מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

לכן המחקר שלנו מתמקד בהבנת האופן שבו תאים הממוקמים רחוק ברקמות מתקשרים זה עם זה. אנו משתמשים בדיסק הדמיוני של כנף דרוזופילה כמערכת מודל כדי לנסות להבין כיצד נוצרים ציטידין, כיצד הם מתפקדים ואיזה תפקיד הם ממלאים בשליטה מקומית על צמיחת רקמות. מחקרים מצביעים על כך שגורמי גדילה עוברים לעתים קרובות דרך הקרנות תאיות מיוחדות כמו פילופודיה איתות מבוססת אקטין, הנקראות ציטונמים על מנת להיות מועברים לתאי המטרה.

ציטונמים הם מבנים דקים ושבריריים מאוד המופרעים בקלות על ידי פרוטוקול קיבוע. כדי לצפות בהם, עליך להשתמש בגישות הדמיה חיה ייעודיות עם חלבון מתויג פלואורסצנטי מבוטא. זה מגביל מאוד את הכלי והגישות שאנו יכולים להשתמש בהם כדי לחקור אותם.

זיהינו חלבון קינאז בשם Slik המעורב בביוגנזה של ציטונם. ביטוי של סליק בשכבה אפידורלית אחת בדיסק הדמיוני של הכנף מעורר היווצרות ציטונמה שחצתה את לומן הדיסק וממריצה את התפשטות התאים בשכבת האפיתל השכנה. בעתיד, נרצה לזהות את החלבון הפועל במורד הזרם של סליק כדי לקדם היווצרות ציטונמה, לזהות את הליגנד המועבר דרך ציטונמה זו כדי לקדם ניקוב, ולהבין טוב יותר את החשיבות הפיזיולוגית של מנגנון זה בשליטה על צמיחת רקמות.

כדי להתחיל, חותכים בארות בודדות מרצועת שמונה הבארות בעזרת מספריים ואז חותכים כל באר לשניים. הסר את גב המגן מצד אחד של כל מחצית והדביק את המרווחים על מגלשת המיקרוסקופ, תוך ריווח ביניהם מעט זה מזה כדי ליצור חלל מרכזי מוגן למיקום הדיסק. קטפו זחלי כוכב שלישי נודדים מצינור הגידול לאחר הכלאה גנטית ודגירה ב-25 מעלות צלזיוס.

תחת מיקרוסקופ מנתח, העבירו את הזחלים לטיפה של מדיום הדמיה חי על צלחת פטרי מצופה סיליקון. בעזרת שני מלקחיים לניתוח, התחל בנתיחה על ידי צביטה של הזחלים בערך 1/3 אורך הגוף מהחלק הקדמי עם זוג מלקחיים אחד כדי להחזיק אותו יציב. עם הזוג השני, צבטו את הגוף רק מאחור לנקודה הראשונה ומשכו כדי להפריד את החצי האחורי, תוך בידוד החלק הקדמי.

הפוך את החצי הקדמי על ידי אחיזה בשני צידי הקצה החתוך בפינצטה ודחיפת הראש באמצעות זוג שני, והפיכתו כלפי חוץ. זה חושף מבנים פנימיים כגון דיסקים דמיוניים, קנה הנשימה, בלוטות הרוק, גוף השומן והמעיים. הסר את בלוטות הרוק, גוף השומן והמעיים באמצעות מלקחיים, תוך הקפדה לא להפריע לגזעי קנה הנשימה הצדדיים המכסים את דיסקי הכנף.

בעזרת מלקחיים, העבירו את החצאים הקדמיים הנקיים עם דיסקי כנף מחוברים לתוך טיפה של מדיום הדמיה חי נקי עם ווים הממוקמים בין מרווחי ההחלקה. כדי לבודד את דיסקי הכנף, נתחו אותם בעדינות מענפי קנה הנשימה העדינים בעזרת להב אחד של מלקחיים החותכים או חוט טונגסטן עדין המותקן על מחזיק מחט ניתוח. השליכו את הפגר שנותר.

כוון את דיסקי הכנף באמצעות להב מלקחיים מנתח או מחט טונגסטן כך שצד הממברנה הפריפודית פונה כלפי מעלה. כוונן את עוצמת הקול הבינונית כך שהיא תמלא מעט את הבאר מעל רמת המרווח. הסר את גב המגן העליון ממרווח ההדמיה, והורד בעדינות את החלקת הכיסוי מעל הדגימה.

לחץ על החלקת הכיסוי בנקודות המגע של המרווח באמצעות הקצה המעוגל של המלקחיים כדי להבטיח הידבקות תקינה. כדי להקרין את אוספי התמונות ב-ImageJ, בחרו 'תמונה', לאחר מכן 'אוספים', ולאחר מכן 'פרויקט Z', ובחרו 'עוצמה מרבית' מהתפריט. בתמונות ההקרנה בעוצמה מרבית, זהה את אזור נרתיק הכנף על סמך דפוס קיפול דיסק הכנף באמצעות תעלת הווים וכלי בחירת המצולע.

החילו את אותה בחירה על ערוץ GFP, ובחרו Edit ולאחר מכן Clear Outside כדי למנוע רעש מחוץ לאזור שנבחר. השתמשו בערוץ הווים בתמונות ההקרנה בעוצמה מרבית כדי לזהות את הכתמים הארטיפקטיים בתמונות GFP. לאחר מכן, בחרו באזור בעזרת הכלי בחירת מצולעים.

לחץ על ערוך ובחר נקה. בתמונות ההקרנה בעוצמה מרבית שנוקו, בחר נתח, ולאחר מכן היסטוגרמה, ובחר רשימה כדי לקבל את כל ערכי הפיקסלים. העתק רשימה זו לטבלת גיליון אלקטרוני.

כדי להגדיר ערך סף, נתח את אות הרקע בדגימות הבקרה השליליות ואשר ערך זה באמצעות תמונות לדוגמה אחרות. חשב את אחוז המשטח החיובי ל-GFP על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים מעל הסף במספר הכולל של פיקסלים חוקיים והכפלת התוצאה ב-100. לבסוף, נרמל כל ערך מחושב לאחר חלוקתו בממוצע של תנאי הייחוס, המוגדר לאחד.

בדיסקים מסוג פרא חסרי שני רכיבי GFP מפוצלים, נצפתה רק אוטופלואורסצנטיות GFP גרגירית מינימלית ליד מרכז כיס הכנף, ואות בסיס זה שימש להגדרת סף פלואורסצנטי. דיסקים המבטאים רק CD4 מפוצל GFP1-10 בשכבה הנכונה של הדיסק הראו רמות פלואורסצנטיות שלא ניתן להבחין בהן מסוג בר, מה שאישר את האופי הלא פלואורסצנטי של GFP1-10 בלבד. ביטוי משותף של CD4 מפוצל GFP1-10 בדיסק עצמו ו-CD4spGFP11 בממברנה הפרידידיאלית הוביל לעלייה ניכרת בכתמי GFP בדידים ובהירים הממוקמים בלומן הדיסק, עם שטח חיובי פלואורסצנטי גדול משמעותית מעל הסף מאשר בקרות.

ביטוי סליק בדיסק עצמו גרם לעלייה חזקה בצפיפות גרעיני הממברנה הפריפודיאלית ולעלייה דרמטית בעוצמת אות ה-GFP על פני אזור כיס הכנף, מה שמרמז על כך שציטונמים המושרים על ידי סליק יוצרים מגע משופר עם תאי הממברנה הפריפודית.