מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לנטר את כל תהליך הרבייה המינית בשמרי ביקוע על ידי מיקרוסקופ אור. שיטה זו מתארת הכנת תאי שמרי ביקוע להדמיית זמן-lapse של שלבים שונים במחזור החיים המיני, כגון בחירת בן זוג להזדווגות, גידול מקוטב, איחוי תאים-תאים, מיוזה ונבגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הדמיה של תא בודד וכך מתגברת על הבעיה שתאים אינם נכנסים להתמיינות מינית באופן סינכרוני.

שיטה זו פשוטה מאוד, אך ההדגמה החזותית שימושית כדי להראות כיצד להרכיב מספר זנים במקביל למיקרוסקופיה. תדגים את ההליך עם הדוקטורנטית שלי אומאיה דודין, תהיה לורה מרליני, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. ישנן מספר וריאציות לפרוטוקול זה שניתן להתאים לחקר שלבים שונים של מחזור החיים המיני, תוך שימוש בזנים הומוטליים או הטרוטליים.

בהדגמה זו ייעשה שימוש בזני H90 הומוטליים. בזנים אלה, החלפת סוג ההזדווגות מתרחשת במהלך החלוקה המיטוטית האחרונה לאחר מחסור בחנקן, וכתוצאה מכך תערובת של שני סוגי ההזדווגות. בערב, יומיים לפני ניסוי ההזדווגות, יש לחסן זנים מפוספסים טריים מחומר מוצק לתוך צינורות תרבית המכילים 3 מיליליטר של מדיום נבגים מינימלי עם חנקן או MSL בתוספת N.Incubate למשך הלילה עם טלטול ב-25 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, במידת הצורך, יש לדלל את תרחיפי התאים ב-MSL פלוס N כדי להבטיח צמיחה אקספוננציאלית לאורך כל היום. בערב, יש למדוד את הצפיפות האופטית ולדלל את התאים ב-20 מיליליטר של MSL פלוס N בצלוחיות של 100 מיליליטר לצפיפות אופטית של 025 תרביות תאים מסוג פרא אמורות להגיע לצפיפות אופטית 600 של כ-8 בבוקר שלמחרת. לכן יש להתאים את הדילול בהתאם, אם עובדים עם זנים עם זמני ייצור ארוכים יותר.

דגרו על התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת בבוקר, מדוד את הצפיפות האופטית כדי לוודא שלכל תרבית יש צפיפות אופטית 600 בסביבות 8. גלול את התאים ב-1000 x גרם למשך דקה אחת והעביר אותו לצינור של 1.5 מיליליטר.

שטפו את התאים שלוש פעמים ב-1 מיליליטר של מדיום נבגים מינימלי ללא חנקן או MSL מינוס N.לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את התאים ב-3 מיליליטר של MSL מינוס N מדיום. מדוד את הצפיפות האופטית ודלל את התאים לצפיפות אופטית 600 של 1.5. כדי להתחיל בהכנת רפידות אגרוז, יש להמיס תחילה אליקווט של MSL מינוס N אגרוז 2 אחוז בגוש חום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות.

בינתיים, גלולה 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים שהוכנה קודם לכן ב -1000 x גרם למשך דקה אחת. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים בשאריות של 2 עד 4 מיקרוליטר של מדיום. כשהתאים ממתינים על הספסל, הוסיפו 200 מיקרוליטר מהמדיום המומס על מגלשת זכוכית בין שני מרווחים.

מניחים בעדינות שקופית נוספת על גבי האגר המומס. לאחר שהאגרוז התמצק, הסר בזהירות את המרווחים. כדי להסיר את מגלשת הזכוכית העליונה, סובב בעדינות ומשוך אותה הצידה.

אם יש לצלם מספר זנים בו זמנית, ניתן לחלק את הרפידה לארבע רפידות מיני. לשם כך, השתמש בסכין גילוח ופצל את הכרית באמצעו תוך משיכת החלקים כמילימטר הצידה וחזור בכיוון הניצב. מוסיפים 1 מיקרוליטר תאים לכרית האגרוז וממתינים כדקה.

מכסים את התאים בתלוש כיסוי ואוטמים את כל ההיקף של החלקת הכיסוי עם VELAP מחומם. חשוב לאטום את כל החלקת הכיסוי כדי למנוע התייבשות של הכרית. הניחו לכרית לשבת לפחות 30 דקות לפני ההדמיה.

כדי להבטיח את הצלחת הפרוטוקול, ויעילות הזדווגות גבוהה, יש לשמור על התאים בצמיחה אקספוננציאלית עד לרעב החנקן ולהרכיב אותם ללא עודף נוזלים כך שהם נייחים על כרית האגרוז. הדמיית תאים חיים של תאי השמרים המזדווגים מבוצעת לאחר מכן ב-25 מעלות צלזיוס, או בטמפרטורת החדר, בהתאם להליך המתואר בטקסט הפרוטוקול. הדמיית זמן-lapse מאפשרת הדמיה של תאים העוברים shmooing, היתוך ונבגים ב-24 השעות שלאחר רעב החנקן.

תהליך זה מודגם בסרט מייצג זה על ידי שני התאים המוגדלים בכניסה השמאלית התחתונה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לניטור הדינמיקה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית בתאים מזדווגים. כאן, זן H הטרוטליק המבטא myo52 המתויג ב-3GFP הוצמד לזן H+הטרוטליק המבטא myo52 התמזג לחלבון tdTomato הפלואורסצנטי האדום, כמו גם GFP ציטוזולי.

ה-GFP הציטוזולי מאפשר ניטור של תזמון האיחוי, המוצג על ידי כניסתו לתא H. תמונות זמן-lapse אלה מראות כי myo52 נוצר בתחילה לאזורים דינמיים בכל קליפת התא. אות Myo52 התייצב אז במוקד יחיד ממש לפני אירוע ההיתוך.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין תאים להזדווגות יעילה ולחקירת תאים חיים של תהליך ההזדווגות של שמרי ביקוע.