בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

המחקר שלנו חוקר כיצד מוסדרת סינתזת חלבונים מקומית ותפקידם בתיקון, התפתחות ונייוון עצבי. התקדמויות אחרונות כוללות טכניקות גילוי mRNA ברגישות גבוהה, כמו gdPCR, לזיהוי MRNA אקסונליים בעלי שכיחות נמוכה, ולחלוקת תרביות נוירונים. כדי להתחיל לשלב 250 מיקרוליטר של טריאזול לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בגודל 1.5 מיליליטר המתאים לכל הכניסה לבאר אחת או לתוספת של לוח שישה בארות.

שמור את הצינורות בצד עד שצריך. הוסף שני מיליליטר של PBS סטרילי לכל באר של לוח שני עם שישה בארות, כדי להבטיח שמספר הבארות או הלוחות תואם למספר ההוספות. הוצא את מדיום התרבות מהחלק העליון התחתון של ההכנסה והעבר את התוספת ללוח עם שש בארות המכיל PBS.

עכשיו, בעזרת מלקחיים, מניחים בעדינות את ההכנסה, ואז מוסיפים מעליו שני מיליליטר של PBS. שאף את ה-PBS משני הצדדים וחזור על השטיפה פעמיים. ואז תשאיר את התוספת ב-PBS חדש.

לאחר מכן, השתמש במגרד תאים סטרילי כדי לגרד את כל חלק הנוירון מהחלק העליון של ההכנסה. אסוף את הסומה ליזאט מהתוספה. העבר אותו לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הצינור ב-10,000 עד 15,000 גרם למשך שתי דקות. זרוק את הסופרנטנט ותשהה את הכדור ב-250 מיקרוליטר של טריזול. תתייג את הצינור הזה כחלק מלא של הנוירונים.

כדי לאסוף את חלק הנויריטים, הזז קצה אחד של מטוש כותנה סטרילי באיטיות בתבנית זיגזג מלמעלה למטה בכל צד הנוירון של ההכנסה. סובב את ההכנסה ב-90 מעלות וחזור על זה עם הקצה השני של המטוש. ואז זרוק את המטוש.

השתמש במקלון חדש וזז במעגלים קונצנטריים, החל ממרכז ההכנסה החוצה, תוך הקפדה לנקות גם את ההיקף. הפוך את ההכנסה כך שהצד של הנוירייט יהיה פונה כלפי מעלה. חתוך את הממברנה באמצעות להב סקלפל סטרילי חדש.

הניחו את הממברנה החתוכה לתוך צלחת שש בארות המכילה טריזול כאשר צד הנויריט פונה כלפי מטה. ודא שהממברנה שקועה. עכשיו אסוף את הטריזול שמכיל את הנויריט ליזאט מהבאר.

העבר אותו לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. המשך לבידוד ה-RNA או לאחסן את הסומה והנויריט ליזאטים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר. הכינו תגובות PCR דיגיטליות של טיפות שעתוק הפוך באמצעות Droplet Digital PCR Ready-to-Use Universal Mix ומכוונים לפריימרים ספציפיים עם DNA משלים מתאים.

פיפט את תערובת התגובה לתוך מחסנית יצירת הטיפות. לאחר מכן מוסיפים את שמן הייצור לבארות המיועדות של המחסנית. עכשיו, אטום את המחסנית עם האטם.

יצר את הטיפות באמצעות מחולל הטיפות. לאחר שהטיפות נוצרו, העבירו אותן לפלטת PCR עם 96 בארות ואוטמו בנייר כסף לפני שמכניסים את הפלטה לתרמוסיקלר. פתח את תוכנת QX Manager כדי להתחיל את הניתוח.

לחצו על אפשרות הגלישה ופתחו את הקובץ לניתוח. כאשר הקובץ נטען, תצוגת לוח המחוונים מופיעה בלוח השמאלי. בחר את הבארות המעניינות על ידי לחיצה על מקש Control בזמן הלחיצה.

לחץ על 1D Amplitude כדי להמחיש תרשים נקודות. בחר בארות סף מרובות כדי להחיל את אותו סף על יותר מבאר אחת. הזן את ערך הסף המבוסס על המקום שבו נראית הפרדה ברורה בין טיפות חיוביות לשליליות.

עכשיו תסתכל היטב על חלק הנתונים, המציג את תיאור המדגם, ערכי הריכוז, מספר הטיפות שהתקבלו, וכן ספירת הטיפות החיוביות והשליליות. לחץ על שמור כדי לרשום את תוצאות הסף. כימות RNA באמצעות מבחן ריבו גרין גילה כי חלקי נוירון שלמים הניבו 212.85 ננוגרם RNA לכל אינסרט, בעוד שחלקי נויריטים הניבו 42.75 ננוגרם.

אימות PCR זיהה את סט הפריימר הראשון כספציפי ביותר לתמלול Gap43, והראה תחום יחיד מובחן. תוצאות PCR מעורפלות עבור גמא-אקטין הובילו לבדיקת גרדיאנט טמפרטורה באמצעות סט פריימר שתיים, שהראה הגברה חזקה ביותר ב-55 מעלות צלזיוס. גרפים של משרעת RT-ddPCR הראו הפרדה ברורה של טיפות עבור גמא-אקטין הן בדגימות של נוירונים שלמים והן בדגימות נויריטים, ואישרו זיהוי תמלול אמין.

ב-Gap43, כמעט 23% ממאגר ה-mRNA נמצא בנויריטים, לעומת גמא-אקטין, שבו רק 5% ממאגר ה-mRNA נמצא בנויריטים לעומת כל חלק הנוירונים. הראינו נוכחות של מבני גרנול מאמץ באקסונים בתנאים פיזיולוגיים, המעכבים את סינתזת החלבונים המקומית. הפרוטוקול שלנו מציע שיטה אמינה ועקבית לבידוד תאי עצב ולזיהוי mRNA בסביבה נמוכה.

הניתוח העתידי יתמקד בבידוד ואפיון תת-תחומים אקסונליים מובחנים, כגון אצטרובלי גדילה וציר אקסונים מעבר לניתוח נפח.