>עבור הכנת פלסמה קפואה aliquots, לאסוף פלזמה EDTA מהדם תורם בריא צנטריפוגה ב g 13,000 x במשך 10 דקות לאסוף פלזמה supernatant ו µL aliquot 200-400 כל לתוך microfuge צינורות. לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. כאשר aliquots פלסמה קפואה מוכנים, לאחזר אותן, להפשיר הפלזמה על ידי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>Centrifuge התאים קבוע ב 700 g x 10 דקות, ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>מערבבים בגדר תא עם 2 טיפות (כ-200 µL) של פלזמה, 2 טיפות של thromboplastin, 2 טיפות של 0.025 M סידן כלורי. לאחר מכן, מערבבים אותם על-ידי pipetting.</li>
	<li>לאפשר את התערובת ליצור קריש תא בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, כפי שמוצג באיור 2A. לאחר מכן, לשטוף את הקריש תא עם PBS פעמיים על ידי מזיגת והסרה של PBS באמצעות פיפטה. . קריש הדם תא לבן הנציגה מוצג באיור 2B.</li>
	<li>להרטיב את פיסת נייר סינון עם פורמלין, לעטוף את הקריש תא עם נייר הסינון בטעימת מראש. ואז, למקם את התערובת קרוש עם pincette קלטת רקמות כפי שמוצג באיור 2C.</li>
	<li>מקום בקלטת רקמות בתוך צנצנת זכוכית המכיל 50 מ של פורמלין במאגר (פורמלין 10% ב- PBS) בן לילה ב 4 ° C עבור קיבעון פורמלין.</li>
</ol>3. ברקמה והטבעה פרפין (לילה)
<ol><li>לטעון את הקלטת הרקמה המכילה את הקריש תא פורמלין-קבוע בתוך מעבד רקמות בין לילה כפי שתואר לעיל11. עיבוד רקמה מיועדת להסרת מים ומיזוג תאים קבוע לפני פרפין הטבעה. למחקר ללא עיבוד רקמה, לבצע את הרקמה עיבוד ההליך כפי שמוצג בטבלה 1.</li>
	<li>הפעל מחוממת ההטבעה תחנת, ו- 60 דקות לאחר מכן, הבדיקה כי יש שעווה מותכת כייר מתכת ובזה (איור דו-ממדי).</li>
	<li>לקחת את הקריש נוצר תא בקלטת רקמות ולמקם אותו פרפין מותכת בתוך כייר מתכת.</li>
	<li>מקום בקלטת רקמה חדשה ללא המכסה לתבנית מתכת המכילה את התא ייקרש באמצע פרפין מותכת, ושופכים פרפין מותכת יותר את הקלטת רקמות ו על כייר מתכת. . אז, תן פרפין לחזק בצלחת קר במשך 30-60 שניות.</li>
	<li>להפריד את הקלטת רקמות כייר מתכת. . אז, לחסום את התא פרפין הוא מוכן immunocytochemistry. החץ באיור 2Eמציינים את הקריש תא מוטבע אגף פרפין-מוטבע.</li>
</ol>4. הכנה של שקופיות Immunocytochemistry (1h)
<ol><li>תחפש הקריש תא פרפין אגף באיזור, לחתוך פרוסות עם עוביים של 3-4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום לחסום את התא. לשים את המקטעים פרפין בשקופיות זכוכית מצופים silane, כפי שמוצג באיור 2F.</li>
	<li>מקם את השקופיות סעיף בתנור 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להפוך את המקטעים לדבוק השקופיות.</li>
</ol>5. Immunocytochemistry של בלוקי תא (6 שעות)
הערה: עבור immunocytochemical מכתים במקטעי אגף, הקיטים השונים יכול לשמש (ראו טבלה של חומרים). כל ערכות כאלה יש רגישויות שונות specificities בהתאם את השינויים שלהם.
<ol><li>דגירה בסעיפים 50 מ של קסילן במשך 4 דקות לבטל את paraffinize.</li>
	<li>דגירה של שקופיות אתנול 100% למשך 2 דקות על התייבשות, ו פעמיים אתנול 95% ו- 80% אתנול למשך 2 דקות. לאחר מכן, הסר האתנול במים למשך 10 דקות.</li>
	<li>לאחזור אנטיגן, למקם את השקופיות במאגר צנצנת המכילה 40 מ"ל טריס-EDTA אחזור, pH 9.0, מרתיחים בסיר למשך 30 דקות.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות תחת מים זורמים, דגירה אותם אתנול 95% 10 דקות ב 4 º C. לאחר מכן, לסמן את האזור מכתים תא בשקופיות עם עט פאפ כדי שניתן יהיה לזהותם בקלות.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות בתוך תמיסת מלח באגירה טריס המכיל 0.2% Tween 20 (TBS-T), דגירה בבלוק מימן על-חמצני (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות להסיר את כל פעילות peroxidase שריד. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב- TBS-T שלוש פעמים למשך 2 דקות כל אחד.</li>
	<li>להכין נוגדן מדולל פתרון על ידי דילול נוגדן ראשוני בבלוק חלבון (ראה טבלה של חומרים). לדוגמה, CKAP2 נוגדן ראשוני יכול להיות מדולל מטריים, שבערך נוגדן של Ki-67. לאחר מכן, דגירה השקופיות µL 100 של נוגדן מדולל פתרון מאובטח.</li>
	<li>לאחר הרחצה TBS-T חמש פעמים למשך 2 דקות כל אחד, דגירה השקופיות משפר נוגדן ראשוני בערכה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לאחר הכביסה ב- TBS-T ארבע פעמים למשך 2 דקות כל אחד, להוסיף 2 טיפות HRP פולימר (נוגדנים משניים המסומנת חזרת peroxidase), דגירה השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	<li>לאחר הרחצה TBS-T חמש פעמים במשך 2 דקות, להוסיף 100 µL של diaminobenzidine (DAB) פתרון (ראה טבלה של חומרים), דגירה השקופיות למשך 3 דקות.</li>
	<li>אחרי כביסה ב- TBS-T פעמיים, להוסיף 100 µL של פתרון Hematoxylin (התערובת של µL 100 של Hematoxylin ו- 600 µL של מים מזוקקים), דגירה של שקופיות 1 דקות.</li>
	<li>לאחר כביסה מייבשים השקופיות TBS-T פעם אחת, על ידי המקננת אתנול 95% למשך 2 דקות, טובלים ב 95% אתנול פעם טובלים ב- 100% אתנול פעמיים. לאחר מכן, דגירה השקופיות 40 מ ל קסילן בצנצנת זכוכית למשך 5 דקות.</li>
	<li>כאשר בשקופיות יבשים מתוך קסילן, הר על coverslips בהתאמה.</li>
	<li>לבחון את דפוסי ההגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור.</li>
</ol>

<ol><li>Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419424">High-quality immunofluorescence of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/10/1703">Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls.</a> J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23299451">Immunofluorescence Techniques.</a> J Invest Dermatol. 133, e4(2013).</li>
<li>Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+thromboplastin-plasma+cell-block+technique+for+fine-needle+aspiration+and+serous+effusions%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions.</a> Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).</li>
<li>Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+utility+of+the+cell+block+method+versus+the+conventional+smear+study+in+pleural+fluid+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology.</a> J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).</li>
<li>Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+block+cytology%3A+Improved+preparation+and+its+efficacy+in+diagnostic+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology.</a> Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).</li>
<li>Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value%2C+feasibility%2C+and+validity+of+preparing+cell+blocks+from+fluid-based+gynecologic+cytology+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens.</a> Cancer. 96, 204-209 (2002).</li>
<li>Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8390929">Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material.</a> Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).</li>
<li>Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mouse+cytoskeleton-associated+protein%2C+CKAP2%2C+with+microtubule-stabilizing+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties.</a> Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).</li>
<li>Hong, K. U., Choi, Y. -B., Lee, J. -H., Kim, H. -J., Kwon, H. -R., Seong, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+phosphorylation+of+tumor+associated+microtubule+associated+protein+%28TMAP%29%2Fcytoskeleton+associated+protein+2+%28CKAP2%29+at+Thr-596+during+early+phases+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis.</a> Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).</li>
<li>Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CKAP2+%28cytoskeleton-associated+protein2%29+is+a+new+prognostic+marker+in+HER2-negative+luminal+type+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182107(2017).</li>
<li>Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+is+a+prognostic+parameter+in+breast+cancer+patients%3A+results+of+a+large+population-based+cohort+of+a+cancer+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).</li>
<li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).</li>
<li>Beutner, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining%3A+The+fluorescent+antibody+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).</li>
</ol>

כל המחברים הכריזו שאין ניגודי אינטרסים.

צביעת immunofluorescent על קבוע תאים בתרבית נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים תוך שמירה על מידע מורפולוגי1. עם זאת, immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע יכול להיות חלופה מצוינת. ההליכים מפורט עבור הכנת בלוקי תא פרפין-מוטבע ו- immunocytochemistry תוארו של פרוטוקול זה, אנו מקווים זה יכול להקל על היישום של immunocytochemistry במחקרים התא.
Immunocytochemistry יש מספר יתרונות על צביעת immunofluorescent. Immunofluorescent מכתים עבור תאים בדרך כלל דורש תאים בתרבית טרי, אבל בלוקי תא פרפין יכול להישמר בטמפרטורת החדר במשך שנים מספר13. בנוסף, immunocytochemistry על בלוקי תא יכולים לחקור דפוסי ביטוי תאיים על ידי העסקת הנוגדן אותו בשימוש שגרתי אימונוהיסטוכימיה ברקמות אנושיות4. יתר על כן, זה יכולים לחקור את השינויים רמות החלבון או שינויים posttranslational גם על ידי מראש המקננת תאים עם תרופות שונות או תחת תנאים שונים של תרבות11.
לעומת היתרונות של immunocytochemical מכתים, הכנת בלוקי תא פרפין-מוטבע לוקח זמן והוא יקר14. כמו כן, רוב מעבדות מחקר חסר ניסיון בטכניקה זו, שגיאות טכניות בנסיבות כאלה נפוצים. מהשגיאות הנפוצות ביותר הן ההשתמרות הדלה תא מורפולוגיה של עני או לא סדיר immunocytochemical מכתים במקטעי בלוק תא פרפין. אלה ואחרים רוב ניתן להימנע על ידי ביצוע בלוקי תא תחת התנאים תא הכי באמצעות פתרון מספיק כדי ליצור תא קרישי דם.
בתור הדגמה של הפרוטוקול הנוכחי, בלוקי תא הוכנו עבור תאים הלה, immunocytochemical מכתים בוצע עבור שני סמנים התפשטות, CKAP2 ו- Ki-67, כפי שדווחה בעבר11. עבור immunocytochemistry, התאים היו המניפולציה של דגירה בתקשורת עם ובלי סרום שור עוברית, השפעת סרום רעב יכול להיות שנצפו. יכול להיות מועסק אלה בלוקי תא פרפין-מוטבע מוכן עבור מספר גדול של נוגדנים, כי ניתן להכין שקופיות רבים לתא כלא באמצעות רק מיקרומטר-עבה-אגף מקטע 4-5 עבור כל שקופית. לכן, ניתן להעריך דפוסי ביטוי המתייחס שני תנאים שונים עם מספר נוגדנים שונים. Immunostaining תבניות עבור CKAP2, Ki-67 סרטן רקמות כבר דיווחו9,10,11,12. immunocytochemical מכתים תוצאות יוכל בקלות להעריך, כי דפוסי מכתימים היו דומים מאוד לאלה של אימונוהיסטוכימיה.
לסיכום, immunocytochemical מכתים על בלוקי תא פרפין יכול להיות אלטרנטיבה מצוינת מכתים immunofluorescent; יתר על כן, זה יכול להיות בקלות ובאמינות מועסק במחקר בסיסי עבור הביטוי פרופיל בשורות תאים תוך שמירה על מידע מורפולוגי.

במעבדות רוב, בלוקי תא פרפין-מוטבע נמצאים בשימוש נפוץ. במקום זאת, קבוע תאים בתרבית, פרפין-מוטבע לא התאים, הם מועסקים בלימודי הסבת subcellular. לאלו קבוע תאים בתרבית, שימש זריחה במקום chromogen. לכן, צביעת immunofluorescent נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמות החלבון ביטוי במחקר העסקת תרבויות תא1. שקופיות שהוכנו עבור צביעת immunofluorescent, עם זאת, ניתן לצפות רק תחת מיקרוסקופ immunofluorescent, אשר עשויה להציג תמונות שונות לחלוטין מאלו המתבקשים תחת מטוס מיקרוסקופ2. בנוסף, שימור שקופיות עבור צביעת immunofluorescent דורש הגנה מפני אור בהיר, ולהיות אותות פלואורסצנט חלשים עם חשיפה חוזרת ונשנית עבור הדמיה בשל האובדן של אותות פלואורסצנט3. תוצאות immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע דומים למדי לאלה של אימונוהיסטוכימיה על רקמות פרפין-מוטבע4, הם יכולים בקלות להיות מתורגם המידע הקליני. לכן, immunocytochemistry יכול להיות חלופה מצוינת. עם זאת, אגף הכנה לא היתה פופולרית במעבדות מחקר בסיסי. ב פרוטוקול זה, ואז, הכנה אגף immunocytochemical מכתים ניתנים כדי לקדם את השימוש בשיטה זו בתחום של לימודי תרבות-תא.
הכנה אגף immunocytochemistry אינן שיטות עבודה ייחודיות ולאחר שכבר החלתם של אבחון קליני מחקר בסיסי4,5. למרות הכנה אגף שונים בשיטות היה דיווח על4,6 thromboplastin-הפלזמה שיטה היא פשוטה, חסכונית, וניתנת להתאמה בקלות. לכן, בפרוטוקול שהוצגו במאמר זה, thromboplastin-פלזמה שיטה4,5,6,7,8 משמש לייצור בלוקי תא פרפין-מוטבע.
במחקר הנוכחי, היו הפגינו את נהלי ההכנה של בלוקי תא thromboplastin-פלזמה ושיטת immunocytochemistry העסקת שני סמנים הפצת נתונים היסטוריים. סמן אחד הוא חלבון שלד התא-הקשורים 2 (CKAP2), אשר לאחרונה דווחה על סמן mitotic9,10,11; השני הוא Ki-67, המהווה סמן התפשטות הידועים12. ערכת נציג מוצג באיור1.

<table><tbody><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>HeLa (ATCC&nbsp; CCL-2)</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 נוגדן</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>RM-9106-S1</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר SCientific</td><td>1330-20-7,100-41-4</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>GD Chem</td><td>DJ16016</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>אג'ילנט</td><td>10118581</td><td></td></tr><tr><td>DAB Quanto Kit</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>TA-125-QHDX, QHCX 170405</td><td></td></tr><tr><td>Ultravision LP ערכת זיהוי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PBQ141209, LPB141209, ערכת LPH141210</td><td>לאימונוציטוכימיה; מכיל בלוק חלבון</td></tr><tr><td>סיר לחץ TintoRetriever</td><td>Bio SB Corporation</td><td>BSB 7008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered</td><td>מלח iNtRON Biotechnology</td><td>IBS-BT008</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB תאגיד</td><td>115106</td><td></td></tr><tr><td>תרומבופלסטין</td><td>Neoplastin Cl Plus</td><td>NC0591432</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA rerival Buffer</td><td>Dignostic Biosystem</td><td>E625-A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal&nbsp; סרום בקר (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>בלוק מי חמצן אולטרה ראייה H2O2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02Q141212</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>363313</td><td></td></tr><tr><td>פאפ-פן</td><td>וקטור מעבדות</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>GE בריאות מדעי החיים</td><td>1001-0155</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>21115-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח PAA מעבדות</td><td>H21-002</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין</td><td>Daejung</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת 15 מ"ל</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>קלטת עיבוד רקמות</td><td>Simport</td><td>M492-5</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ כלי תרבית</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>מוטו כימיקלים טהורים</td><td>140712</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>מרינפלד</td><td>2262817</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית זאר</td><td>Hyunil Lab-Mate</td><td>HIP-1027</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Class II קולט אדים זרימה למינרית</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>1300 סדרה A2</td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>סדרה A2</td><td></td></tr><tr><td>מעבד רקמות</td><td>Leica BioSystem</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>CX-21</td><td></td></tr><tr><td>תחנת הטמעת פרפין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>EC 350-1, EC 350-2</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מדור רקמות (עגול)</td><td>CellPath</td><td>HCP-JAW-0100-00AEU</td><td></td></tr><tr><td>אדים הוד</td><td>האניאנג ציוד מדעי ושות 'בע"מ</td><td>FH-150</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים בתרבית על ידי immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

צביעת immunofluorescent נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמות ביטוי החלבון במערכות תרבית תאים כאשר מידע מורפולוגי הוא גם הכרחי. הפרוטוקול של immunocytochemical מכתים על בלוקי תא פרפין-מוטבע, שהוצגו במסמך זה, היא אלטרנטיבה מעולה immunofluorescent מכתים בתאי קבוע-מוטבע פרפין. ב פרוטוקול זה, לתא כלא פרפין מתאי הלה הוכן בשיטת thromboplastin-פלזמה, immunocytochemistry בוצע על ההערכה של שני סמנים התפשטות, CKAP2 ו- Ki-67. הגרעינים cytoplasmic המורפולוגיה של תאי הלה היו השתמר היטב בשקופיות אגף. במקביל, הדפוסים מוכתמים CKAP2 ו- Ki-67 ב- immunocytochemistry היו די דומים לאלו immunohistochemical מכתים ברקמות סרטן פרפין. עם תרבית תאים ששונה תנאים, לרבות קדם דגירה של הלה תאים בתנאים ללא סרום, יוכל להעריך את ההשפעה תוך שמירה על מידע אדריכלי. לסיכום, immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע הוא אלטרנטיבה מצוינת immunofluorescent מכתים.

בשקופית hematoxylin ואאוזין-מוכתם מהגוש תא פרפין-מוטבע (איור 3 אב'), רוב האטומים, הציטופלסמה של התאים שלמים, רומז שימור מורפולוגי הוא מעולה עם (פרוטוקול הנוכחי איור 3A). ב ההכתמה immunocytochemical, צביעת CKAP2 חיובית נצפתה כרומטין מרוכז, פלך mitotic ו הציטופלסמה (איור 4), כפי שדווחה בעבר10. Ki-67 מכתים נצפתה ב גרעינים תא, כמו הצפוי (איור 4). רק בתאים עם CKAP2 מכתים בכרומטין מרוכז (ראו החיצים באיור 4AB) היו תאים mitotic. תאים CKAP2-חיוביים רבים הוצגו בתאים הלה מאוד mitotic הוכנה לאחר דגירה שלם בינוני (איור 4A). לשם השוואה, היו כמה תאים CKAP2-חיוביות בתאים הלה מורעבים סרום (איור 4B). רוב התאים הלה mitotic מאוד היו Ki-67 חיובי (איור 4C). . Contrastingly, הקצב Ki-67-חיוביות בתאים הלה מורעבים סרום נשאר גבוה ככל ~ 50% (איור 4D). תוצאות אלה הן די דומות לאלה הקודם ח11, שמצביע על כך CKAP2 הוא אמין יותר התפשטות סמן בתאים סרטניים מאשר Ki-67.
תא לקוי מוכן בלוקים, הגרעינים מופרדים הציטופלסמה, ויש גם, resultantly, מורפולוגיות ההשתמרות הדלה. דגירה ארוך יותר-מאשר-לילה של תאים קבוע במקרר עלול לגרום תוצאות עניים כאלה. בעיה חשובה נוספת היא כי תאים לא מוכתמים היטב על ידי immunocytochemistry, על אף האמור המורפולוגיה מעולה. בעיה זו מתעוררת לעיתים קרובות יותר כאשר הקריש התא הוא קטן. בדרך כלל, עוצמת מכתימים הוא לא סדיר כפי שמוצג באיור 3B; אבל כאשר הקריש תא גדול, יש הרבה פחות סיכוי מכתים לא סדיר. לכן, ב פרוטוקול זה, הגדלנו את אמצעי האחסון של פלזמה, thromboplastin סידן כלורי כדי ליצור קריש דם תאים גדולים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig1.jpg"> איור 1: ערכת הכנה-אגף. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig2.jpg"> איור 2: איור של פרפין-אגף הכנה- (א) קריש דם בצינור thromboplastin-פלזמה התא. (B) קריש דם לאחר כביסה PBS תא TP. קריש דם על נייר סינון בטעימת תא (ג). (ד) רקמה-הטבעה תחנת עם שעווה מותכת. כייר מתכת (חץ) מחזיקה שעווה מותכת על התמצקות. (ה) פרפין-מוטבע תא קריש דם (חץ) מוטבע פרפין או אגף פרפין-מוטבע. (F) מדור פרפין דק על החלק האמצעי של שקופית מצופה. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig3.jpg"> איור 3: אגף הכנה ואישור של איכות על ידי hematoxylin ואת אאוזין. immunostaining. (א) hematoxylin ואאוזין-מוכתם תמונה של הלה תאים במקטע פרפין-מוטבע-אגף. (ב) צביעת לא סדיר של Ki-67 ב- immunocytochemistry על לקוי של פרפין-מוטבע-אגף סעיף יתנכה גודל ברים הם μm 100 (א) ו (ב) 200. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig4.jpg"> איור 4: Immunocytochemical מכתים בבלוק פרפין-מוטבע תא עבור תאים הלה. (א) CKAP2 מכתים בתנאים מאוד mitotic. (ב) CKAP2 מכתים בתנאים מורעבים סרום. (ג) Ki-67 מכתים בתנאים מאוד mitotic. (ד) Ki-67 מכתים בתנאים מורעבים סרום. 100 μm סולם ברים מוצגים. ראשי חצים מצביעות על תאים CKAP2-חיוביות. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>הליך</td>
			<td>צעדים</td>
			<td>פתרון</td>
			<td>טמפרטורה/זמן</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">התייבשות</td>
			<td>1</td>
			<td>70% אלכוהול</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>80% אלכוהול</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>אלכוהול 95%</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>100% אלכוהול</td>
			<td>15 min/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ניקוי</td>
			<td>1</td>
			<td>קסילן</td>
			<td>60 דקות/4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>קסילן</td>
			<td>מינימום 10/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>קסילן</td>
			<td>מינימום 10/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>קסילן</td>
			<td>מינימום 10/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>* RT, בטמפרטורת החדר</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. הליך עיבוד רקמה.

כיום, צביעת immunofluorescent על תאים קבוע הוא שיטת הבחירה לקביעת רמות הביטוי חלבון כאשר מידע מורפולוגי נחוץ גם. פרוטוקול זה שהוצגו במסמך זה מספק שיטה חלופית immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע.

קביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים בתרבית על ידי Immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הביטוי של סמני התפשטות מעניינים על ידי ניתוחים אימונוציטוכימיים והיסטולוגיים של גושי רקמה משובצים בבלוק תאי טרומבופלסטין-פלזמה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת המפתח לגבי הפתולוגיה הקלינית של חסימת תאים על ידי הרקמות. היתרון העיקרי של שיטה חלופית זו לניתוח אימונוציטוכימי של גושי תאים משובצים בפרפין הוא הפשטות הטכנית של ההליכים.כאשר צלחת של 100 מילימטר של תרבית תאי HeLa מגיעה למפגש, החלף את הסופרנטנט ב -10 מיליליטר של מדיום תרבית תאי HeLa ללא FBS והחזיר את המנה לחממת תרבית התאים. לאחר 48 שעות, שטפו את התאים עם שני מיליליטר PBS ואחריהם דגירה בשני מיליליטר של 0.25% EDTA בתוספת טריפסין למשך שתיים-שלוש דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים התנתקו, עצרו את התגובה עם חמישה מיליליטר של מדיום שלם והעבירו את תמיסת התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ואחריה שתי שטיפות בשני מיליליטר PBS קר לכל שטיפה. לאחר הכביסה השנייה, החלף את הסופרנטנט במיליליטר אחד של אתנול 95% וערבב את הגלולה על ידי מערבולת. לאחר מכן הניחו את התאים הקבועים על קרח.כדי להכין גוש תאי פרפין, לאחר איסוף פלזמת EDTA מדם תורם בריא, יש לצנטריפוגה את הדגימות ולהעביר 200 עד 400 מיקרוליטר פלזמה סופרנטנטית לצינורות מיקרופוגה בודדים. לאחר מכן הוסף כ-200 מיקרוליטר פלזמה, כ-200 מיקרוליטר טרומבופלסטין וכ-200 מיקרוליטר של 025 סידן כלורי מולארי לתאי הלה הקבועים. הניחו לתערובות ליצור קרישי תאים בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות, ולאחר מכן שטפו את הקרישים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS תוך סילוק מלא של הקרישים על פיסות בודדות של נייר סינון לח פורמלין לאחר הכביסה השנייה.עטפו את הקרישים בנייר הסינון והשתמשו בסט סיכות כדי למקם את המטליות בקלטות טישו בודדות במרכז ארבע פיסות נייר לחות פורמלין אחרות. לאחר מכן הכניסו את קלטות הטישו לצנצנות זכוכית המכילות 50 מיליליטר פורמלין חוצץ לקיבוע פורמלין למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר העמיסו את הקסטות למעבד טישו להסרת מים למשך הלילה ומיזוג תאים קבוע.לפחות שעה לפני סיום הליך העיבוד, הפעל תחנת הטבעה מחוממת כדי להמיס את הפרפין. כאשר תחנת ההטבעה והקריש מוכנים, יש לאשר את נוכחותו של פרפין מותך בתבנית המתכת ולהעביר קריש תאים שנוצר לתוך הפרפין. הכניסו קלטת טישו חדשה ללא המכסה לתבנית המתכת וכסו את הקסטה בפרפין מותך יותר.תנו לפרפין להתמצק בצלחת קרה למשך 30 עד 60 שניות. לאחר מכן הפרד את קלטת הרקמות מתבנית המתכת. כדי להכין חלקים לניתוח אימונוציטוכימי, אתר את קריש התא בגוש תא פרפין אחד והשתמש במיקרוטום כדי לחתוך את הבלוק לפרוסות בעובי של שלושה עד ארבעה מיקרומטר.מניחים קטעי פרפין על שקופיות זכוכית מצופות מלח ומכניסים את השקופיות לתנור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כאשר החלקים נדבקו לשקופיות, הסר את הפרפין מהשקופיות ב -15 מיליליטר קסילן למשך ארבע דקות ולאחר מכן ייבוש החלקים עם דגירות אתנול יורדות של שתי דקות ברצף. לאחר הדגירה של 80% אתנול, שטפו את החלקים במים זורמים למשך 10 דקות והרתיחו את השקופיות בצנצנת המכילה 40 מיליליטר של מאגר אחזור tris-EDTA למשך 30 דקות.בתום הדגירה יש לשטוף את המגלשות שנאספו באנטיגן מתחת למים זורמים ולאחר מכן דגירה של 10 דקות באתנול 95% בארבע מעלות צלזיוס. לאחר ייבוש באוויר, השתמש בעט הידרופובי כדי להקיף את אזור צביעת התאים בכל שקופית. שטפו את המגלשות ב-TBS-T ולאחר מכן דגירה בבלוק מי חמצן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר כל פעילות פרוקסידאז שנותרה.שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-TBS-T למשך שתי דקות כל שטיפה, ולאחר מכן סמנו את החלקים ב-100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית מערכת הכתמים האימונוציטוכימית המעניינת למשך שעה אחת ואחריה חמש שטיפות TBS-T של שתי דקות. לאחר הכביסה האחרונה, דגרו את השקופיות במשפר נוגדנים ראשוני מהערכה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בתום הדגירה יש לשטוף את החלקים ארבע פעמים ב-TBS-T ולהוסיף כ-200 מיקרוליטר של נוגדן משני המסומן בחזרת פרוקסידאז לאחר השטיפה האחרונה למשך 30 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.שטפו את החלקים המשופרים חמש פעמים ב-TBS-T טרי ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת דיאמינובנזידין לכל קטע למשך שלוש דקות. שטפו את השקופיות פעמיים ב-TBS-T וסמנו את החלקים ב-100 מיקרוליטר תמיסת המטוקסילין למשך דקה אחת. לאחר מכן שטפו את המגלשות פעם נוספת ב-TBS-T ודגרו את המגלשות ב-95% אתנול למשך שתי דקות ולאחר מכן טבילה אחת באתנול טרי 95% ושתי טבילות ב-100% אתנול.דגרו את החלקים המיובשים באתנול ב-40 מיליליטר קסילן בצנצנת זכוכית למשך חמש דקות והניחו לשקופיות להתייבש באוויר. לאחר מכן הרכיבו פתק כיסוי על כל שקופית והתבוננו בדגימות תחת מיקרוסקופ אור. צביעת המטוקסילין ואאוזין של הרקמה המוטבעת בפרפין, כפי שהודגם זה עתה, מתגלה בעיקר בגרעיני טאקט וציטופלזמה, מה שמרמז על שימור מורפולוגי מצוין של דגימות התאים בשיטה זו.גושי תאים מוכנים בצורה גרועה, לעומת זאת, מציגים מורפולוגיה גרועה ותיוג לא סדיר גם אם הדגימות מוכתמות כראוי. חלבון 2 הקשור לשלד הציטולוגי נצפה בדרך כלל בתוך הכרומטין המרוכז, הציר המיטוטי והציטופלזמה. רק התאים עם חלבון הקשור לשלד הציטו שני צביעה בכרומטין המעובה הם תאים מיטוטיים ואילו מעט תאים חיוביים הקשורים לשלד הציטו נמצאים בתוך אוכלוסיית תרבית תאי HeLa הרעבה בסרום.רוב תאי ה-HeLa המיטוטיים מאוד הם גם חיוביים ל-Ki-67 וצביעה של Ki-67 נראית בגרעיני התא. רק כמחצית מתאי ה-HeLa הרעבים בסרום מבטאים את סמן ההתפשטות הזה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי.בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לדלל את התאים לצפיפות מתאימה ליצירת קריש דם טוב. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטה אחרת כמו ניתוח זרימה ציטומטרי של התאים הקבועים כדי לענות על שאלה נוספת לגבי שלב מחזור התא במהלך הסנכרון. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לעתיד בתחום הפתולוגיה של הכבד לחקור פרופיל ביטוי בקו התאים תוך שימור מידע מורפולוגי בתאים מתורבתים.לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע אימונוציטוכימיה ולהכין בלוקים של טרומבופלסטין בפלזמה מהתאים המתורבתים. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים מסוכנים כמו קסילן עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.

determination-protein-expression-level-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כאן אנו מתארים שיטה לכמת הטרוגניות מולקולרית בסעיפים היסטולוגית של חומר הגידול באמצעות immunofluorescence כמותיים, ניתוח תמונה, מדד סטטיסטי של הטרוגניות. השיטה מיועדת לשימוש בפיתוח סמן ביולוגי ניתוח קליני.

הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

סרטון זה מדגים שיטה לניטור חלבון תא נגוע 0, ICP0 סחר בזיהום הרפס סימפלקס-1. לאחר סינתזת נובו, ICP0 עובר טרנסלוקציה לגרעין, ומאוחר יותר עובר לציטופלסמה במהלך התקדמות הזיהום. מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי חושף ומנתח את הלוקליזציה התת-תאית של החלבון, ומציע תובנות לגבי הסחר שלו לאורך שלבי זיהום.

טכניקת אימונופלואורסנציה ללוקליזציה של חלבונים נגיפיים בתאים נגועים

כאן, פותחה בדיקת פלואורסצנציה כמותית חדשה כדי למדוד שינויים ברמת חלבון במיוחד בצנטרוזומים על ידי נורמליזציה של עוצמת הקרינה של החלבון לזו של תקן פנימי מתאים.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה להערכת לוקליזציה וביטוי של חלבונים בתוך רקמות. שיטות אוטומטיות למחצה לכימות מציגות סובייקטיביות ולעתים קרובות יוצרות תוצאות בלתי ניתנות לשחזור. כאן, אנו מתארים שיטות לאימונוהיסטוכימיה מרובה וכימות אובייקטיבי של ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית.

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.

Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.

הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

מוצג כאן פרוטוקול ליצירת בקרות כדוריות תאים קבועות בפורמלין, משובצות פרפין, לאימונוהיסטוכימיה.

עיבוד מתוקנן עבור בקרות אימונוהיסטוכימיה של כדוריות תאים קבועות בפורמלין, משובצות פרפין.

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Multiparameter פלואורסצנטי אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להעריך את המספר, הפצה יחסית, ולוקליזציה של אוכלוסיות תאים החיסון microenvironment הגידול. כתב היד מתאר את השימוש בטכניקה זו כדי לנתח תת-תאים של תאי T בסרטן הלוע.

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

למד ניתוח immunocytochemistry לסמני התמדה בתאי HeLa תוך שימוש בבלוקי תאים מוטבעי פרפין. שיטה זו מציעה פשטות טכנית לצד שימור מורפולוגי מצוין של הדגימות.

קביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים בתרבית על ידי Immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע

גלה סרטונים נוספים