ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה פלואורסצנטית עם ספקטרומטריית מסה פוסטיוניזציה המושרה בלייזר של תאים עצביים בודדים של חולדה

המחקר שלנו מתמקד בפיתוח תהליכי עבודה של ספקטרומטריית מסה MALDI חד-תאית בתפוקה גבוהה, מונחי תמונה, כדי לחשוף הטרוגניות תאית ולקשר את הפרופילים המולקולריים לזהות התא, התפקוד והתגובה במערכות מורכבות.

מכשור מתקדם, כגון MALDI-2 וספקטרומטרי מסה ברזולוציה מרחבית גבוהה, מאפשרים ניתוח ממוקד ונפתר מרחבית של תאים בודדים, משפרים את הרגישות ומרחיבים את היקף הפרופיל המולקולרי ברקמות מורכבות. האתגרים הנוכחיים כוללים רגישות מוגבלת, יכולת שחזור בין דגימות וניתוח נתונים מורכבים. נתוני MALDI הם לרוב דלילים ומערכי נתונים גדולים עם אלפי תאים ומאות מולקולות דורשים כלים חישוביים חזקים.

פרוטוקול זה מטפל בפער בשיטות בעלות תפוקה גבוהה לניתוח תאים בודדים ואפילו אברונים, ומאפשר מחקרים מפורטים מאוד של הטרוגניות וקבלת תובנות לגבי הביולוגיה והתפקוד המולקולרי והתאי.

פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ממוקד מהיר של תאים המפוזרים על פני השקופית, מבטל את הצורך במניפולציה של תאים או סריקה בשטח מלא ומגדיל משמעותית את התפוקה.

[קריין] כדי להתחיל, שטפו כל שקופית בשניים עד שלושה מיליליטר של אמוניום אצטט 150 מילי-מולרי כדי להסיר גבישי גליצרול ומלח שעלולים להפריע ליישום מיקרוסקופיה ומטריצת MALDI, ולאחר מכן יבשו את השקופיות תחת זרם עדין של חנקן או אפשרו להן להתייבש לחלוטין באוויר. טען את השקופית המיובשת לתוך שלב המיקרוסקופ. מקד את המיקרוסקופ באמצעות לפחות 10 נקודות תמיכה המפוזרות באופן שווה על פני כל השקופית. באמצעות מסננים המתאימים ל-DAPI והדמיית שדה בהיר, רכוש תמונת פלואורסצנטיות מרוצפת של השקופית כולה בהגדלה של פי 5 עד פי 10, וודא שהסמנים הנאמנים בשקופיות המיקרוסקופיה נלכדים בבירור בתמונה. תפר את התמונות המרוצפות באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה, כגון ZEN ZEISS. ודא שהאריחים הסמוכים אנכית אינם מוסטים. עבדו וייצאו כל תמונה תפורה כקובץ BigTIFF באמצעות תוכנת המיקרוסקופיה או כ-TIFF רגיל אם גודל התמונה הסופי קטן משני ג'יגה-בייט. ממיסים 20 מיליגרם של 2,5-דיהידרוקסיאצטופנון ב -1.5 מיליליטר אצטון. הנח את השקופיות לתוך המחזיק של תא הסובלימציה, ולאחר מכן הנח את המחזיק במנגנון הסובלימציה. יש לזרוק את תמיסת המטריצה המומסת על פרוסת הקרמיקה ולאפשר לאצטון להתאדות לחלוטין, ואז לסגור את תא הסובלימציה כדי לאטום אותו. מלאו את תא נוזל הקירור ברפש מי קרח והניחו אותו היטב על גבי תא הסובלימציה. הפעל את משאבת הוואקום ואפשר למערכת להתאזן למשך חמש דקות. התחל את הסובלימציה על ידי חימום החדר ל -200 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, הסר את אמבט מי הקרח מהתא. סובב את הטמפרטורה ל-25 מעלות צלזיוס והנח גוף קירור על גבי החדר. אוורור לאט את תא הסובלימציה כדי לשחרר לחץ. פתח את החדר והסר בזהירות את השקופיות. פתח את MicroMS והשמיד את תמונות המיקרוסקופיה של BigTIFF באמצעות אפשרות קבוצת התמונות כדי להתאים הן לערוצי שדה בהיר והן לערוצי פלואורסצנטיות. נווט אל הכלי אפשרויות Blob והתאם את גודל ה- Blob המרבי והמינימלי כדי להגדיר את טווח הגודל המקובל של Blob. הגדר את הסף של ערוץ הקרינה לזיהוי כתמים. ציין את ערך המעגליות כדי להגדיר עד כמה התאים המזוהים צריכים להיות מעגליים לצורך שיקול, ובחר את הצבע. השתמש באפשרות חיפוש Blob כדי לזהות Blob. כאשר תתבקש, שמור את רשימת ה- Blob תחת שם רצוי. השתמשו בכלי Distance Filter לקביעת המרחק המינימלי בין כל תא. בדוק את השגיאה באמצעות נקודות בדיקה כדי לקבוע במדויק את שגיאת ההיסט. טען את השקופיות לתוך המכשיר באמצעות MTP Slide Adapter II. לאחר החזרה למחשב עם MicroMS, גש למחשב ספקטרומטר המסה באמצעות יישום שולחן עבודה מרוחק. אם אתה משתמש במכשיר בפעם הראשונה, ודא את מיקומו על ידי ניווט אל כלים, ולאחר מכן הגדרות מכשיר. בחלון המוקפץ, הצג את קבוצת הקואורדינטות עם מיקומי X ו-Y שלהן ובחר כל אחת מהנקודות הספציפיות הללו בגיאומטריה של Slide Adapter II. עדכן את מיקומי X ו-Y בחלון MicroMS. באמצעות פקדי המצלמה והבמה של ספקטרומטר המסה, נווט למיקום הניתן לזיהוי בקלות בשקופית והעתק את קואורדינטות המכשיר. ב-MicroMS, אתר את אותו מיקום בתמונת המיקרוסקופ, לחץ לחיצה ימנית והזן את הקואורדינטות לחלון המוקפץ. עגול את הקואורדינטות למספרים השלמים הקרובים ביותר והפרד ביניהן ברווח. לאחר הוספת שלוש נקודות רישום, אחד העיגולים יהפוך לאדום, מה שמצביע על כך שהוא הכי רחוק מההרשמה. מחק את נקודת הרישום באמצעות Control + לחיצה ימנית ונסה שוב. תחת קובץ, עבור אל שמור ולאחר מכן הרשמה כדי לשמור את קובץ הרישום. כאשר הכתמים גלויים בשקופית, עבור אל קובץ, שמור ולאחר מכן מיקומי מכשירים כדי לשמור את קובץ מיקום המכשיר, ולאחר מכן באמצעות תוכנת שולחן עבודה מרוחק, העבר קובץ זה למחשב המכשיר. פתח את ה-XEO המותאם אישית file והעתק את תוכנו ל-MTP Slide Adapter II. XEO במחשב המכשיר. שמור את הקובץ כדי לעדכן קובץ גיאומטריה זה במיקומי התאים. לחץ על הכרטיסייה אוטומציה ובחר חדש כדי ליצור הפעלה אוטומטית חדשה. גרור על-פני אזור הדגימה המוצג כדי לבחור את התאים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוסיף אותם לרשימת הניתוח. שמור את ההפעלה האוטומטית ולחץ על התחל הפעלה אוטומטית כדי להתחיל ברכישה. איור זה ממחיש כיצד פרופיל ספקטרומטריית מסה של תא בודד MALDI-2 חושף הטרוגניות תאית מבוססת שומנים על פני ובתוך אזורי מוח נפרדים. קירוב והקרנה אחידים של סעפת, או ניתוח UMAP, הפרידו תאים לפי אזור במוח, ויצרו אשכולות נפרדים עבור סטריאטום, היפוקמפוס וקליפת המוח. אשכול ליידן חשף ארבע תת-אוכלוסיות תאים מבוססות שומנים. בנוסף, נצפו חתימות ליפידים ספציפיות לאשכול, עם פרופילי עוצמה מובהקים על פני ליפידים מוערים. ספקטרום מסה משישה תאים בקליפת המוח הראה גם זיהוי שומנים עקבי על פני שקופיות. יתר על כן, תאים בקליפת המוח משקופיות שונות הראו התפלגות UMAP חופפת, מה שמעיד על השפעות אצווה מינימליות.