Name: זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: למדו זרימה ציטומטרית ו-RNA תא בודד לאפיון מיקרוגליה במוח עכבר לאחר לידה. השיטה משלבת הפרדה אנזימטית וצנטריפוגציית פרקול לבידוד תאים וחשיפת הטרוגניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+and+functional+development%3A+Genetics+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain structural and functional development: Genetics and experience.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+functional+alteration+and+increased+diversity+in+the+challenged+brain%3A+Insights+into+novel+targets+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun+Health%22%5BJournal%5D)">Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention.</a> Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).</li>
<li>Salter, M. W., Beggs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublime+microglia%3A+Expanding+roles+for+the+guardians+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS.</a> Cell. 158 (1), 15-24 (2014).</li>
<li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+microglia+in+brain+development%2C+tissue+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).</li>
<li>Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development and regeneration.</a> Development. 149 (8), dev200425(2022).</li>
<li>Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+in+early+neurodevelopment+and+the+effects+of+maternal+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation.</a> Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Front Immunol. 9, 1014(2018).</li>
<li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain%3A+Systematic+review+and+isolation+methods%27+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+the+microglia+isolation%3A+Overview+and+comparative+analysis+of+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches.</a> Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).</li>
<li>Walker, D. G., Lue, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+phenotypes+of+microglia+in+human+neurodegenerative+disease%3A+Challenges+to+detecting+microglial+polarization+in+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains.</a> Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+microglia+throughout+the+mouse+lifespan+and+in+the+injured+brain+reveals+complex+cell-state+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).</li>
<li>Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+in+the+brain%3A+How+metabolism+shapes+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function.</a> Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+unique+TGF-%CE%B2-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+drives+selection+and+function+of+enhancers+controlling+tissue-specific+macrophage+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities.</a> Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).</li>
<li>Chometon, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+monocyte+isolation+and+generation+of+singular+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.</a> PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).</li>
<li>Skog, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzymatic+digestion+on+cultured+epithelial+autografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts.</a> Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>140 ומיקרו; מסנן רשת מתכת M&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>צינור 15 מ"ל</td><td>סרשטדט</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>צינור 5 מ"ל</td><td>סרשטדט</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>צלחת באר 96 עם תחתית חרוטית&nbsp;</td><td>סרשטדט</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>ארגינאז 1 - מצומד Pecy7 - שיבוט : A1exF5</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים פלואורסצנטיים יציבים על השולחן</td><td>Invitrogen</td><td>א49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Conjugate Fitc - שיבוט : M1/70</td><td>ב.ד. פארמינגן</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - מצומד SB600 - שיבוט : TNKUPJ</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - נגמ"ש מצומד - שיבוט : C068C2</td><td>ביולג'נד</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - מצומד A700 - שיבוט : 30-F11</td><td>ב.ד. פארמינגן</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - מצומד&nbsp; PerCP-eF710 - שיבוט : X54-5 / 7.1</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - מצומד SB436 - שיבוט : 16-10A1</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - מצומד Pe - שיבוט : GL-1</td><td>ביולג'נד</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז ד</td><td>סיגמא&ndash; אולדריץ'</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>דנאס א</td><td>סיגמא&ndash; אולדריץ'</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>סיגמא&ndash; אולדריץ'&nbsp;</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של האנק) פי 10</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>311506CL</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>VWR בינלאומי</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>הפס</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>330.050.אל</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - מצומד PE- eF610 - שיבוט : CXNFT</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>חי/מת Amcyan</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>מדיה של תרבית תאי מיקרוגליה</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא&ndash; אולדריץ'&nbsp;</td><td>עמ' 6148</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש נגד עכבר CD16/CD32</td><td>BD ביוסיינס&nbsp;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>ספונין</td><td>סיגמא&ndash; אולדריץ'&nbsp;</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>ספריות scRNAseq</td><td>פי 10 גנומיקה</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>מדיום קולואידי מבוסס סיליקה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>טריפאן כחול</td><td>ג'יבקו</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

פרוטוקול זה מנצל ביעילות את ציטומטריית הזרימה כדי לאפיין אוכלוסיות תאי מיקרוגליה בדגימות מוח של עכברים, בהתבסס על ביטוי של סמנים נבחרים על פני השטח ותוך התאים. הסעיפים הבאים מפרטים את התוצאות המתקבלות משלבי המפתח של זרימת העבודה, תוך הדגשת ההתפלגות וההטרוגניות של תת-קבוצות מיקרוגליה בתגובה לתנאי הניסוי.
אימות אסטרטגיית תגמול ושער חרוזי פיצוי שימשו לכיול אותות פלואורסצנטיים ולתיקון חפיפה ספקטרלית בין פלואורוכרומים. אוכלוסיות חיוביות ושליליות עבור כל פלואורוכרום הופרדו בבירור, מה שאפשר יצירת מטריצת פיצוי מדויקת. ספי השער אומתו בתחילה באמצעות בקרת פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) במהלך אופטימיזציה של הפאנל כדי להבחין בין אות אמיתי לרקע, במיוחד עבור סמנים גרועים או חופפים. לאחר מכן נעשה שימוש חוזר בספים אלה בניסויים תוך שימוש באותם לוחות צביעה והגדרות ציטומטר כדי להבטיח עקביות. בקרות איזוטיפ נכללו כדי לנטר קשירה לא ספציפית פוטנציאלית, במיוחד עבור סמנים תוך-תאיים, אך לא שימשו להחלטות שער.
זיהוי תאי מיקרוגליה אסטרטגיית שער התאים החיים/מתים (Amcyan) הוציאה בהצלחה תאים מתים. אסטרטגיית השער בודדה ביעילות אוכלוסיות תאי מיקרוגליה על סמך ביטוי CD45 (AF700) ו-CD11b (FITC). הפרמטרים של פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד (SSC) היו ממוטבים (FSC = 300, SSC = 200) כדי למרכז את אוכלוסיית המיקרוגליה בתוך תרשים הנקודות (איור 5).
פנוטיפ תאי מיקרוגליה ניתוח תרשים נקודות איפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות מיקרוגליה על סמך ביטוי דיפרנציאלי של סמנים פני השטח והתוך-תאיים. באמצעות אסטרטגיות שער ספציפיות בתוכנת FlowJo, זוהתה תת-קבוצה של תאי מיקרוגליה המבטאים CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) ו-iNOS (PE-eFluor 610) (איור 6A). שער כפול שימש גם להגדרת תת-קבוצות המבטאות CD206 (APC) ו-Arg1 (PE-Cy7) (ראה איור 6B). אוכלוסיות נוספות אופיינו בביטוי משותף של CD86 (PE) ו-CD64 (PerCP-eFluor 710), כמו גם CD163 (Super Bright 600) ו-CD206 (APC) (איור 6C,D). פרופילים פנוטיפיים אלה משקפים הטרוגניות המוגדרת על ידי סמן בתוך אוכלוסיית המיקרוגליה ומדגימים את יכולתו של פרוטוקול זה להבחין בין תת-קבוצות מובחנות מרובות מבחינה שעתוק ואימונולוגית מבלי להסיק מצבים תפקודיים קבועים.
ניתוח תא בודד מיקרוגליה קירוב והקרנה של סעפת אחידה (UMAP) שימשו להמחשת הטרוגניות תאית וזיהוי אשכולות תאי המיקרוגליה בין סוגי תאי מוח אחרים. כל נקודה מייצגת תא בודד, והאשכול מקודד בצבע בהתבסס על דמיון שעתוק (איור 2).
ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע בתוך אשכול המיקרוגליה כדי לזהות גנים המווסתים בתנאי ניסוי. גנים עם ערך P מותאם ≤ 0.05 נחשבו לביטוי דיפרנציאלי.
תרשים הר געש נוצר כדי להמחיש את הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי של תאי מיקרוגליה, תוך הדגשת אלה עם שינוי קפלים גבוה ומובהקות סטטיסטית (איור 4).
כדי להשוות את תוצאות התאים הבודדים הללו לנתוני זרימה ציטומטרית, נבדק הביטוי של סמני מיקרוגליה CD45 ו-CD11b (Ptprc ו-Itgam). UMAP מראה את הביטוי שלהם בתוך אוכלוסיות תאים שונות (איור 7).
לבסוף, הביטוי של סמנים נבחרים הקשורים למערכת החיסון הוערך כדי לאפיין הטרוגניות שעתוק בקרב תאי מיקרוגליה. תרשים כינור מציג את הביטוי של גנים כגון CD80 ו-NOS-, כמו גם Mrc1, Arg1, Fcgr1 ו-CD163 ברמת התא הבודד (איור 8). דפוסי ביטוי סמנים אלה מאפשרים השוואה עם פרופיל מבוסס ציטומטריית זרימה ומדגישים את המגוון המולקולרי של תת-קבוצות מיקרוגליה על פני תנאי ניסוי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
איור 1: בקרת איכות של נתונים טרנסקריפטומיים של תא בודד. (A) התפלגות תכולת הרנ"א המיטוכונדריאלי בין התאים. תאים עם &gt;30% RNA מיטוכונדריאלי לא נכללו כדי להסיר תאים שעלולים להיות לחוצים או גוססים. (B) תאים עם log10GenesPerUMI &gt; 0.75 סוננו החוצה כדי להבטיח יחס גן ל-UMI עקבי ולהפחית רעש מספריות בעלות מורכבות נמוכה. (C) תאים עם פחות מ-500 תעתיקים שזוהו (nUMI) או יותר מ-300 גנים שזוהו (nGENE) לא נכללו גם הם כדי לחסל תאים באיכות ירודה או מרובים. (D) תרשים מתאם של NUMI לעומת nGene הממחיש את ההשפעה של ספי סינון. כפילים שזוהו הוסרו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
איור 2: הדמיית UMAP של טרנסקריפטומים חד-תאיים. תרשים UMAP המציג את התפלגות התאים הבודדים על סמך פרופילים טרנסקריפטומיים שהתקבלו משני בעלי חיים בודדים. כל נקודה מייצגת תא אחד, מקודד בצבע על ידי זהות אשכול. אשכול תאי המיקרוגליה מזוהה בקרב אוכלוסיות תאים אחרות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
איור 3: עקומת ROC של מסווג יער אקראי המוערכת על ידי אימות צולב. עקומת מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) הממחישה את הביצועים של מודל היער האקראי המשמש להבחנה בין מיקרוגליה לסוגי תאי מוח אחרים על סמך פרופילי ביטוי גנים. המודל אומן על קבוצה של ~1000 תאים עם תוויות ידועות והוערך באמצעות אימות צולב פי 10. מבין חמשת המודלים הסטטיסטיים שנבדקו (יער אקראי, רגרסיה לוגיסטית, בייס נאיבי, מכונת וקטור תמיכה ועץ החלטות), מודל היער האקראי השיג את ביצועי הסיווג הגבוהים ביותר. השטח שמתחת לעקומה (AUC) משקף את דיוק המודל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
איור 4: ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי בתאי מיקרוגליה. תרשים הר געש המייצג את השינוי בקפל log2 לעומת ערך ה-P המותאם עבור גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי במיקרוגליה בין שתי קבוצות הניסוי (ביקורת לעומת פגיעה מוחית מוחית). גן מווסת מתבטא יותר בקבוצת העניין (ident.1), וגנים מווסתים מראים ביטוי מופחת בהשוואה לקבוצת הייחוס (ident.2). גנים מרכזיים המתבטאים באופן דיפרנציאלי משמעותי מסומנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
איור 5: אסטרטגיית שער לזיהוי מיקרוגליה על ידי ציטומטריית זרימה. (A) אסטרטגיית שער מיושמת על תאי מוח קטן מעכבר ביקורת ביום 3 לאחר הלידה (P3). (ב) סינגלטים נבחרו כדי לא לכלול כפולות. (C) תאים ברי קיימא זוהו באמצעות צבע בר-קיימא; אירועים עם FSC-A נמוך לא נכללו כדי להסיר פסולת ולהבטיח ניתוח של תאים שלמים. (D) מיקרוגליה זוהו כ-CD45+ ו-CD11b+ עם שתי אוכלוסיות נפרדות: CD45 נמוך-CD11bint עבור מיקרוגליה שקטה ו-CD45int -CD11bגבוה עבור מיקרוגליה מופעלת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
איור 6. אפיון פרופילי ביטוי סמני מיקרוגליה על ידי ציטומטריית זרימה. (A) שער רציף של תאי CD45+ CD11b+ בהתבסס על ביטוי CD80, CD86 ו-iNOS. (ב) זיהוי של תת-קבוצה המבטאת CD206, ואחריה שער המבוסס על ביטוי Arg1. (ג) זיהוי תת-קבוצה המבטאת CD86, ואחריה שער המבוסס על ביטוי CD64. (ד) זיהוי של תת-קבוצה המבטאת CD163, ואחריה שער המבוסס על ביטוי CD206. אסטרטגיות שער אלו ממחישות את ההטרוגניות הפנוטיפית של אוכלוסיות מיקרוגליה על סמך ביטוי סמנים פני השטח והתוך-תאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
איור 7: אישור זהות מיקרוגליה באמצעות ביטוי Itgam ו-Ptprc בנתוני ריצוף RNA של תא יחיד. UMAP מציג את נוף השעתוק של תאי המוח הקטן ב-P15, עם ביטוי גנים של Itgam ו-Ptprc על פני אשכולות. ביטוי משותף של סמנים מיאלואידים קנוניים אלה תומך בזיהוי אוכלוסיות מיקרוגליה ומיישר קו עם סמנים המשמשים בציטומטריית זרימה, ומספק אימות צולב בין ניתוחים טרנסקריפטומיים לניתוחים ברמת החלבון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
איור 8: פרופילי ביטוי של גנים נבחרים הקשורים למערכת החיסון בתאי מיקרוגליה שזוהו על ידי ריצוף RNA של תא בודד. עלילות כינור מציגות את התפלגות ביטוי הגנים עבור CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 ו-CD163 על פני תאי מיקרוגליה בודדים. סמנים אלה קשורים בדרך כלל לתהליכים הקשורים למערכת החיסון וממחישים את ההטרוגניות השעתוק שנצפתה באוכלוסיית המיקרוגליה. נתונים מוצגים הן עבור מצבי בקרה והן עבור פגיעה מוחית מוחית (CBI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: הרכב התמיסות המשמשות לבידוד וצביעה של תאים עצביים. טבלה זו מספקת הרכב מפורט של התמיסות הנדרשות לבידוד תאים וצביעה, כולל הריכוזים והמרכיבים שלהם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>
טבלה 2: ריכוזי תערובת נוגדנים לצביעה חוץ-תאית. טבלה זו מפרטת את ריכוזי הנוגדנים והתמיסה החיה/מתה המשמשת לצביעה חוץ-תאית, ומציינת את הנפחים והדילולים הנדרשים עבור כל נוגדן בתערובת הצביעה עבור דגימה אחת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>
טבלה 3: ריכוזי תערובת נוגדנים לצביעה תוך תאית. טבלה זו מפרטת את ריכוזי הנוגדנים המשמשים לצביעה תוך תאית, ומציינת את הנפחים והדילולים הנדרשים עבור כל נוגדן בתערובת הצביעה עבור דגימה אחת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

המחקר שלנו בוחן כיצד מיקרוגליה משפיעה על תיקון המוח אחרי פגיעה מוחית טרום-לידתית. ואנו שואפים לקבוע אם ויסות פעילות תאי מיקרוגליה יכול לשפר את התוצאות הנוירולוגיות ארוכות הטווח. אני מאמין שזו המורכבות של תגובות תאי המיקרוגליה והאתגרים של תיאור התגובות הללו בצורה המדויקת ביותר כדי לייצג תגובות ומחלות פיזיולוגיות, אך גם פתולוגיות.אנו משתמשים בשיטות שונות, כגון ריצוף RNA של תא בודד וניסויי זרימה ציטומטרית, כדי לאפיין מצבי מיקרוגליה ותפקוד במוח המתפתח לאחר פגיעה טרום לידתית. אתגר מרכזי הוא שימור כדאיות התאים וזהות המיקרוגליה במהלך הבידוד, במיוחד בנקודות זמן של ילודים כאשר מספר תאי המוח הקטן מוגבל. זה מעלה שאלות לגבי האופן שבו עלבונות מוקדמים במוח הקטן מובילים לשינוי שעתוק בתת-אוכלוסיית מיקרוגליה וכיצד טיפולים ממוקדים עשויים לווסת את השינויים הללו.כדי להתחיל, נתחו את אזור המוח הספציפי של עכברים לפי הצורך. בעזרת מלקחיים, העבירו את הרקמה לצלחת פטרי קטנה המכילה מדיום תרבית תאי מיקרוגליה המונח על קרח כדי לשמור על כדאיות התא. בעזרת פיפטה, הסר את מדיום תרבית תאי המיקרוגליה מצלחת הפטרי.לאחר מכן, בעזרת אזמל, חתכו דק את רקמת המוח באותה צלחת פטרי. העבירו את רקמת המוח ההומוגנית לצינורות של חמישה מיליליטר לעיכול אנזימטי. הוסף שני מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת של Hanks'Balanced בתוספת קולגנאז D ו-DNase 1 לכל שפופרת, ואטום את המכסים היטב עם Parafilm.לאחר מכן, דגרו את הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ונערו אותם כל חמש דקות. כדי לעצור את העיכול, הניחו את הצינורות על קרח. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט דרך מסנן רשת מתכת בגודל 140 מיקרומטר כדי להסיר פסולת גדולה.בעזרת עלי זכוכית, נתק בעדינות את התאים הנותרים על המסנן. שטפו את מסנן רשת המתכת מספר פעמים עם שלושה מיליליטר של מדיום תרבית תאי מיקרוגליה לכל שטיפה. כעת, בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר, אספו את המסנן והעבירו אותו לצינור של 15 מיליליטר.לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב-500 גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפוך בזהירות את הצינור כדי להשליך את הסופרנטנט. בעזרת מתלה, מגרדים בעדינות את הצינור כדי להשעות מחדש את הגלולה.לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של תמיסת מדיום קולואידית על בסיס 37% סיליקה לתאים המרחפים. צנטריפוגה את התמיסה ב-500 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם כוח שבירה מינימלי. בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר שואבים את שכבת המיאלין מהחלק העליון של התמיסה.כדי לשטוף את התאים, הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס, וצנטריפוגה את הצינור ב-500 גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט והשעיית הגלולה, הוסף 10 מיליליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט לצינור. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה הסופית במאגר הנותר ליישומים במורד הזרם.העבירו את כל התאים המבודדים לצלחת של 96 בארות עם תחתית חרוטית. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הפוך במהירות את הצלחת בתנועה אחת כדי להשליך את הסופרנטנט.לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת התא ב-25 מיקרוליטר של תמיסת חסימה, ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להכין את תערובת צביעת הנוגדנים החוץ-תאית, צנטריפוגה את צינורות מלאי הנוגדנים ב-10,000 גרם כדי להסיר אגרגטים. מבלי להפריע לגלולה, שאפו את הנפח הנדרש מהסופרנטנט.באמצעות מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלורסנט, התאם את הנפח הכולל ל-25 מיקרוליטר. כעת, הוסיפו 25 מיקרוליטר מתערובת צביעת הנוגדנים החוץ-תאית לכל באר, ודגרו על הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מבלי לערבב, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט לכל באר.צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפוך את הצלחת במהירות כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת. השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל פלואורסצנטי, וצנטריפוגה כפי שהודגם קודם לכן.השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ספונין-פרפורמלדהיד כדי לתקן ולחלחל לתאים. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור. מבלי לערבב, הוסיפו 100 מיקרוליטר מאגר ספונין לכל באר.צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 גרם למשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת, והשהה מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר ספונין. לאחר מכן, הכינו בקרות פיצוי על ידי הוספת 20 מיקרוליטר חרוזים ל -11 בארות ריקות.כדי להכין את תערובת צביעת הנוגדנים התוך-תאיים, צינורות נוגדנים צנטריפוגות ב-10,000 גרם כדי להסיר אגרגטים פוטנציאליים. מבלי להפריע לגלולה, שאפו את הנפח הנדרש מהסופרנטנט. כוונן את עוצמת הקול ל-50 מיקרוליטר באמצעות מאגר ספונין.לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא ב-50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים תוך-תאיים. הוסף מיקרוליטר אחד מכל נוגדן לבארות החרוזים המתאימות, ודגר את הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מבלי לערבב, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר ספונין לכל באר המכילה דגימות תאים.הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט לכל באר בקרת פיצוי כדי לשטוף את החרוזים. לאחר שהצלחת צנטריפוגה, השעו מחדש את גלולת התא והבקרות ב-200 מיקרוליטר של מאגר ספונין ומאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט, בהתאמה. צנטריפוגה את הצלחת ב-500 גרם למשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והוציאו את הסופרנטנט.השעו מחדש הן את דגימות התאים והן את בקרות הפיצוי ב-200 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט. העבירו את המתלים לצינורות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנט. ריצוף RNA של תא בודד זיהה אשכול מיקרוגליה מובהק נפרד מסוגי תאי מוח אחרים על סמך פרופילי שעתוק.ניתוח ביטוי דיפרנציאלי חשף גנים מווסתים משמעותית במיקרוגליה, כולל Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 ו-P2ry12. תאי מיקרוגליה בודדו בהצלחה מדגימות מוח חיות על סמך הביטוי המובהק שלהם של סמני CD45 ו-CD11b. תת-אוכלוסיות מיקרוגליאליות מובחנות זוהו על סמך שילובים של סמני הפעלה, כולל CD80, CD86, iNOS, CD206 ו-Arg1, CD86 ו-CD64, ו-CD163 עם CD206.ביטוי גן סמן של Ptprc ו-Itgam היה ממוקם במיוחד לאשכול המיקרוגליה בהקרנת ה-umap, מה שאישר את זהותם של תאים אלה. ניתוח עלילת כינור הראה ביטוי נמוך יותר של סמנים אנטי דלקתיים, כגון Fcgr1 ו-Cd86, במיקרוגליה מטופלת בהשוואה לבקרת רכב.

flow-cytometry-single-cell-analysis-for-characterizing-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Microglia תושב מקרופאגים הם המספקים את השורה הראשונה של מעקב ההגנה החיסונית של מערכת העצבים המרכזית. מיקרו RNA הם מולקולות רגולטוריות כי לשחק תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת והבחנה של מקרופאגים. במאמר זה נתאר את שיטת המדידה של מיקרו RNA ב microglia.

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

הפעלת המיקרוגלים וmicrogliosis הן תגובות מפתח לניוון של מערכת עצבים כרוניות. כאן, אנו מציגים שיטות לin vivo, הדמיה לטווח הארוך של תאים ברשתית microglial CX3CR1-GFP + על ידי ophthalmoscopy confocal, ולסף וmorphometric מנתח לזהות ולכמת ההפעלה שלהם. אנו עוקבים אחר שינויי microglial בגלאוקומה הקשורות לגיל שלבים מוקדמים.

בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

פרוטוקול זה מספק ניתוח של subplopulations macrophage במערכת העצבים המרכזית עכבר מבוגר על ידי cytometry הזרימה והוא מועיל לחקר סמנים מרובים לידי ביטוי על ידי תאים אלה.

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוביות vGLUT1 וסינפטוזומים גולמיים מסומנים באדום pHRodo באמצעות ציטומטריית זרימה.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבודד ולטהר מיקרוגליה ראשונית בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים, ואחריו הוראות לביצוע הקלטות טלאי-מהדק של תאים שלמים על תאים מבודדים אלה באופן חריף.

בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

למדו זרימה ציטומטרית ו-RNA תא בודד לאפיון מיקרוגליה במוח עכבר לאחר לידה. השיטה משלבת הפרדה אנזימטית וצנטריפוגציית פרקול לבידוד תאים וחשיפת הטרוגניות.

זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

גלה סרטונים נוספים