Name: שיבוט מעבורות מבוסס CRISPR: שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: למד שיטת שיבוט CRISPRshuttle בתפוקה גבוהה להנדסה גנטית ומניפולציה מולקולרית. טכניקה זו מאפשרת העברת DNA בין וקטורים ללא PCR ומייעלת משמעותית תהליכי שיבוט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>אבקת אגר</td><td>כימבייס</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סנגון</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ניתוח תמונות ג'ל דיגיטלית אוטומטית</td><td>טאנון</td><td>טאנון-2500 ב'</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סנגון</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל E.Z.N.A.</td><td>אומגה</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. ערכת מיני DNA פלסמיד I</td><td>אומגה</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>אקורי-HF</td><td>נב</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>גיבסון אסמבל מאסטר מיקס</td><td>נב</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA מהירה בתפוקה גבוהה</td><td>נב</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA הרכבה מאסטר מיקס</td><td>נב</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>PCR תרמי Cycler</td><td>לונגג'ין</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>פלטינה SuperFi II DNA פולימראז</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>נב</td><td>₪3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>נב</td><td>M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>GenScript</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול</td><td>ג'יצ'ו</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>שימדזו</td><td>ביוספק-ננו</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ליגאז</td><td>פרומגה</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 תא מוכשר כימית</td><td>טרנסג'ן</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>נב</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>אוקסואיד</td><td>ליפ 0021</td><td></td></tr></tbody></table>

שיבוט מעבורות מבוסס crispr: שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

השתמשנו ב-CRISPRshuttle כדי לבנות אוסף פלסמיד UAS-cDNA/ORF המכסה 1,397 גנים אנושיים השמורים בדרוזופילה7. ניתוח הגבלות גילה כי CRISPRshuttle מגיעה ליעילות של 94.5% לשימוש בווקטורי יעד תואמי CRISPRshuttle המכילים שני רצפים חוזרים ו-96.1% לשימוש בווקטורי יעד ללא רצפים חוזרים7. הנתונים שלנו הראו שבאופן כללי ניתן ליצור ~300 פלסמידים באמצעות CRISPRshuttle על ידי שני חוקרים תוך 7 ימים7. העברה מוצלחת של מקטעי cDNA/ORF בתיווך CRISPRshuttle אומתה באמצ...

שיבוט מעבורות מבוסס CRISPR: שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לשיטת שיבוט בתפוקה גבוהה, CRISPRshuttle. הכרוך בהעברת שברי DNA מטרה בין וקטורים ללא צורך בהגברת PCR של שברי ה-DNA. טכניקות קיימות כגון עירוי שער והגברת PCR של שיבוט חד-וקטורי. גישה זו מחייבת נהלים ספציפיים לקטעים כולל תכנון ראשוני ואימות הפרשה. תגים אלה הם עתירי עבודה וגוזלים זמן. מעבורת CRISPR מבטלת PCR תוך העברת שברי DNA מטרה בין וקטורים לתגובות מבחנה עוקבות. שיטה זו עולה על הצורך בטיפול ספציפי לשברים ובכך מאיצה את בניית הדגימה.[קריין] כדי להתחיל, הכינו תערובת מאסטר למספר נתון של תגובות עיכול על ידי שילוב הריאגנטים המוצגים על המסך. מסדרים צינורות 0.2 מיליליטר מסומנים כראוי בבלוק קירור מאלומיניום על קרח. הכן את תערובת המאסטר למספר N של תגובות על ידי ערבוב כמויות מתאימות של מאגר CAS9 sgRNA 10 CAS9 ומים שטופלו ב-DEPC. מערבבים היטב את תערובת המאסטר ומסובבים אותה. Aliquot 3.75 מיקרוליטר של תערובת המאסטר לכל צינור תגובה. הוסף 0.75 מיקרוליטר של 0.03 פלסמיד מיקרו-מולרי PLX 304 ORF לכל צינור מעורבב היטב ודגר את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הכן תערובת מאסטר על ידי שילוב של 0.14 מיקרוליטר של 3.36 מיקרו-מולרי ליניארי pBIDC-UASC-pLXvect ו-1.8 מיקרוליטר של תערובת מאסטר הרכבה של גיבסון. מערבבים היטב את תערובת המאסטר ומסובבים אותה. עכשיו מכסים 1.94 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל צינור. הוסף 1.66 מיקרוליטר של פלסמיד שסוע CAS9 לכל צינור. מערבבים היטב ודוגרים בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה. להפשיר תאים חיידקיים מוכשרים על קרח. יש להכניס 10 מיקרוליטר מהתאים המופשרים לכל צינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. מערבבים בעדינות 10 מיקרוליטר מהתאים המוסמכים עם מיקרוליטר אחד של מוצר הרכבה של גיבסון. מניחים את הצינורות על קרח למשך 30 דקות. חשמלו את הצינורות בחום בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן צננו על קרח למשך שתי דקות. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום SOC שחומם מראש לכל צינור ונער ב-250 סל"ד למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לבסוף, הניחו את התאים על צלחות אגר LB המכילות 15 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול ודגרו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. איור זה מציג את התוצאות המייצגות מניתוח ההגבלה של פלסמידים UAS-cDNA/ORF שנוצרו באמצעות מערכת CRISPRshuttle. בניתוח זה, עיכול הגבלה של 15 מבני UAS-cDNA/ORF עם PVU2 גילה כי כל הדגימות הציגו את דפוסי השברים הצפויים בכ-1072 זוגות בסיסים ו-1,820 זוגות בסיסים.

crispr-based-shuttle-cloning-a-high-throughput-cloning-method

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ניתן להשתמש במתודולוגיות מיקוד גנים כדי ליצור עכברים טרנסגניים עם אללים נוק-אאוט, נוק-אין ומתויגים.  כאן, אנו מתארים שיטה משופרת של קומבינר מחדש ב-E. coli, שאנו מכנים 'תת-שיבוט פלוס הכנסה', שניתן להשתמש בה כדי ליצור וקטורים מכוונים לגנים מותאמים אישית במהירות.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לשיבוט מספר רב של מדריך RNAs לתוך אחד וקטור RNA concatmer מדריך, שהוא שימוש מיוחד ביצירת נוק-אאוט רב גנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR / Cas9. הדור של נוקאאוטס כפול באורגנואידים במעיים מוצג כיישום אפשרי של שיטה זו.

פרוטוקול של נוקאוט גנים מרובים עכבר קטן Organoids באמצעות CISPR-concatemer

. הנה, פשוט, יעיל, בעלת שיטה חסכונית של שיבוט sgRNA מחולקת לרמות.

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

כתב יד זה מתאר שיטה CRISPR-Cas9 מבוססי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) לחקירה פשוט ומהיר של התפקיד של גנים מרובים המועמד בהתפשטות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ב במקביל. טכניקה זו היא מדרגית, יכול להיות מיושם במבנים אחרים סרטן התא גם כן.

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

פרוטוקול זה מתאר את העברת הפלסטיות הגבוהה ביותר של תאי היונקים בצלחת 384-היטב באמצעות טכנולוגיית הפליטה האקוסטית של ה-droplet. הזמן גוזלת, שגיאות-DNA לחילוק ו ריבוב, אבל גם התרגום המקביל מגיב, הם תוכנה מונחה ומבוצעת על ידי מכשיר ננו. התאים הם הנזרע לאחר מכן בארות מלאות אלה.

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), שיטה לבנייה בתפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בדרוזופילה תוך שימוש במשאבי cDNA/ORF הזמינים לציבור. CRISPRmass ניתן ליישם על עריכת ספריות פלסמיד שונות.

הרכבה מודולרית מבוססת CRISPR לבניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF

קו התאים THP-1 נמצא בשימוש נרחב כמודל לחקירת התפקודים של מונוציטים/מקרופאגים אנושיים בתחומי מחקר שונים הקשורים לביולוגיה. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הנדסה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9 ובידוד שיבוטים של תא יחיד, המאפשר ייצור של נתונים פנוטיפיים חסונים וניתנים לשחזור.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

למד שיטת שיבוט CRISPRshuttle בתפוקה גבוהה להנדסה גנטית ומניפולציה מולקולרית. טכניקה זו מאפשרת העברת DNA בין וקטורים ללא PCR ומייעלת משמעותית תהליכי שיבוט.

שיבוט מעבורות מבוסס CRISPR: שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים