זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

המחקר שלנו בוחן כיצד מיקרוגליה משפיעה על תיקון המוח אחרי פגיעה מוחית טרום-לידתית. ואנו שואפים לקבוע אם ויסות פעילות תאי מיקרוגליה יכול לשפר את התוצאות הנוירולוגיות ארוכות הטווח. אני מאמין שזו המורכבות של תגובות תאי המיקרוגליה והאתגרים של תיאור התגובות הללו בצורה המדויקת ביותר כדי לייצג תגובות ומחלות פיזיולוגיות, אך גם פתולוגיות.

אנו משתמשים בשיטות שונות, כגון ריצוף RNA של תא בודד וניסויי זרימה ציטומטרית, כדי לאפיין מצבי מיקרוגליה ותפקוד במוח המתפתח לאחר פגיעה טרום לידתית. אתגר מרכזי הוא שימור כדאיות התאים וזהות המיקרוגליה במהלך הבידוד, במיוחד בנקודות זמן של ילודים כאשר מספר תאי המוח הקטן מוגבל. זה מעלה שאלות לגבי האופן שבו עלבונות מוקדמים במוח הקטן מובילים לשינוי שעתוק בתת-אוכלוסיית מיקרוגליה וכיצד טיפולים ממוקדים עשויים לווסת את השינויים הללו.

כדי להתחיל, נתחו את אזור המוח הספציפי של עכברים לפי הצורך. בעזרת מלקחיים, העבירו את הרקמה לצלחת פטרי קטנה המכילה מדיום תרבית תאי מיקרוגליה המונח על קרח כדי לשמור על כדאיות התא. בעזרת פיפטה, הסר את מדיום תרבית תאי המיקרוגליה מצלחת הפטרי.

לאחר מכן, בעזרת אזמל, חתכו דק את רקמת המוח באותה צלחת פטרי. העבירו את רקמת המוח ההומוגנית לצינורות של חמישה מיליליטר לעיכול אנזימטי. הוסף שני מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת של Hanks'Balanced בתוספת קולגנאז D ו-DNase 1 לכל שפופרת, ואטום את המכסים היטב עם Parafilm.

לאחר מכן, דגרו את הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ונערו אותם כל חמש דקות. כדי לעצור את העיכול, הניחו את הצינורות על קרח. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט דרך מסנן רשת מתכת בגודל 140 מיקרומטר כדי להסיר פסולת גדולה.

בעזרת עלי זכוכית, נתק בעדינות את התאים הנותרים על המסנן. שטפו את מסנן רשת המתכת מספר פעמים עם שלושה מיליליטר של מדיום תרבית תאי מיקרוגליה לכל שטיפה. כעת, בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר, אספו את המסנן והעבירו אותו לצינור של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב-500 גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפוך בזהירות את הצינור כדי להשליך את הסופרנטנט. בעזרת מתלה, מגרדים בעדינות את הצינור כדי להשעות מחדש את הגלולה.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של תמיסת מדיום קולואידית על בסיס 37% סיליקה לתאים המרחפים. צנטריפוגה את התמיסה ב-500 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם כוח שבירה מינימלי. בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר שואבים את שכבת המיאלין מהחלק העליון של התמיסה.

כדי לשטוף את התאים, הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס, וצנטריפוגה את הצינור ב-500 גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט והשעיית הגלולה, הוסף 10 מיליליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט לצינור. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה הסופית במאגר הנותר ליישומים במורד הזרם.

העבירו את כל התאים המבודדים לצלחת של 96 בארות עם תחתית חרוטית. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הפוך במהירות את הצלחת בתנועה אחת כדי להשליך את הסופרנטנט.

לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת התא ב-25 מיקרוליטר של תמיסת חסימה, ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להכין את תערובת צביעת הנוגדנים החוץ-תאית, צנטריפוגה את צינורות מלאי הנוגדנים ב-10,000 גרם כדי להסיר אגרגטים. מבלי להפריע לגלולה, שאפו את הנפח הנדרש מהסופרנטנט.

באמצעות מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלורסנט, התאם את הנפח הכולל ל-25 מיקרוליטר. כעת, הוסיפו 25 מיקרוליטר מתערובת צביעת הנוגדנים החוץ-תאית לכל באר, ודגרו על הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מבלי לערבב, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט לכל באר.

צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפוך את הצלחת במהירות כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת. השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל פלואורסצנטי, וצנטריפוגה כפי שהודגם קודם לכן.

השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ספונין-פרפורמלדהיד כדי לתקן ולחלחל לתאים. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור. מבלי לערבב, הוסיפו 100 מיקרוליטר מאגר ספונין לכל באר.

צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 גרם למשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת, והשהה מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר ספונין. לאחר מכן, הכינו בקרות פיצוי על ידי הוספת 20 מיקרוליטר חרוזים ל -11 בארות ריקות.

כדי להכין את תערובת צביעת הנוגדנים התוך-תאיים, צינורות נוגדנים צנטריפוגות ב-10,000 גרם כדי להסיר אגרגטים פוטנציאליים. מבלי להפריע לגלולה, שאפו את הנפח הנדרש מהסופרנטנט. כוונן את עוצמת הקול ל-50 מיקרוליטר באמצעות מאגר ספונין.

לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא ב-50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים תוך-תאיים. הוסף מיקרוליטר אחד מכל נוגדן לבארות החרוזים המתאימות, ודגר את הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מבלי לערבב, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר ספונין לכל באר המכילה דגימות תאים.

הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט לכל באר בקרת פיצוי כדי לשטוף את החרוזים. לאחר שהצלחת צנטריפוגה, השעו מחדש את גלולת התא והבקרות ב-200 מיקרוליטר של מאגר ספונין ומאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט, בהתאמה. צנטריפוגה את הצלחת ב-500 גרם למשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והוציאו את הסופרנטנט.

השעו מחדש הן את דגימות התאים והן את בקרות הפיצוי ב-200 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט. העבירו את המתלים לצינורות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנט. ריצוף RNA של תא בודד זיהה אשכול מיקרוגליה מובהק נפרד מסוגי תאי מוח אחרים על סמך פרופילי שעתוק.

ניתוח ביטוי דיפרנציאלי חשף גנים מווסתים משמעותית במיקרוגליה, כולל Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 ו-P2ry12. תאי מיקרוגליה בודדו בהצלחה מדגימות מוח חיות על סמך הביטוי המובהק שלהם של סמני CD45 ו-CD11b. תת-אוכלוסיות מיקרוגליאליות מובחנות זוהו על סמך שילובים של סמני הפעלה, כולל CD80, CD86, iNOS, CD206 ו-Arg1, CD86 ו-CD64, ו-CD163 עם CD206.

ביטוי גן סמן של Ptprc ו-Itgam היה ממוקם במיוחד לאשכול המיקרוגליה בהקרנת ה-umap, מה שאישר את זהותם של תאים אלה. ניתוח עלילת כינור הראה ביטוי נמוך יותר של סמנים אנטי דלקתיים, כגון Fcgr1 ו-Cd86, במיקרוגליה מטופלת בהשוואה לבקרת רכב.