הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

עבודתנו מתמקדת בפיתוח ומחקר של אורגנואידים ברשתית המשמשים כמודל אנושי במבחנה כדי לחקור כיצד נוצרת הרשתית האנושית, כיצד מחלות משפיעות וכיצד אנו עשויים לטפל בהן.

כדי לקדם את המחקר בתחום הרפואה הרגנרטיבית, אנו משתמשים באורגנואידים תלת מימדיים ברשתית בשילוב עם ניקוי אופטי ותיוג חיסוני כדי להמחיש מבנים שלמים ולחקור את הארגון המיוחד של תאי הרשתית במיקרוסקופיה קונפוקלית.

הדמיה שלמה מתמודדת עם אתגרים, כמו חדירת נוגדנים לא אחידה ברקמות צפופות וסטייה כדורית באורגנואידים, הגורמים לתיוג הטיית פני השטח ואובדן מיקוד במהלך הדמיית הרקמה.

השיטה שלנו חושפת קשרי תאי רשתית, סוגי תאים, תחת ארגון תלת מימדי, ומספקת תובנות חיוניות לגבי הגורמים הבסיסיים למחלות רשתית.

[מדריך] כדי להתחיל, השג את האליקוטים של הפלואורופור מומסים ב-DMSO נטול מים, מיובשים וקפואים. הוסף 1 עד 10 מיקרוליטר DMSO למניעה. כעת, שלבו 50 מיקרוליטר של אימונוגלובולין G משני או נוגדן ראשוני, שישה מיקרוליטרים של נתרן ביקרבונט מולארי אחד, ואחד עד חמישה מיקרוליטר פלואורופור, ודגרו על משטח נדנדה למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מאור. בזמן שהתגובה מתקדמת, הסר את המכסים של עמודות אי הכללת גודל הטיהור ואפשר למאגר לעבור. אזן את העמודה על ידי הפעלת שלושה סיבובים של שניים עד שלושה מיליליטר PBS דרך העמודה. אם שיווי המשקל האחרון מסתיים לפני סיום הדגירה, החזירו את המכסים לאחור כדי למנוע מהם לצייר, והמתינו לסיום התגובה. לאחר הדגירה, הוסף 140 מיקרוליטר PBS לתגובת התיוג כדי להביא את הנפח לכ -200 מיקרוליטר, ומערבל אותו. הוסף את הפתרון למרכז העמודה ואפשר לו להיכנס לעמודה. לאחר שהטיפה האחרונה חמקה, דחף את התמיסה עם 550 מיקרוליטר PBS. כאשר הנוזל מפסיק ליפול, יש לשטוף עם 300 מיקרוליטר PBS, ולאסוף בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מדוד את ספיגת הדגימה ב-280 ננומטר, ובאורכי הגל הספציפיים לפלואורופור כדי לחשב את ריכוז הנוגדנים ויחסי התיוג. אחסן את הנוגדנים המסומנים בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור, למשך עד שישה חודשים. יש לתקן את האורגנואידים ברשתית עם 4% אלדהיד פרפורם בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. לאחר הקיבוע, הוסיפו תמיסת אחזור אנטיגן מעל האורגנואידים, ודגרו את המנה ב-60 מעלות צלזיוס, עם ניעור קל ב-30 סיבובים לדקה למשך שעה. לאחר מכן, חדור את האורגנואידים עם PBS המכיל 1% טריטון X-100. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר, עם ניעור קל במשך ארבע שעות. כעת, חסום את האורגנואידים ב-2% BSA עם 0.1% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר למשך הלילה או למשך יותר מיום אחד. למחרת, הוסף נוגדנים ראשוניים מדוללים לאורגנואידים. דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים עם רעידות קלות. שטפו את האורגנואידים שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד בתמיסת כביסה בטמפרטורת החדר עם ניעור קל. כעת, הוסיפו את תמיסת הדילול נוגדנים משניים ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים עם רעידות קלות. לאחר שטיפת האורגנואידים כפי שהודגם קודם לכן, דגרו את האורגנואידים בצבעים פלואורסצנטיים מדוללים בתמיסת כביסה בטמפרטורת החדר למשך שעה עם ניעור קל. לאחר מכן, שטפו שוב. לאחר מכן, הכינו תמיסות 1-פרופנול במים טהורים במיוחד בריכוזים של 15%, 30%, 45%, 60%, 75% ו-90%, והתאימו כל אחת ל-pH 9.5 עם טרימתילאמין. יש לייבש את הדגימות ברצף בשיפועים הולכים וגדלים של תמיסות 1-פרופנול למשך שעתיים כל אחת ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול קל. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לתמיסת 100% 1-פרופנול, ודגרו למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול קל. לניקוי דגימה, הכינו תערובת בנזיל אלכוהול ובנזיל בנזואט ביחס של אחד לשניים להכנת תמיסת BABB. טבלו את הדגימות ב- BABB בטמפרטורת החדר למשך הלילה. רענן את תמיסת BABB לפני ההדמיה. בעזרת פיפטה מזכוכית, מקם את האורגנואיד בצלחת פטרי תחתית זכוכית עם טיפת BABB, וודא שהוא נוגע במשטח זכוכית הכיסוי. כעת, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך עם יעדי הגדלה נמוכים וגבוהים כדי לרכוש תמונות Z-stack לרזולוציה סלולרית תלת מימדית. כייל מחדש את גודל השלב של רכישת Z-stack על ידי התחשבות באי-התאמה של מקדם השבירה בין תמיסת הסליקה למדיית הטבילה. כעת, הפעל את ImageJ, עדכן את עומק הווקסל על ידי בחירת תמונה ולחיצה על מאפיינים כדי ליצור הקרנות תמונה של מחסנית Z. בדוק את עומק מחסנית Z על-ידי בחירה באפשרות Image, לאחר מכן Stacks ובחירה באפשרות Orthogonal Views להצגת תצוגות XY, XZ ו-YZ של האורגנואיד ברשתית. שמור את האזורים הרצויים על ידי לחיצה על קובץ ובחירה בשמירה בשם. לבסוף, צור אנימציה של עיבוד תלת מימד של מחסנית Z באמצעות תוכנת עיבוד. אורגנואידים ברשתית שנוקו על ידי פרוקטוז גליצרול הראו את השיפור הנמוך ביותר בשקיפות, מה שמפריע להדמיה של ליבת האורגנואידים. ניקוי ECI שיפר את ההדמיה של שכבות הרשתית, אך עדיין לא הצליח לחשוף את הליבה האורגנואידית עקב פיזור אור מתמשך. אורגנואידים מנוקים של Fluoclear BABB הציגו את השקיפות הגבוהה ביותר, וחשפו בבירור הן את קליפת המוח והן את הליבה עם פלואורסצנטיות עקבית. גם אורגנואידים מנוקים של ECI וגם fluoclear BABB הראו הצטמקות נראית לעין בתמונות שדה בהיר עקב שלבי התייבשות. הצטמקות הנגרמת על ידי BABB הגדילה את קומפקטיות הדגימה, ואפשרה שימוש ביעדי הגדלה גבוהה כדי לדמות מבנים עמוקים יותר. תיוג חיסוני של TUJ1 לאחר 40 יום במבחנה הראה שכבה עצבית דקה אחת ללא ריבוד נראה לעין. לאחר 90 יום, התאים אכלסו בצפיפות את האזור האפיקלי, ולאחר 170 יום, האורגנואיד הראה סימנים ברורים של ארגון שכבתי עם אזור אפיקלי מוגדר. לאחר 200 יום, הקרנות תאים מוארכות התפשטו פנימה מפני השטח לתוך הליבה, והאורגנואיד התפתח לשלוש שכבות רשתית נפרדות לאחר 250 יום. סיבים עצביים התפשטו ממרכז האורגנואיד לכיוון הפריפריה לאורך ההתבגרות, והפכו עבים ומורכבים יותר ב-250 יום במבחנה. קולטני אור חרוטים המבטאים אופסינים כחולים וירוקים/אדומים הופיעו בשלבים מאוחרים, והראו מורפולוגיות מוארכות עם קצוות בהירים. קולטני אור מוט המבטאים רודופסין זוהו על ידי הגרעינים המרכזיים שלהם והתפלגות האופסין ההיקפית שלהם. תאים חיוביים ל-Chx10 הופצו בתחילה באופן נרחב, אך מאוחר יותר התמקמו במיוחד בשכבה הגרעינית הפנימית במהלך התבגרות האורגנואידים. ביטוי GCaMP6s אנדוגני נשמר לאחר ניקוי BABB, עם אות GFP שניתן לזהות ברשתית העצבית לאחר קיבוע ארוך טווח.