שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומספק כלי חשוב לחקר תקשורת תוך-תאית בפתוגנזה של PPDMA הנגרמת בסוכרת חריפה בלבלב. השיטות הנוכחיות לבידוד איים ראשוניים מעכברים מתבססות בעיקר על קניולציה של צינור מרה. טכניקה זו דורשת מיקום מדויק וקנולציה מדויקת של צינור המרה, ואחריה פרפוזיה in vivo של תמיסת הקולגנאז P של פרנכימה הלבלב.

קשה מאוד לבצע זאת ללא הכשרה מיוחדת, והשגת פרפוזיה לבלב יעילה ואפקטיבית היא אתגר. הסרטון הזה מונע שיטה פשוטה ומהירה לבידוד איים ראשוניים המתאימה לחוקרים ללא ניסיון בפרפוזיה. השיטה מאפשרת גם רכישה סימולטנית של תאי אקינר ראשוניים בלבלב, ומספקת כמות מספקת של איים ותאי אקינר איכותיים.

היא מאפשרת לחוקרים לבצע ניסויים באותו הקשר פתולוגי ופיזיולוגי, ובכך להקל על ניתוח מעמיק של מנגנון האינטראקציה בין האיים לתאי האקינרי. בידוד של איי לבלב ו-PACs של תאי הלב האקינריים. הוסיפו את תמיסת המלח המאוזנת של האנק ותמיסת הקולגנאז P לפלטת 12 הבאות, והוסיפו שלושה מיליליטר של תמיסת קולגנאז P לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר לעיכול הבא.

הרדימו את העכבר עם 1.25% טריברומואתנול לפני הניתוח ואחריהם המתת חסד. עשה חתך בטני בצורת V כדי לפתוח את חלל הבטן של העכבר. האיבר הלימפואידי האדום כהה באזור ההיפוכונדרי השמאלי הוא הטחול, והאיבר הלבן שמחובר לטחול הוא הלבלב.

בצע בזהירות ניתוח קהה של הלבלב לאורך הקצה התחתון של הקיבה והחיבור של הלבלב. שטוף את רקמת הלבלב המבודדת בתמיסת המלח המאוזנת של האנק והסרת שאריות מאזנטריות, הטחול ורקמת השומן הפרי-פנקריאטית. העבר את הלבלב המעובד מראש לצלחת 12 בארות שמוסיפה מראש עם שני מיליליטר של תמיסת קולגנאז P.

החזקו את הלבלב במקום עם פינצטה ביד שמאל והשתמשו במזרק של מיליליטר אחד ביד ימין כדי להזריק תמיסת קולגנאז P לפרנכימה של הלבלב עד שהרקמה נראית שקופה ובצקתית. חתוך במהירות את הלבלב לחתיכות של מילימטר עד שניים בקוביות רקמה בעזרת מספריים כירורגיות. חתכו את הקצה המרוחק של אחד עד 1.5 סנטימטרים של קצה פיפטה במיליליטר אחד כדי להגדיל את הפתח, והשתמשו בקצה המותאם הזה כדי להעביר את חלקי רקמת הלבלב יחד עם שני מיליליטר של תמיסת קולגנאז P לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר טעון מראש בתמיסת קולגנאז P.

דגרו את צינור הצנטריפוגה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות, ונערו בעדינות את הצינור כל חמש עד שש דקות במהלך תקופה זו. הוסף 10 מיליליטר של RPMI 1640 מדיום מלא כדי לסיים את אפקט העיכול של תמיסת P קולגנאז. פיפט את הכדור שוב ושוב עם פיפט פסטר של 5 מיליליטר, 15 עד 20 תנועות למעלה ולמטה, עד שאין גושים גדולים ברורים של הרקמה.

הוסף 10 מיליליטר של RPMI 1640 מדיום מלא. לאחר מכן צנטריפוגה ב-180 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. והשליך את הסופרנטנט - החזיר את הגלולה עם 20 מיליליטר של RPMI 1640 מדיום מלא.

סנן את המתלים דרך מסננת של 40 רשתות. לאחר מכן צנטריפוגה ב-180 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליך את הסופרנטנט בעדינות.

הוסף 20 מיליליטר של תמיסת Ficoll כדי להחזיר את הכדור לתלייה. ואז מוסיפים בהדרגה 15 מיליליטר של RPMI 1640 מדיום מלא. בשלב זה, ניתן לראות ממשק נוזלי שקוף.

צנטריפוגה בעדינות ב-640 פעמים G למשך 20 דקות ב-25 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את צינור הצנטריפוגה, ושאף את השכבה הבינונית האדומה העליונה באמצעות פיפט פסטר בנפח חמישה מיליטר. לאחר מכן, שואף בזהירות את האיים המכילים נוזל בממשק שכבת הנוזל והעבר אותם לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 50 מיליליטר.

הוסיפו 20 מיליליטר של RPMI 1640 מדיום מלא. צנטריפוגה ב-180 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט. החזיר את הכדור לתלות עם 20 מיליליטר של RPMI 1640 מדיום מלא.

צנטריפוגה ב-180 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט. החזירו את הכדור לתלות עם 10 מיליליטר של RPMI 1640 מדיום מלא. והעבר אותו לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ.

תחת מיקרוסקופ ביולוגי הפוך בהגדלה של פי 100, יש לבחור איים קטנים ידנית באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר. העבר את האיים הנבחרים לפלטת תרבית תאים בת 24 בארות, טעונה מראש ב-500 מיקרוליטר של RPMI 1640 מדיום שלם לכל באר. השליכו את שכבת תמיסת Ficoll.

החזיר את הכדור עם 10 מיליליטר של DMEM מדיום מלא. סנן דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר. צנטריפוגה ב-180 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.

ולזרוק את הסופרנטנט. החזיר את הכדור עם 10 מיליליטר של DMEM מדיום מלא. צנטריפוגה ב-180 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס וזרקו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, החזירו את הכדור עם חמישה מיליליטר של מדיום DMEM מלא לניסויים הבאים. לאחר צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות תמיסת פיקול, נצפו איים סמוכים לממשק בין שכבת הנוזל השקופה וחסרת הצבע לבין התווך, כאשר חבילות נמצאו כסדימנטים בתחתית הצינור. האיים היו בדרך כלל עגולים בצבע אליפסה, חומים זהובים, עם תפוקה יציבה של 120 פלוס או מינוס חמישה לכל עכבר, איור A ואיור B. איים מבודדים טריים היו כדוריים ומקובלים.

לתאי אקינר היו קצוות אפיקליים כהים יותר עם גרגירי זימוגן נראים והתפוקה הייתה 1.6 עד 1.95 פעמים 10 לתאי כוח שביעיים לכל עכבר. איור C ואיור D. איים וצביעה של תאי קלאסין PI של תאים אקינריים מראים שרוב התאים צובעו קלציאן ירוק, חיים, ומעט PI אדום, מתים. איור A. תמונה ניתוח כמותי מבוסס J מראה שאיים מבודדים ותאי אקינר בעלי שיעורי קיום של 97.52 פלוס או מינוס 0.16% ו-96.55 פלוס או מינוס 0.95% בהתאמה, איור B. תאי אקינר מבודדים בלבלב, פעילות עמילאז בסיסית של 0.79 פלוס או מינוס 0.01 יחידות למיליליטרים. לאחר גירוי עם 10 ננו מולר, 20 ננו-מולר ו-50 ננו-מולר קארולאין, פעילות העמילאז שלהם הייתה 1.45 פלוס או מינוס 0.03 יחידות למיליליטר, 1.65 פלוס או מינוס 0.05 יחידות למיליליטר ו-1.39 פלוס או מינוס 0.02 יחידות למיליליטר בהתאמה. ANOVA חד-כיווני הראה שכל קבוצות הקארולין הציגו פעילות אמילז שונה משמעותית לעומת קבוצת הביקורת, כאשר ערך P כולם היה נמוך מ-0.001.

בנוסף, קבוצת 20 הננומולר הייתה שונה משמעותית מקבוצת 10 ננו-מולר, ערך P קטן מ-0.001, איור A. איים מבודדים בהפרשת אינסולין של 0.27 פלוס מינוס 0.04 ננוגרם למיליליטר לאי לשעה כאשר הם מגורים ב-5.6 מילימולר גלוקוז ו-0.94 פלוס או מינוס 0.04 ננוגרם למיליליטר לאי לשעה עם גלוקוז של 22 מילימולר, GSI שווה ל-3.44, איור ב'. מחקר זה קבע שיטה לבידוד סימולטני של איי עכברים ראשוניים ותאי אקינר בלבלב ללא פרפוזיה מורכבת ב-vivo. עם מחסום טכני ארוך, השיטה קלה לתפעול, ומניבה 120 פלוס או מינוס 5 איים קטנים ו-1.6 עד 1.95 כפול 10 עד שביעית תאי אקינר לכל עכבר, כאשר שני סוגי התאים מראים שיעור כדאיות של מעל 96%. האיים המבודדים מציגים הפרשת אינסולין תקינה על ידי גלוקוז ותאי האצינר רגישים לגירוי קארולין. דבר זה מאשר כי התאים שמתקבלים בשיטה זו בעלי תפקידים שלמים, מה שהופך אותם מתאימים למחקרים על אינטראקציות אקסוקריניות ואנדוקריניות בלבלב.

למרות זאת, השיטה מוגבלת על ידי הצורך בידע בסיסי באנטומיה של העכברים, הצורך בהתאמות מינון תגובה, הגבלות על מספר העכברים המעובדים בו-זמנית, וסיכון היישום הלא מאומת. הוא עדיין מספק פרוטוקול אמין לבידוד תאים לחוקרים שאין להם ניסיון בפרפוזיה.