June 13th, 2025
אנו מתארים פרוטוקול לשיטת שיבוט בתפוקה גבוהה, שיבוט מעבורת מבוסס CRISPR (שיבוט CRISPRshuttle), המאפשר העברת מקטעי DNA מעניינים בין וקטורים ללא צורך בהגברת PCR של שברי ה-DNA.
אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לשיטת שיבוט בתפוקה גבוהה, CRISPRshuttle. הכרוך בהעברת שברי DNA מטרה בין וקטורים ללא צורך בהגברת PCR של שברי ה-DNA. טכניקות קיימות כגון עירוי שער והגברת PCR של שיבוט חד-וקטורי. גישה זו מחייבת נהלים ספציפיים לקטעים כולל תכנון ראשוני ואימות הפרשה. תגים אלה הם עתירי עבודה וגוזלים זמן. מעבורת CRISPR מבטלת PCR תוך העברת שברי DNA מטרה בין וקטורים לתגובות מבחנה עוקבות. שיטה זו עולה על הצורך בטיפול ספציפי לשברים ובכך מאיצה את בניית הדגימה.
[קריין] כדי להתחיל, הכינו תערובת מאסטר למספר נתון של תגובות עיכול על ידי שילוב הריאגנטים המוצגים על המסך. מסדרים צינורות 0.2 מיליליטר מסומנים כראוי בבלוק קירור מאלומיניום על קרח. הכן את תערובת המאסטר למספר N של תגובות על ידי ערבוב כמויות מתאימות של מאגר CAS9 sgRNA 10 CAS9 ומים שטופלו ב-DEPC. מערבבים היטב את תערובת המאסטר ומסובבים אותה. Aliquot 3.75 מיקרוליטר של תערובת המאסטר לכל צינור תגובה. הוסף 0.75 מיקרוליטר של 0.03 פלסמיד מיקרו-מולרי PLX 304 ORF לכל צינור מעורבב היטב ודגר את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הכן תערובת מאסטר על ידי שילוב של 0.14 מיקרוליטר של 3.36 מיקרו-מולרי ליניארי pBIDC-UASC-pLXvect ו-1.8 מיקרוליטר של תערובת מאסטר הרכבה של גיבסון. מערבבים היטב את תערובת המאסטר ומסובבים אותה. עכשיו מכסים 1.94 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל צינור. הוסף 1.66 מיקרוליטר של פלסמיד שסוע CAS9 לכל צינור. מערבבים היטב ודוגרים בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה. להפשיר תאים חיידקיים מוכשרים על קרח. יש להכניס 10 מיקרוליטר מהתאים המופשרים לכל צינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. מערבבים בעדינות 10 מיקרוליטר מהתאים המוסמכים עם מיקרוליטר אחד של מוצר הרכבה של גיבסון. מניחים את הצינורות על קרח למשך 30 דקות. חשמלו את הצינורות בחום בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן צננו על קרח למשך שתי דקות. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום SOC שחומם מראש לכל צינור ונער ב-250 סל"ד למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לבסוף, הניחו את התאים על צלחות אגר LB המכילות 15 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול ודגרו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. איור זה מציג את התוצאות המייצגות מניתוח ההגבלה של פלסמידים UAS-cDNA/ORF שנוצרו באמצעות מערכת CRISPRshuttle. בניתוח זה, עיכול הגבלה של 15 מבני UAS-cDNA/ORF עם PVU2 גילה כי כל הדגימות הציגו את דפוסי השברים הצפויים בכ-1072 זוגות בסיסים ו-1,820 זוגות בסיסים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
מאמר זה מציג פרוטוקול לשיטת שיבוט תפוקה גבוהה הידועה בשם שיבוט מעבורת מבוסס CRISPR (שיבוט CRISPRshuttle). טכניקה חדשנית זו מאפשרת העברת שברי DNA בין וקטורים ללא צורך בהגברה באמצעות PCR.
High-throughput generation of genome-wide plasmid libraries is a critical enabler for systematic gene function studies and target validation in biopharma R&D. CRISPR-based shuttle cloning (CRISPRshuttle) eliminates PCR amplification, streamlining the transfer of DNA fragments between vectors and accelerating library construction. This capability enhances predictive confidence and operational efficiency at key discovery inflection points.
CRISPRshuttle cloning integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling seamless transition from hypothesis-driven gene selection to high-throughput construct generation and screening.