קביעת יעילות ההזדווגות של הפלואידים ב-Saccharomyces cerevisiae

פרוטוקול זה הוא שיטה פשוטה לכמת את היעילות שבה זנים ומינים שונים של שמרים מזדווגים זה עם זה. השיטה המוצעת היא פשוטה, חזקה ויעילה. השיטה יכולה להיות מורחבת לכל זן של שמרים.

השיטה המתוארת במחקר זה יכולה לשמש כדי להבין כיצד מתרחשת התמיינות בשמרים. יתר על כן, הזנים שאנו מתארים יכולים להיות שימושיים במיוחד לתכנון ניסויים עם זרימת גנים. כוחה של השיטה הוא שהיא ממש פשוטה.

ייתכן שיהיה צורך בהתאמות קלות כמו זמן הדגירה בהתאם לזן המסוים שבו משתמשים. התחילו להחיות את הפלואידים A ואלפא מחומרים קפואים על ידי מריחת השמרים על תמצית שמרים, פפטון דקסטרוז, או צלחת אגר YPD. אפשרו להם לגדול במשך 48 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי להשיג מושבות בודדות.

לאחר הדגירה, יש לחסן מושבות בודדות מצלחת YPD וחמישה מיליליטר של תווך YPD, ולדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות עם טלטול של 250 סל"ד. התאים נמצאים בשלב נייח של צמיחה לאחר תקופת דגירה זו. על לוח YPD טרי, ציירו רשת יעילות הזדווגות כמלבן בגודל 1 על 1.5 ס"מ המחולק לשלוש קופסאות, כל אחת בממד של 1 על 0.5 סנטימטר.

יש לחסן חמישה מיקרוליטרים של תרבית YPD של שני סוגי ההזדווגות במלבנים השמאלי והימני ביותר. נפח זה מתאים בערך 5 כפול 10 לתאים הפלואידים החמישיים בכל קטע. לדגור על הצלחות במשך 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס.

כדי לערבב מספר שווה של תאי שמרים, הסירו כ-1/3 מצמיחת השמרים שהתפתחו בקופסאות החיצוניות באמצעות קיסם סטרילי והשהו מחדש את התאים שהוסרו ב-20 מיקרוליטר מים בבקבוקון סטרילי של 1.5 מיליליטר. בצע את זה עבור כל haploid. לאחר מכן, לדלל חמישה מיקרוליטר של תרחיף זה בשני מיליליטר מים ולמדוד את הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטר ב 600 ננומטר.

בהתבסס על ערך הצפיפות האופטית ומספר התאים למיליליטר בצפיפות אופטית אחת, הוסף את הנפחים הדרושים של שני הפלואידים בבקבוקון טרי וסטרילי של 1.5 מיליליטר. מערבבים היטב באמצעות פיפטה. הנפח הסופי של תרחיף זה הוא בדרך כלל סביב שישה עד שמונה מיקרוליטר.

לאחר מכן, לחסן את המתלה הזה ברשת המרכזית. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במשך שבע שעות, ומאפשרים להפלואידים להזדווג. לאחר שבע שעות של דגירה, מגרדים את התאים מהמלבן המרכזי באמצעות קיסם או קצה פיפטה ומדוללים בשני מיליליטר מים סטריליים.

בצע דילולים נוספים, ולאחר מכן להפיץ את תרחיף התא על אגר YPD כדי להשיג מושבות בודדות. לאחר הציפוי, דוגרים על לוחות YPD בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 36 עד 48 שעות כדי לפתח מושבות בודדות. ודא כי כמה מאות מושבות בודדות מתקבלות מכל ניסוי הזדווגות לסינון כדי להבטיח את המובהקות הסטטיסטית של הנתונים.

כדי לזהות את המושבות הדיפלואידיות על הצלחת, העבירו את המושבות הבודדות על ידי הדבקתן בנפרד על צלחת נשירה כפולה, חסרות את חומצות האמינו שהזנים הם אוקסוטרופיים עבורן. דוגרים על הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ומחשבים את יעילות ההזדווגות, nu. חוסנו של הפרוטוקול איפשר בידול קל של יעילות ההזדווגות בין שני הזנים, SK1AM ו-ScAM.

בעוד זני SK1 הזדווגו עם יעילות גבוהה מאוד, זני ScAM הזדווגו עם יעילות נמוכה יחסית. יעילות ההזדווגות של זני ScAM ירדה משמעותית כאשר הסביבה לא הכילה גלוקוז כמקור פחמן עיקרי, מה שמצביע על כך שהזדווגות היא תהליך יקר מבחינה אנרגטית וצמיחה על מקורות פחמן חלופיים מפחיתה איכותית את יעילות ההזדווגות. כאשר הותר להם להזדווג לפרקי זמן שונים, לא נצפתה הזדווגות במשך ארבע עד חמש השעות הראשונות.

הדיפלואידים הראשונים הופיעו רק לאחר ארבע עד חמש שעות, מה שמצביע על כך שזהו הזמן הדרוש להשלמת תהליך ההזדווגות בסביבה הנתונה. לאחר מכן, יעילות ההזדווגות גדלה במהירות. מעבר לשבע שעות, חישובי יעילות ההזדווגות הושפעו מהעובדה שהצמיחה המיטוטית החלה על הצלחת.

ודא כי מספר שווה של שני haploids מעורבים. סטיות מכך יובילו לשינויים בחזרות בלתי תלויות של הפרוטוקול. כיצד זרימת גנים משפיעה על הסתגלות ואפיון היא שאלה פתוחה.

מאחר שהסמנים האוקסוטרופיים מוכנסים ליד מוקד ה-MAT בזנים שלנו, זה עוזר לענות על שאלה חשובה זו.