Name: מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: חקור מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של Drosophila באמצעות מערכת השלמת GFP. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על מסירת גורמי צמיחה בין שכבות אפיתליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

דוחף nubbin-GAL4 משמש לביטוי CD4-spGFP1-10 במיוחד באזור נרתיק הכנף של ה-DP (איור 1A). דוחף PerM-LexA21 משמש לביטוי CD4-spGFP11 במיוחד ב-PerM (איור 1A). שתי מערכות הביטוי הללו אינן תלויות זו בזו, ומאפשרות ביטוי בו-זמני וספציפי של טרנסגנים שונים ב-DP ו-PerM (איור 1B,C).
התוכנית הגנטית הבסיסית כוללת הכלאה של זבובים ליצירת זחלים של הגנוטיפ nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. כבקרה שלילית, אנו משאירים את הטרנסגן LexAop-CD4-spGFP11 . טרנסגנים אחרים (למשל, קידוד חלבון, RNA דו-גדילי) יכולים להתבטא כרצונם בשכבת ה-DP (בשליטת רצפי הכטב"מים ) או ב-PerM (בשליטת אופרטור LexA).
זהו פרוטוקול הדמיה חיה שלא ניתן להפריע לו. הכנת החומר מוערכת ב~10 דקות. אין לבצע נתיחות יותר מ-20 דקות בכל פעם לפני ההדמיה. ההדמיה אורכת ~30 דקות ולא אמורה להימשך יותר מ~1 שעה. עבור מספר תנאים או מספר גבוה של דגימות, יש לבצע את ההליך במספר סבבים כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.
1. הכנת חומר
<ol>
	<li>לפני הנתיחה, פינצטה נקייה, צלחת שקע זכוכית בעלת 9 בארות (או מיכל אחר המתאים לאיסוף וניקוי זחלים), וצלחת פטרי מצופה סילגארד (סיליקון) לשימוש חוזר המשמשת לדיסקציה עם 70% אתנול.</li>
	<li>הכן שקופיות מיקרוסקופ על ידי ביצוע שטיפת אתנול של 70% ולאחר מכן הדבקת מרווח הדמיה לשקופית המיובשת. חותכים בארות בודדות מרצועת 8 הבארות בעזרת מספריים וחותכים לשניים (איור 2A). הסר את גב המגן מצד אחד של כל מחצית והדביק מרווחים למגלשה, במרווחים קלים זה מזה כדי ליצור מרחב מוגן באמצע שבו הדיסקים יוצבו (איור 2B). הערה: מניסיוננו, זה מפשט את הרכבת הדגימה מכיוון שהנפח המדויק של המדיום המועבר לשקופית הוא פחות קריטי. כל נפח עודף קטן פשוט יזרום החוצה דרך הפער בעת החלקת הכיסוי. מכיוון שאנו מצלמים רק לזמן קצר יחסית (בדרך כלל ~ שעה), לא חווינו בעיות עם ייבוש בינוני.</li>
	<li>הפשירו מדיום הדמיה חיה (מדיום דרוזופילה של שניידר ללא תוספת מאוחסן בכמות קפואה של 10 מ"ל) ושמרו אותו נגיש בדלי קרח.</li>
	<li>בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל, מערבבים 1.5 מ"ל של מדיום עם 20 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 (ריכוז סופי 2.7 מיקרוגרם/מ"ל). שמור את הצינור על קרח. הערה: צורה ספציפית זו של צבע Hoechst משמשת מכיוון שהיא חדירה מאוד לממברנה. זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת טיפול ב-Hoechst 33342. יש לשטוף כלים לאחר השימוש.</li>
</ol>
2. חיתוך דיסק כנף והכנת שקופיות
<ol>
	<li>לאחר הכלאה וגידול גנטי ב-25 מעלות צלזיוס, קוטפים זחלי כוכב שלישי נודדים מהצינור ושוטפים אותם במדיום הדמיה חי קר בצלחת שקע זכוכית עם 9 בארות. הערה: ציטונמים שבירים מאוד. בשלבים הבאים, יש להקפיד על מניפולציה של רקמות סביב הדיסקים, בניסיון להימנע ממגע ישיר בין הדיסקים לכלי הדיסקציה. אנו מכינים שלושה או ארבעה זחלים בכל פעם, מכיוון שפגיעה בכמה דיסקים היא בלתי נמנעת, וזה עשוי להיות מורגש רק במהלך שלבי ההדמיה.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ הניתוח, העבירו את הזחלים לטיפה של מדיום הדמיה חיה על צלחת פטרי מצופה סיליקון והתחילו לנתח באמצעות שני מלקחיים לניתוח. לשם כך, תחילה החזק את הראש וחלק הגוף הקדמי יציב על ידי צביטה של הזחלים עם זוג מלקחיים אחד בכשליש מאורך הגוף (מהקדמי). בעזרת זוג המלקחיים השני, צבטו את הגוף ממש אחורי למלקחיים הראשונים. לאחר מכן, משוך את החלק האחורי של הזחלים כדי לבודד את ה"חצי" הקדמי.</li>
	<li>הפוך את החצי הקדמי על ידי אבטחתו עם פינצטה אחת משני צידי הקצה החתוך ודחיפת הראש עם הזוג השני (כמו סיבוב גרב כלפי חוץ), כדי לחשוף את המבנים הפנימיים, כולל דיסקים דמיוניים, קנה הנשימה, בלוטות הרוק, גוף השומן והמעיים.</li>
	<li>הסר בזהירות את בלוטות הרוק, גוף השומן והמעיים, והיזהר לא להפריע לגזעים הצדדיים של קנה הנשימה, שאמורים לכסות ולהגן על דיסקי הכנף.</li>
	<li>השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את החצאים הקדמיים הנקיים עם דיסקי כנף מחוברים לתוך טיפה של מדיום הדמיה חיה נקי עם Hoechst, המונח בין המרווחים על מגלשה מוכנה (איור 2C). בודד את דיסקי הכנף משאר הרקמות על ידי ניתוחם בעדינות הרחק מהענפים העדינים של קנה הנשימה המתחברים לדיסק, באמצעות להב אחד של מלקחיים המנתחים, או חוט טונגסטן דק המחובר למחזיק מחט ניתוח. השליכו את שאר הפגר.</li>
	<li>כוון את הדיסקים באמצעות להב אחד של מלקחיים או מחט ניתוח חוט טונגסטן. בשל צורתם השטוחה דמוית טיפת הדמעה, דיסקי הכנפיים ייפלו כאשר ה-DP או PerM פונים כלפי מעלה. עבור פרוטוקול זה, כוון את כל הדיסקים כשצד ה-PerM כלפי מעלה.</li>
	<li>כוונן את נפח המדיום כדי למלא את הבאר במלואה, מעט מעל רמת מרווח ההדמיה, על ידי הוספה או הסרה של המדיום לפי הצורך. הסר את גב המגן מהצד העליון של כל חצי מרווח הדמיה ולאחר מכן הורד בזהירות את הכיסוי מעל הדגימה. לחץ בעדינות על משטח הכיסוי במקום שבו הוא נוגע במרווחי ההדמיה (למשל, עם הקצה המעוגל של מלקחיים לניתוח) כדי לוודא שהחלקת הכיסוי נצמדת למרווח. הערה: המפלס הבינוני צריך להיות מעט מעל גובה המרווח כדי למנוע לכידת בועות אוויר, אך לא גבוה עד כדי יצירת זרימה משמעותית בעת הורדת הכיסוי.</li>
</ol>
3. הדמיה
<ol>
	<li>דגימות תמונה בטמפרטורת החדר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (לייזר יון ארגון עם אורך גל של 488 ננומטר עבור GFP, לייזר UV עם אורך גל של 350 ננומטר עבור Hoechst) המצויד בעדשת טבילה בשמן 40x/1.30 NA ותוכנת מיקרוסקופיה. רכוש ערימות תמונות בגודל צעד של 1 מיקרומטר המשתרעות מהרמה הגבוהה ביותר של ה-PerM (היכן שהפלואורסצנטיות של Hoechst פוחתת) לצד הבסיסי של ה-DP, שבדרך כלל מסתכם ביותר מ-100 תמונות לערימה. רכשו אוספי תמונות חוזרים כדי ליצור סרטוני דולג זמן. הערה: אנו מדמיינים שקופית לא יותר מ~1-2 שעות.</li>
	<li>עבור הגדרות תוכנת המיקרוסקופ, רכוש תמונות באמצעות קידוד 8 סיביות, ממוצע קו של 2, רווח גלאי בדרך כלל בין 650 ל-750, ומסלולי ערוצים מופרדים כדי להפחית את דימום האות. השתמש בהגדרות לייזר וגלאי זהות לכל התנאים, שנקבעו מראש על ידי ביצוע בדיקות על כל מצב מראש. הערה: בהגדלה של פי 40, לתמונות שלנו יש רזולוציה של 5.0386 פיקסלים למיקרומטר (גודל פיקסל: 0.1985 x 0.1985 מיקרומטר2). במערך שלנו, הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי האופטימליות כללו את עוצמת הלייזר הגבוהה ביותר האפשרית (מבלי לפגוע ברקמה) כדי ללכוד כמה שיותר אותות, ובמקביל להניב רוויה מועטה או ללא רוויה; והרעש הנמוך ביותר האפשרי כפי שהוערך בבקרות שליליות, המושג על ידי הפחתת היסט הגלאי ומהירות הרכישה (במידת הצורך). בדרך כלל אנו משתמשים בפחות מ-5% עוצמת לייזר ומהירות ראש סריקה מקסימלית ('9' בהגדרות תוכנת Zen). ערימת תמונות בודדת לוקחת בדרך כלל ~1 דקה ו-45 שניות, והתמונות מצולמות כל 2-3 דקות לניתוחי זמן-lapse.</li>
</ol>
4. ניתוח תמונות
<ol>
	<li>ערימות הקרנה באמצעות פונקציית ההקרנה בעוצמה המרבית של חבילת התוכנה ImageJ (לחץ על התמונה | ערימות | Z, בחר עוצמה מקסימלית בתפריט).</li>
	<li>בתמונות MIP, קבע את שטח נרתיק הכנף על סמך דפוס קיפול דיסק הכנף (באמצעות ערוץ Hoechst) באמצעות בחירת מצולע. השתמש באותה בחירה בערוץ GFP עם הפונקציה Clear Outside (לחץ על Edit | Clear outside) כדי להגדיר כל ערך פיקסל חיצוני ל- 0.</li>
	<li>בתמונות MIP, השתמש בערוץ Hoechst לניקוי תמונות GFP, ובמיוחד הסר את כל הכתמים המלאכותיים המופיעים בשני הערוצים על-ידי הגדרת ערך הפיקסלים הנוגע בדבר ל- 0 (לחץ על בחירת מצולע ולאחר מכן על ערוך | נקה).</li>
	<li>בתמונות ה-MIP המנוקות, השתמש בפונקציה היסטוגרמה (לחץ על נתח | היסטוגרמה | List) כדי להשיג ולהעתיק את רשימת כל ערכי הפיקסלים לטבלה בגיליון אלקטרוני.</li>
	<li>הגדר ערך סף על סמך ניתוח אות הרקע בבקרות שליליות (ולאחר מכן אומת בדגימות אחרות; ראה דיון).</li>
	<li>חשב את אחוז המשטח החיובי ל-GFP באמצעות הנוסחה הבאה: % משטח חיובי ל-GFP = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>נרמל את הנתונים בסוף על-ידי חלוקת כל ערך בממוצע של תנאי הייחוס (המוגדר ל- 1). הערה: פיקסל חוקי = פיקסל עם ערך ≥ 1, ולמעשה מתעלם מכל פיקסל שנמחק שהערך שלו נקבע ל- 0. ערכי פיקסלים של 0 אינם מתרחשים באופן טבעי.</li>
	<li>כדי לקבוע היכן בדיסקים מתמקם אות ה-GFP המחודש, השתמש ב-XZ-reslices של ערימות תמונות כדי להסתכל על הציר האפיקובזאלי של אפיתל הדיסק. בצע את הפרוסות בפיג'י ללא אינטרפולציה, והגדל את גובה התמונה בציר Z באמצעות הפונקציה Scale עם אינטרפולציה דו-ליניארית כדי לשפר את הנראות.</li>
</ol>

<ol><li>Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+pattern+formation+during+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development.</a> Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).</li>
<li>Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+and+the+dispersion+of+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes and the dispersion of morphogens.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).</li>
<li>Daly, C. A., Hall, E. T., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+of+cytoneme-based+morphogen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms of cytoneme-based morphogen transport.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (2), 119(2022).</li>
<li>Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes%3A+cellular+processes+that+project+to+the+principal+signaling+center+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 97 (5), 599-607 (1999).</li>
<li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme+delivery+of+Sonic+Hedgehog+from+ligand-producing+cells+requires+Myosin+10+and+a+Dispatched-BOC%2FCDON+co-receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cytoneme delivery of Sonic Hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a Dispatched-BOC/CDON co-receptor complex.</a> Elife. 10, e61432(2021).</li>
<li>Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+filopodia+direct+long-range+transport+of+SHH+during+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning.</a> Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).</li>
<li>Stanganello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia-based+Wnt+transport+during+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Filopodia-based Wnt transport during vertebrate tissue patterning.</a> Nat Commun. 6, 5846(2015).</li>
<li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme+signaling+provides+essential+contributions+to+mammalian+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoneme signaling provides essential contributions to mammalian tissue patterning.</a> Cell. 187 (2), 276-293.e23 (2024).</li>
<li>Zhang, C., Brunt, L., Ono, Y., Rogers, S., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+transport+of+active+Wnt5b-Ror2+complexes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated transport of active Wnt5b-Ror2 complexes in zebrafish.</a> Nature. 625 (7993), 126-133 (2024).</li>
<li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li>
<li>Wood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+with+complex+geometries+and+composition+extend+into+invaginations+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes with complex geometries and composition extend into invaginations of target cells.</a> J Cell Biol. 220 (5), e202101116(2021).</li>
<li>Gonzalez-Mendez, L., Seijo-Barandiaran, I., Guerrero, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+cell-cell+contacts+for+Hedgehog+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated cell-cell contacts for Hedgehog reception.</a> Elife. 6, e24045(2017).</li>
<li>Du, L., Sohr, A., Li, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+FGF+directs+cytoneme-mediated+bidirectional+contacts+to+regulate+its+tissue-specific+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored FGF directs cytoneme-mediated bidirectional contacts to regulate its tissue-specific dispersion.</a> Nat Commun. 13 (1), 3482(2022).</li>
<li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624(2014).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+defines+cell+contacts+and+synapses+in+living+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems.</a> Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+coordination+of+the+dual+roles+of+the+Hedgehog+co-receptor+in+homophilic+adhesion+and+signal+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Competitive coordination of the dual roles of the Hedgehog co-receptor in homophilic adhesion and signal reception.</a> Elife. 10, e65770(2021).</li>
<li>Patel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+coordinate+asymmetric+signaling+and+organization+in+the+Drosophila+muscle+progenitor+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cytonemes coordinate asymmetric signaling and organization in the Drosophila muscle progenitor niche.</a> Nat Commun. 13 (1), 1185(2022).</li>
<li>Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+basal+cytonemes+take+up+Hedgehog+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).</li>
<li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+cytonemes+mediate+Wg+signaling+from+the+wing+imaginal+disc+and+Delta-Notch+signaling+to+the+air+sac+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium.</a> Elife. 4, e06114(2015).</li>
<li>Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+produced+by+the+Drosophila+wing+imaginal+disc+induces+distinct+responses+in+three+target+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues.</a> Development. 147 (22), dev195974(2020).</li>
<li>Rambaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slik+sculpts+the+plasma+membrane+into+cytonemes+to+control+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Slik sculpts the plasma membrane into cytonemes to control cell-cell communication.</a> EMBO J. 44 (8), 2186-2210 (2025).</li>
<li>Gibson, M. C., Schubiger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripodial+cells+regulate+proliferation+and+patterning+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Peripodial cells regulate proliferation and patterning of Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 103 (2), 343-350 (2000).</li>
<li>Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumenal+transmission+of+decapentaplegic+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs.</a> Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).</li>
<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr%2FRas+pathway+mediates+interactions+between+peripodial+and+disc+proper+cells+in+Drosophila+wing+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Egfr/Ras pathway mediates interactions between peripodial and disc proper cells in Drosophila wing discs.</a> Development. 130 (20), 4931-4941 (2003).</li>
<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+interactions+between+squamous+and+columnar+epithelia+of+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).</li>
<li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+superfolder+and+split+fluorescent+protein+detection+systems+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology.</a> Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).</li>
<li>Panneton, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+catalytic+and+non-catalytic+functions+of+the+Drosophila+Ste20+kinase+Slik+by+activation+segment+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation.</a> J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>דיסקברי V12 מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>צייס</td><td></td><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td></tr><tr><td>דומונט #55 מלקחיים, טיפים לביולוגיה</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11255-20</td><td>ניתוח מלקחיים</td></tr><tr><td>EP-Slik (slik20358)</td><td>BDSC</td><td>Panneton et al. 2015&nbsp;</td><td>זן זבוב לשאיבת סליק</td></tr><tr><td>פיג׳י</td><td></td><td>Schindelin J. et al. (2012)&nbsp;</td><td>תוכנה לניתוח תמונות</td></tr><tr><td>הוכסט 33342&nbsp;</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>H3570&nbsp;</td><td>הדמיה חיה כתם גרעיני&nbsp;</td></tr><tr><td>LexAop-CD4-spGFP11&nbsp; </td><td>BDSC</td><td>93018</td><td>זן זבוב</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי LSM 700&nbsp;</td><td>צייס</td><td></td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>nub-GAL4</td><td>מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (BDSC)</td><td>86108</td><td>זן זבוב</td></tr><tr><td>PerM-LexA</td><td></td><td>רמבו, יוסף ואחרים, 2025</td><td>זן זבוב</td></tr><tr><td>פלטת ספוט זכוכית PYREX 9-שקע</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>7220-85</td><td>לאיסוף ושטיפת זחלים</td></tr><tr><td>מדיום הדרוזופילה של שניידר</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>21720024</td><td>מדיום הדמיה חיה</td></tr><tr><td>מרווחי הדמיה SecureSeal, 8 בארות, עובי 0.12 מ"מ&nbsp;</td><td>גרייס ביו-לאבס</td><td>654008</td><td>מרווח</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>סילגארד</td><td>3097358-1004</td><td>להכנת לוחות חיתוך</td></tr><tr><td>UAS-CD4-spGFP1-10&nbsp; </td><td>BDSC</td><td>93017</td><td>זן זבוב</td></tr><tr><td>זן שחור</td><td>צייס</td><td></td><td>תוכנת רכישה</td></tr></tbody></table>

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת gfp להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

כדי לבחון את התועלת של נוהל GRASP למדידת מגעים בין תאי DP ו-PerM, בחנו דיסקי כנף של ארבעה גנוטיפים שונים: דיסקי בקרה שלילית מסוג פרא (גנוטיפ: w1118) שיציגו רק רמות רקע של אוטופלואורסצנטיות בערוץ GFP; דיסקים המבטאים את CD4-spGFP1-10 בשכבת ה-DP, אך חסרים את הטרנסגן CD4-spGFP11, שיראה את רמת הקרינה המיוצרת על ידי GFP1-10 בלבד (שציפינו שתהיה זניחה, מכיוון ש-GFP1-10 לא אמור להאיר26); דיסקים שבהם CD4-spGFP1-10 ו-CD4-spGFP11 באים לידי ביטוי ב-DP ו-PerM, בהתאמה (אי...

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

Embryonic tissue growth and patterning are largely controlled by signals exchanged locally between cell populations within the tissues themselves. ...

a-gfp-complementation-based-dual-expression-system-for-assessing-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של מוח דרוזופילה טרנסגני להדמיה חד-תאית של תאי גליה. המוח מבטא חלבונים ממוקדי ממברנה המאוחים עם שילובים שונים של אפיטופים אנטיגניים תחת שליטת מערכת רקומבינאז ספציפית לגליה. המוחות המבודדים והקבועים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ספציפיים לאפיטופים האנטיגניים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. תיוג זה מאפשר הדמיה בו-זמנית של תת-אוכלוסיות שונות של תאי גליה על פני אזורי מוח שונים.

צביעה אימונופלואורסצנטית של מוחות דרוזופילה להדמיה חד-תאית של תאי גליה

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.

יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

חקור מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של Drosophila באמצעות מערכת השלמת GFP. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על מסירת גורמי צמיחה בין שכבות אפיתליות.

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים