Name: הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: חקור הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה באמצעות ניקוי אופטי וסימון אימונולוגי. השיטה חושפת שכבות נוירונליות וחיבורים תאיים ברזולוציה תלת-ממדית לחקר מחלות רשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנת נוגדנים משניים פלואורסצנטיים בהתאמה אישית
הערה: גישה זו משמשת כחלופה לשימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מסחריים (ראה דיון על היתרונות של הכנת נוגדנים משניים פלואורסצנטיים). יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לצימוד פלואורופורים לנוגדנים ראשוניים במקרה שיש לבצע אימונופלואורסצנציה ישירה והנוגדן הראשוני הפלואורסצנטי אינו זמין מסחרית. שליטה ביחס הפלואורופור לנוגדנים על ידי התאמת כמות הפלואורופור בתגובת התיוג מייצרת נוגדנים מצומדים בהירים יותר. עם זאת, נוגדנים משניים בהתאמה אישית הם פחות יציבים, וריכוז המצומד שנוצר נמוך פי 10 מזה של הנוגדנים הפלואורסצנטיים המסחריים. פרוטוקול זה מותאם מהעבודה שתוארה על ידי Bálint et al9.
<ol>
	<li>ממיסים 1 מ"ג מהפלואורופור ב-DMSO נטול מים ומכניסים לצינורות לקבלת 0.02 מ"ג אחרון של פלואורופור לכל צינור. הסר את כל ה-DMSO באמצעות רכז ואקום מהיר, הפועל במשך שעה ו-30 דקות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. עבור Alexa Fluor 405, H2O טהור במיוחד הוא הממס המתאים להכנת מכסים.</li>
	<li>לביצוע תגובת התיוג, יש להמיס כמות אחת של הפלואורופור ב-1-10 מיקרוליטר של DMSO (או H2O טהור במיוחד עבור Alexa Fluor 405). הערה: הכמות המדויקת של DMSO נקבעת באמצעות בדיקות צימוד בקרה קודמות. בדיקות אלו מבוצעות כאשר יש להשתמש באצווה חדשה של פלואורופור (או כאשר נגמרת אצווה קודמת של פלואורופור), או כאשר נעשה שימוש בפלואורופור חדש בפעם הראשונה בצימוד. בדיקת צימוד הבקרה כוללת ביצוע תגובות תיוג עם כמויות משתנות של פלואורופור כדי לקבוע את היחס האופטימלי בין פלואורופור לנוגדנים במצומד. במקרה שלנו, היחס האופטימלי נופל בדרך כלל בין 3 μL ל-5 μL.</li>
	<li>דגירה של 50 מיקרוליטר של IgG משני (או ראשוני), 6 מיקרוליטר של 1 M NaHCO3 ו-1-5 מיקרוליטר של פלואורופור למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על פלטפורמת נדנדה, מוגנת מפני אור.</li>
	<li>בזמן שהתגובה מתקדמת, הכן את עמודות אי הכללת גודל הטיהור על ידי הסרת המכסים שלה ומתן אפשרות למאגר לעבור. אזן את העמודה (אחת לכל תגובת תיוג) על ידי הפעלת 3 x 2-3 מ"ל של PBS דרך העמודה. במקרה ששלב שיווי המשקל האחרון מסתיים לפני סיום הדגירה, החזר את המכסים לאחור כדי למנוע התייבשות והמתן עד שתגובת התיוג תסתיים. הערה: עמודות אי הכללה של גודל טיהור פועלות לפי כוח הכבידה. וודאו שהעמוד לא יתייבש בכל רגע, אחרת תגובת הטיהור לא תפעל כראוי.</li>
	<li>כאשר התגובה מסתיימת (שלב 1.3), הוסף 140 מיקרוליטר של PBS לתגובת התיוג כדי להפוך את הנפח לכ-200 מיקרוליטר ולמערבל אותו. הוסף פתרון זה למרכז העמודה, אפשר לדגימה להיכנס לעמודה, ולאחר שהטיפה האחרונה נפלטה, דחוף על ידי הוספת 550 מיקרוליטר של PBS. כאשר הנוזל מפסיק ליפול, יש להוציא על ידי הוספת 300 מיקרוליטר PBS ולאסוף בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>חשב את ריכוז הנוגדנים ויחסי התיוג על ידי מדידת ספיגת הדגימה ב-280 ננומטר והספיגה של הפלואורופורים המשמשים. החל את חוק באר-למברט לקביעת הריכוז (במולריות) כדלקמן: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> כאשר A מייצג את הספיגה, ε את מקדם ההכחדה המולארית, ו-CF280 הוא מדד לספיגה שיש לפלואורופור הספציפי ב-280 ננומטר המשמש כגורם תיקון. לאחר מכן, ריכוז הנוגדן הוא: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> ויחס התיוג הוא: 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg"></li>
	<li>אחסן את הנוגדנים המסומנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור, עד 6 חודשים.</li>
</ol>
2. תיוג אימונופלואורסצנטי
<ol>
	<li>תקן את האורגנואידים עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-RT למשך 45 דקות. הערה: אופציונלי: דגירה על האורגנואידים עם תמיסת אחזור אנטיגן (שלבים 2.2 ו-2.3) כדי לשפר את התגובתיות החיסונית של האנטיגנים.</li>
	<li>הכן 40 מ"ל של תמיסת אחזור אנטיגן על ידי ערבוב של 0.117 מ"ג נתרן ציטראט טרי-בייסי דיהידראט ב-H2O טהור במיוחד והתאם ל-pH 9.</li>
	<li>דגרו את האורגנואידים עם תמיסת אחזור האנטיגן עם ניעור קל (30 סל"ד) ב-60 מעלות צלזיוס למשך שעה.</li>
	<li>לחדור את האורגנואידים עם PBST (PBS עם 1% Triton X-100) עם ניעור קל ב-RT למשך 4 שעות.</li>
	<li>יש לחסום את האורגנואידים באמצעות תמיסת חסימה (2% אלבומין בסרום בקר (BSA) עם 0.1% טריטון X-100) ב-RT למשך הלילה (או מעל יום אחד). הערה: ריכוזי הנוגדנים הראשוניים והמשניים תלויים בנוגדנים הספציפיים. עבור אימונופלואורסצנציה של דגימות שלמות, אנו משתמשים בריכוז גבוה יותר בהשוואה לדגימות חתוכות. אנו דוגרים על הנוגדן העיקרי ב-10 מיקרוגרם/מ"ל, אשר ברוב המקרים מתאים ל-1:100 מהמלאי (טבלה 1). אנו מדגרים את הנוגדנים המשניים שלנו בהתאמה אישית ב-20-50 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
	<li>דגרו על האורגנואידים עם הנוגדנים העיקריים המדוללים בתמיסת שטיפה (0.1% BSA עם 0.1% טריטון X-100) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יומיים עם טלטול קל.</li>
	<li>שטפו את האורגנואידים במשך 3 x 15 דקות בתמיסת כביסה עם ניעור קל ב-RT.</li>
	<li>דגרו על האורגנואידים עם הנוגדנים המשניים המדוללים בתמיסת כביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יומיים עם טלטול קל.</li>
	<li>שטפו את האורגנואידים במשך 3 x 15 דקות בתמיסת כביסה עם ניעור קל ב-RT. הערה: לאחר תיוג חיסוני, ניתן לדגור צבעים פלואורסצנטיים לבחירה. בדרך כלל אנו משתמשים בסמני גרעינים פלואורסצנטיים, כגון DAPI (1:1,000) ו-DRAQ5 (1:500), או פלואידין (1:100) להמחשת רשת חוטי האקטין.</li>
	<li>דגרו את האורגנואידים עם הצבעים הפלואורסצנטיים המדוללים בתמיסת כביסה ב-RT למשך שעה אחת עם ניעור קל.</li>
	<li>שטפו את האורגנואידים במשך 3 x 15 דקות בתמיסת כביסה עם ניעור קל ב-RT.</li>
</ol>
3. ניקוי אופטי עם FluoClear BABB
הערה: 1-פרופנול עלול לפגוע במיכלי פלסטיק, במיוחד לחשיפה ארוכת טווח. ליתר ביטחון, השתמש במכלי זכוכית.
<ol>
	<li>שלב התייבשות<ol>
		<li>הכן תמיסות 1-פרופנול ב-H2O טהור במיוחד באחוזים הנתונים (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) ולאחר מכן התאם ל-pH 9.5 עם טרימתילאמין. אזהרה: טריאתילאמין רעיל בשאיפה. עבדו מתחת למכסה אדים. ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסות אם הן מאוחסנות כראוי (מיכל אטום היטב). התאם את ה-pH לפני השימוש.</li>
		<li>דגרו את הדגימות עם השיפוע ההולך וגדל של תמיסות 1-פרופנול (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) למשך שעתיים כל אחת ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול קל.</li>
		<li>דגרו את הדגימות עם 100% 1-פרופנול למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול קל.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>שלב ניקוי זהירות: BABB היא תערובת ממס חזקה הידועה ביכולתה להמיס או לפגוע משמעותית בפלסטיק רבים. ליתר ביטחון, השתמש במכלי זכוכית עם מכסים תואמים ועבוד בתוך קולט אדים.<ol>
		<li>הכן את ה-BABB על ידי ערבוב בנזיל אלכוהול (BA) ובנזיל בנזואט (BB) ביחס של 1:2.</li>
		<li>טבלו את הדגימות ב-BABB ב-RT למשך הלילה.</li>
		<li>לפני ההדמיה, רענן את ה- BABB. הערה: עבור אורגנואידים בקוטר ~1 מ"מ, BABB גורם לאפקט ניקוי הניכר בעשרות דקות. בהתאם לגודל ואופי הדגימה, מידת הפינוי עשויה להיות שונה ו/או לדרוש זמן חשיפה ארוך יותר לתמיסת הפינוי. אנו ממליצים לרכוש תמונות לפני ואחרי טבילת BABB כדי לשפר את פרוטוקול הניקוי.</li>
		<li>אחסן דגימות מנוקות של BABB עם תמיסת BABB לטווח הארוך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להגן מפני אור כדי לשמר את הקרינה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. רכישת תמונה בהרכבה שלמה
<ol>
	<li>בעזרת פיפטה מזכוכית, מקם את האורגנואיד בצלחת פטרי עם תחתית זכוכית עם טיפת BABB. ודא שהדגימה נוגעת במשטח זכוכית הכיסוי. זהירות: הקפד שטיפת ה-BABB המכילה את הדגימה לא תבוא במגע עם קצוות הפלסטיק של המנה, אחרת היא תמיס את הפלסטיק, ותפגע בדגימה ובאיכות ההדמיה.</li>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך המצויד ביעדי הגדלה נמוכים וגבוהים, רכוש תמונות Z-stack כדי לקבל את התובנה התלת מימדית המלאה של הדגימה עם פירוט סלולרי. הערה: במחקר זה נעשה שימוש במטרה אווירית של 10x צמצם מספרי (NA) 0.4 ומטרה של 63x NA 1.4, עם גודל מדרגה של 3.5 מיקרומטר ו-1 מיקרומטר, בהתאמה.</li>
</ol>
5. עיבוד תמונה
<ol>
	<li>כייל מחדש את גודל הצעד של רכישת Z-stack בהתחשב באי-התאמה של מקדם השבירה (RI) בין תמיסת הסליקה למדיית הטבילה.<ol>
		<li>חשב את גודל הצעד המכויל מחדש באופן הבא: 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg"> עבור דגימה המוטמעת ב- BABB, שצולמה עם מטרת אוויר בגודל צעד של 3.5 מיקרומטר, היא תהיה כדלקמן: 
		<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"></li>
		<li>באמצעות ImageJ, שנה את עומק הווקסל (לחץ על תמונה | מאפיינים...) עבור גודל הצעד המחושב מחדש.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>צור הקרנות תמונה של מחסנית Z.<ol>
		<li>באמצעות ImageJ, בדוק את מחסנית ה-Z לעומק (לחץ על תמונה | ערימות | תצוגות אורתוגונליות). יופיעו תצוגות XY, XZ ו-YZ של האורגנואיד ברשתית.</li>
		<li>שמור את אזורי העניין הרצויים (לחץ על קובץ | שמור בשם...).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>צור הנפשה של הרינדור התלת-ממדי של Z-stack באמצעות תוכנת עיבוד (ראה טבלת החומרים).<ol>
		<li>בחר את הערוצים להמחשה על-ידי הפעלת תיבות הסימון שלהם.</li>
		<li>התאם את מישורי ה-Z כדי להמחיש את פנים הדגימה (הפעל חיתוך בתיבת הסימון).</li>
		<li>הקלט/י את ההנפשה באמצעות ״עורך הסרטים״ (הפעל/י את ״עורך הסרטים ״ בתיבת הסימון). גרור ושחרר, והגדל והקטן ישירות באמצעות העכבר. לחץ/י על ״הוסף ״ כדי לכלול קטע אחר עבור ההנפשה. אם אתה מכוון את מישורי ה-Z, הפעל את האפשרות Clip planes (לחץ על הגדרות... | סמן את התיבה Clip planes ).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. J., Jo, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+of+patients+with+inherited+retinal+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review.</a> Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).</li>
<li>Onyak, J. R., Vergara, M. N., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoid+light+responsivity%3A+Current+status+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal organoid light responsivity: Current status and future opportunities.</a> Trans Res. 250, 98-111 (2022).</li>
<li>O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+A+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: A window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), dev189746(2020).</li>
<li>Wahle, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+spatiotemporal+phenotyping+of+human+retinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multimodal spatiotemporal phenotyping of human retinal organoid development.</a> Nat Biotechnol. 41 (12), 1765-1775 (2023).</li>
<li>Isla-Magrané, H., Veiga, A., García-Arumí, J., Duarri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiocular+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+displayed+retinal%2C+corneal%2C+and+retinal+pigment+epithelium+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiocular organoids from human induced pluripotent stem cells displayed retinal, corneal, and retinal pigment epithelium lineages.</a> Stem Cell Res Ther. 12 (1), 581(2021).</li>
<li>Isla-Magrané, H., Zufiaurre-Seijo, M., García-Arumí, J., Duarri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+modulates+pigmentation%2C+neuroretinal+maturation%2C+and+corneal+transparency+in+human+multiocular+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid modulates pigmentation, neuroretinal maturation, and corneal transparency in human multiocular organoids.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 376(2022).</li>
<li>Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+across+multi-dimensional+space+of+tissue+clearing+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Navigating across multi-dimensional space of tissue clearing parameters.</a> Methods Appl Fluoresc. 9 (2), 022001(2021).</li>
<li>Brenna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tissue+clearing+associated+with+3D+imaging%3A+application+in+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical tissue clearing associated with 3D imaging: application in preclinical and clinical studies.</a> Histochem Cell Biol. 157 (5), 497(2022).</li>
<li>Bálint, Š, Verdeny Vilanova, I., Sandoval Álvarez, Á, Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live-cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (9), 3375-3380 (2013).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, D. -H., Zhang, J. -Y., Chen, N., Zhi, G. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+synthesis+of+bioactive+ethyl+cinnamate+by+enzymatic+esterification+of+cinnamic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">High-yield synthesis of bioactive ethyl cinnamate by enzymatic esterification of cinnamic acid.</a> Food Chem. 190, 629-633 (2016).</li>
<li>Schellinger, A. P., Carr, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility+of+buffers+in+aqueous-organic+eluents+for+reversed-phase+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22LCGC+North+America%22%5BJournal%5D)">Solubility of buffers in aqueous-organic eluents for reversed-phase liquid chromatography.</a> LCGC North America. 22 (6), 544(2004).</li>
<li>Jiang, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-III-Tubulin%3A+A+reliable+marker+for+retinal+ganglion+cell+labeling+in+experimental+models+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">β-III-Tubulin: A reliable marker for retinal ganglion cell labeling in experimental models of glaucoma.</a> Int J Ophthalmol. 8 (4), 643-652 (2015).</li>
<li>Guo, J., Walss‐Bass, C., Ludueña, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2+isotypes+of+tubulin+in+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The β isotypes of tubulin in neuronal differentiation.</a> Cytoskeleton. 67 (7), 431-441 (2010).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TuJ1+%28class+III+%CE%B2-tubulin%29+expression+suggests+dynamic+redistribution+of+follicular+dendritic+cells+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 453-459 (2005).</li>
<li>Fernando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+brain+and+retinal+organoids+from+confluent+cultures+of+pluripotent+stem+cells+connected+by+nerve-like+axonal+projections+of+optic+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Differentiation of brain and retinal organoids from confluent cultures of pluripotent stem cells connected by nerve-like axonal projections of optic origin.</a> Stem Cell Rep. 17 (6), 1476-1492 (2022).</li>
<li>Belecky-Adams, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax-6%2C+Prox+1%2C+and+Chx10+homeobox+gene+expression+correlates+with+phenotypic+fate+of+retinal+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 38 (7), 1293-1303 (1997).</li>
<li>Rowan, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+homeodomain+transcription+factor+Chx10+in+the+retina+using+a+novel+multifunctional+BAC+transgenic+mouse+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the homeodomain transcription factor Chx10 in the retina using a novel multifunctional BAC transgenic mouse reporter.</a> Dev Biol. 271 (2), 388-402 (2004).</li>
<li>Andilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tissue-mimic+with+light+sheet+microscopy%3A+A+comparative+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging tissue-mimic with light sheet microscopy: A comparative guideline.</a> Sci Rep. 7, 44939(2017).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Opt+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Adv Opt Photonics. 10, 111(2018).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Darche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+of+cleared+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes.</a> Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x NA0.40 אובייקט יבש</td><td>לייקה</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>63x NA1.40 מטרת שמן</td><td>לייקה</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>אבקם</td><td>אילן אלכסנדר</td><td>-</td></tr><tr><td>בנזיל אלכוהול (BA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>בנזיל בנזואט (BB)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>צלחת פטרי מזכוכית תחתונה</td><td>מטק</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>א7030</td><td>-</td></tr><tr><td>נוגדן Chx10</td><td>סטה קרוז ביוטק</td><td>SC-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>עמודי סינון ג'ל Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>תרמופישר</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>צבע (חומצה קרבוקסילית, אסתר סוקסינימידיל)</td><td>Invitrogen או Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>תמונהJ/פיג'י&nbsp;</td><td>ה-NIH</td><td>&nbsp; גרסה 1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך</td><td>מיקרו-מערכות של Leica</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תלת מימד LAS X</td><td>מיקרו-מערכות של Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>מים אולטרה-טהורים ממערכת טיהור המים Synergy</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>אקרוס אורגניקס</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>IgG משני ללא תווית</td><td>ג'קסון אימונו-מחקר</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>נוגדן כחול אופסין</td><td>מיליפור&nbsp; &nbsp;</td><td>AB5407&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>נוגדן אופסין RG</td><td>מיליפור</td><td>AB5745&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA) 4%</td><td>תרמו מדעי&nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>פתרון PBS</td><td>ג'יבקו</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>בדיקות תיוג פלואידין</td><td>תרמופישר</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>תמיסת מלח עם חומצת פוספט (PBS)</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>נוגדן RECOV</td><td>מיליפור</td><td>AB5585-I&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>נוגדן RHO (RET-P1)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>O4886&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>סודיום ציטראט טריבייסיק דיהידרט&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>נוגדן TUJ1</td><td>קובאנס&nbsp;</td><td>MMS-435P&nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

whole-mount-retinal-organoid-visualization-with-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מדגים וידאו הקמת organotypic תרבויות wholemount הרשתית הליך cytospin לניתוח תופעות המושרה exogenously. Organotypic תרבויות wholemount רשתית לחקות...

בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

מוצגת כאן טכניקה כירורגית להשתלת רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) בחלל התת-רשתית של מודל בעל חיים גדול.

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

תאי מיקרוגליה הם תאי חיסון ייחודיים השוכנים ברשתית, וממלאים תפקידים מכריעים במחלות ניווניות שונות ברשתית. יצירת מודל תרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה יכולה להקל על הבנה טובה יותר של הפתוגנזה והתקדמות הפיתוח של מחלות רשתית.

הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

חקור הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה באמצעות ניקוי אופטי וסימון אימונולוגי. השיטה חושפת שכבות נוירונליות וחיבורים תאיים ברזולוציה תלת-ממדית לחקר מחלות רשתית.

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

גלה סרטונים נוספים