ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה פלואורסצנטית עם ספקטרומטריית מסה פוסטיוניזציה המושרה בלייזר של תאים עצביים בודדים של חולדה
23 במאי 2025
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוMS לספקטרומטריית מסה MALDI-2 חד-תאית מונחית פלואורסצנטית, המאפשרת פרופיל מולקולרי משופר של תאי עצב ראשוניים של חולדות.
המחקר שלנו מתמקד בפיתוח תהליכי עבודה של ספקטרומטריית מסה MALDI חד-תאית בתפוקה גבוהה, מונחי תמונה, כדי לחשוף הטרוגניות תאית ולקשר את הפרופילים המולקולריים לזהות התא, התפקוד והתגובה במערכות מורכבות.
מכשור מתקדם, כגון MALDI-2 וספקטרומטרי מסה ברזולוציה מרחבית גבוהה, מאפשרים ניתוח ממוקד ונפתר מרחבית של תאים בודדים, משפרים את הרגישות ומרחיבים את היקף הפרופיל המולקולרי ברקמות מורכבות. האתגרים הנוכחיים כוללים רגישות מוגבלת, יכולת שחזור בין דגימות וניתוח נתונים מורכבים. נתוני MALDI הם לרוב דלילים ומערכי נתונים גדולים עם אלפי תאים ומאות מולקולות דורשים כלים חישוביים חזקים.
פרוטוקול זה מטפל בפער בשיטות בעלות תפוקה גבוהה לניתוח תאים בודדים ואפילו אברונים, ומאפשר מחקרים מפורטים מאוד של הטרוגניות וקבלת תובנות לגבי הביולוגיה והתפקוד המולקולרי והתאי.
פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ממוקד מהיר של תאים המפוזרים על פני השקופית, מבטל את הצורך במניפולציה של תאים או סריקה בשטח מלא ומגדיל משמעותית את התפוקה.
[קריין] כדי להתחיל, שטפו כל שקופית בשניים עד שלושה מיליליטר של אמוניום אצטט 150 מילי-מולרי כדי להסיר גבישי גליצרול ומלח שעלולים להפריע ליישום מיקרוסקופיה ומטריצת MALDI, ולאחר מכן יבשו את השקופיות תחת זרם עדין של חנקן או אפשרו להן להתייבש לחלוטין באוויר. טען את השקופית המיובשת לתוך שלב המיקרוסקופ. מקד את המיקרוסקופ באמצעות לפחות 10 נקודות תמיכה המפוזרות באופן שווה על פני כל השקופית. באמצעות מסננים המתאימים ל-DAPI והדמיית שדה בהיר, רכוש תמונת פלואורסצנטיות מרוצפת של השקופית כולה בהגדלה של פי 5 עד פי 10, וודא שהסמנים הנאמנים בשקופיות המיקרוסקופיה נלכדים בבירור בתמונה. תפר את התמונות המרוצפות באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה, כגון ZEN ZEISS. ודא שהאריחים הסמוכים אנכית אינם מוסטים. עבדו וייצאו כל תמונה תפורה כקובץ BigTIFF באמצעות תוכנת המיקרוסקופיה או כ-TIFF רגיל אם גודל התמונה הסופי קטן משני ג'יגה-בייט. ממיסים 20 מיליגרם של 2,5-דיהידרוקסיאצטופנון ב -1.5 מיליליטר אצטון. הנח את השקופיות לתוך המחזיק של תא הסובלימציה, ולאחר מכן הנח את המחזיק במנגנון הסובלימציה. יש לזרוק את תמיסת המטריצה המומסת על פרוסת הקרמיקה ולאפשר לאצטון להתאדות לחלוטין, ואז לסגור את תא הסובלימציה כדי לאטום אותו. מלאו את תא נוזל הקירור ברפש מי קרח והניחו אותו היטב על גבי תא הסובלימציה. הפעל את משאבת הוואקום ואפשר למערכת להתאזן למשך חמש דקות. התחל את הסובלימציה על ידי חימום החדר ל -200 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, הסר את אמבט מי הקרח מהתא. סובב את הטמפרטורה ל-25 מעלות צלזיוס והנח גוף קירור על גבי החדר. אוורור לאט את תא הסובלימציה כדי לשחרר לחץ. פתח את החדר והסר בזהירות את השקופיות. פתח את MicroMS והשמיד את תמונות המיקרוסקופיה של BigTIFF באמצעות אפשרות קבוצת התמונות כדי להתאים הן לערוצי שדה בהיר והן לערוצי פלואורסצנטיות. נווט אל הכלי אפשרויות Blob והתאם את גודל ה- Blob המרבי והמינימלי כדי להגדיר את טווח הגודל המקובל של Blob. הגדר את הסף של ערוץ הקרינה לזיהוי כתמים. ציין את ערך המעגליות כדי להגדיר עד כמה התאים המזוהים צריכים להיות מעגליים לצורך שיקול, ובחר את הצבע. השתמש באפשרות חיפוש Blob כדי לזהות Blob. כאשר תתבקש, שמור את רשימת ה- Blob תחת שם רצוי. השתמשו בכלי Distance Filter לקביעת המרחק המינימלי בין כל תא. בדוק את השגיאה באמצעות נקודות בדיקה כדי לקבוע במדויק את שגיאת ההיסט. טען את השקופיות לתוך המכשיר באמצעות MTP Slide Adapter II. לאחר החזרה למחשב עם MicroMS, גש למחשב ספקטרומטר המסה באמצעות יישום שולחן עבודה מרוחק. אם אתה משתמש במכשיר בפעם הראשונה, ודא את מיקומו על ידי ניווט אל כלים, ולאחר מכן הגדרות מכשיר. בחלון המוקפץ, הצג את קבוצת הקואורדינטות עם מיקומי X ו-Y שלהן ובחר כל אחת מהנקודות הספציפיות הללו בגיאומטריה של Slide Adapter II. עדכן את מיקומי X ו-Y בחלון MicroMS. באמצעות פקדי המצלמה והבמה של ספקטרומטר המסה, נווט למיקום הניתן לזיהוי בקלות בשקופית והעתק את קואורדינטות המכשיר. ב-MicroMS, אתר את אותו מיקום בתמונת המיקרוסקופ, לחץ לחיצה ימנית והזן את הקואורדינטות לחלון המוקפץ. עגול את הקואורדינטות למספרים השלמים הקרובים ביותר והפרד ביניהן ברווח. לאחר הוספת שלוש נקודות רישום, אחד העיגולים יהפוך לאדום, מה שמצביע על כך שהוא הכי רחוק מההרשמה. מחק את נקודת הרישום באמצעות Control + לחיצה ימנית ונסה שוב. תחת קובץ, עבור אל שמור ולאחר מכן הרשמה כדי לשמור את קובץ הרישום. כאשר הכתמים גלויים בשקופית, עבור אל קובץ, שמור ולאחר מכן מיקומי מכשירים כדי לשמור את קובץ מיקום המכשיר, ולאחר מכן באמצעות תוכנת שולחן עבודה מרוחק, העבר קובץ זה למחשב המכשיר. פתח את ה-XEO המותאם אישית file והעתק את תוכנו ל-MTP Slide Adapter II. XEO במחשב המכשיר. שמור את הקובץ כדי לעדכן קובץ גיאומטריה זה במיקומי התאים. לחץ על הכרטיסייה אוטומציה ובחר חדש כדי ליצור הפעלה אוטומטית חדשה. גרור על-פני אזור הדגימה המוצג כדי לבחור את התאים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוסיף אותם לרשימת הניתוח. שמור את ההפעלה האוטומטית ולחץ על התחל הפעלה אוטומטית כדי להתחיל ברכישה. איור זה ממחיש כיצד פרופיל ספקטרומטריית מסה של תא בודד MALDI-2 חושף הטרוגניות תאית מבוססת שומנים על פני ובתוך אזורי מוח נפרדים. קירוב והקרנה אחידים של סעפת, או ניתוח UMAP, הפרידו תאים לפי אזור במוח, ויצרו אשכולות נפרדים עבור סטריאטום, היפוקמפוס וקליפת המוח. אשכול ליידן חשף ארבע תת-אוכלוסיות תאים מבוססות שומנים. בנוסף, נצפו חתימות ליפידים ספציפיות לאשכול, עם פרופילי עוצמה מובהקים על פני ליפידים מוערים. ספקטרום מסה משישה תאים בקליפת המוח הראה גם זיהוי שומנים עקבי על פני שקופיות. יתר על כן, תאים בקליפת המוח משקופיות שונות הראו התפלגות UMAP חופפת, מה שמעיד על השפעות אצווה מינימליות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לשימוש במיקרו-MS לצורך ספקטרומטריית מסה MALDI-2 מונחית פלואורסצנציה, לתא בודד, המעצימה פרופיל מולקולרי של תאי עצב ראשוניים של חולדה. המחקר שואף לטפל בהטרוגניות תאית ולקשר פרופילים מולקולריים לזהות ותפקוד תאיים בתוך רקמות מורכבות.
רכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדעי
- ספקטרומטריית מסה
- ביולוגיה תאית
רקע
- עבודות זרימה מונחות תמונה בתפוקה גבוהה מקלות על מחקרים של הטרוגניות תאית.
- ספקטרומטריית מסה MALDI-2 מתקדמת מאפשרת ניתוח ממופה מרחבית.
- האתגרים הנוכחיים כוללים ניתוח נתונים ובעיות רגישות.
- כלי חישוב חזקים נחוצים עבור מערכי נתונים גדולים.
מטרת המחקר
- לשפר שיטות בתפוקה גבוהה לניתוח תאים בודדים.
- לקשר נתונים מולקולריים לזהות ותפקוד תאי.
- להעצים תובנות לגבי הביולוגיה של מערכות עצביות מורכבות.
שיטות ששימשו
- הפרוטוקול משתמש בספקטרומטריית מסה MALDI-2 לתא בודד לניתוח.
- המודל העיקרי מורכב מתאי עצב ראשוניים של חולדה.
- השלבים כוללים הכנת שקף, סובלימציה של מטריצה וניתוח בלוב לזיהוי תאים.
- רכישת תמונה מיקרוסקופית מפורטת ורישום חישובי הם קריטיים.
- עיבוד נתונים כולל תוכנה מותאמת אישית להעצמת תוצאות ספקטרומטריית מסה.
תוצאות עיקריות
- חשפו הטרוגניות תאית המבוססת על ליפידים בכל רחבי אזורי המוח.
- ניתוח UMAP הצליח לאשש תאים לפי אזור במוח.
- חתימות ליפידים ספציפיות לאשכול זוהו, תוך הדגשת פרופילים תאיים מובחנים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר וממוקד של תאי עצב ללא מניפולציות נרחבות.
- הממצאים מרחיבים את ההבנה של ביולוגיה מולקולרית ותאית במדעי העצבים.
- תובנות שנרכשו יכולות ליידע מחקרים עתידיים על תפקוד תאי ברקמות מורכבות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput, fluorescence-guided MALDI-2 mass spectrometry enables precise molecular profiling of individual neural cells, addressing the challenge of cellular heterogeneity in complex tissues. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular signatures to cell identity and function. The approach supports portfolio decisions by providing scalable, reproducible single-cell data critical for target validation and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular heterogeneity and molecular pathway mapping at single-cell resolution.
- Supports functional target validation by correlating molecular profiles with cell identity and region-specific biology.
- Facilitates predictive confidence in target selection through robust, high-content molecular data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible molecular outputs suitable for assay standardization.
- Reduces data size and increases throughput by targeting only cell locations, optimizing screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neural systems for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting cross-slide and cross-region reproducibility.
- Provides mechanistic de-risking through detailed lipid-based cellular subpopulation analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and translational research in neuroscience and related fields.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neural cell diversity and molecular function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in single-cell contexts.
- Analytics: Delivers high-content, spatially resolved molecular measurements for robust comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation with minimal batch effects.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for single-cell molecular profiling across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes high-throughput, reproducible single-cell analysis with reduced data burden.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, cross-sample molecular data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced mass spectrometry and fluorescence microscopy.
- Demands access to MALDI-2 instrumentation and computational infrastructure for data analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for image registration and data processing.
- Adaptable to various neural and potentially non-neural cell systems with appropriate validation.
- Data analysis complexity and reproducibility across samples are critical practical considerations.
