Name: בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למדו שיטה לבידוד mRNA אקסונלי באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RT-ddPCR. הפרוטוקול מאפשר כימות מוחלט של תעתיקים בנפח נמוך בנוירונים ונויריטים לחקר תרגום מקומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>תוספות תרבית תאים ללוח 6 בארות, 1.0&nbsp; &mu; גודל נקבוביות, סטרילי</td><td>קורנינג</td><td>353102</td><td>מוצרי צריכה</td></tr><tr><td>תוספות תרבית תאים ללוח 6 בארות, 3.0&nbsp; &mu; גודל נקבוביות, סטרילי</td><td>סלטריט</td><td>230603</td><td>מוצרי צריכה</td></tr><tr><td>מרים תאים עם להב צר</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>מוצרי צריכה</td></tr><tr><td>לוחות תרבית רקמה של CELLSTAR 6-well</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>מוצרי צריכה</td></tr><tr><td>ddPCR 96-לוחות באר&nbsp;</td><td>ביו-רד</td><td>12001925</td><td>מוצרי צריכה</td></tr><tr><td>שמן קורא טיפות ddPCR &nbsp;</td><td>ביו-רד</td><td>1863004</td><td>ריאגנטים</td></tr><tr><td>מחסניות DG8 לגנרטור טיפות QX200/QX100</td><td>ביו-רד</td><td>1864008</td><td>מוצרי צריכה</td></tr><tr><td>למינין</td><td>גיבקו/פישר סיינטיפיק</td><td>23017-015</td><td>ריאגנטים</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>ריאגנטים</td></tr><tr><td>פלטות מיקרו לפלטות שחורות מבוססות פלואורסצנציה, 96 בארות</td><td>תרמו פישר</td><td>M33089</td><td>מוצרי צריכה</td></tr><tr><td>אטם חום לפלטת PCR, נייר כסף, חדיר</td><td>ביו-רד</td><td>1814040</td><td>מוצרי צריכה</td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P1274</td><td>ריאגנטים</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>ביו-רד</td><td>12015382</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>תוכנת QuantaSoft</td><td>ביו-ראד</td><td></td><td>תוכנת ניתוח נתוני PCR</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת ריבוגרין ו-RNA כמותית</td><td>תרמו פישר</td><td>R11490</td><td>ריאגנטים</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>ביו-רד</td><td>1864034</td><td>ריאגנטים</td></tr><tr><td>שמן ייצור טיפות QX200 עבור EvaGreen</td><td>ביו-רד</td><td>1864005</td><td>ריאגנטים</td></tr><tr><td>מחולל טיפות QX200</td><td>ביו-רד</td><td>17005227</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>קורא טיפות QX200</td><td>ביו-רד</td><td>17005228</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>ריאגנט טריזול</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>ריאגנטים</td></tr></tbody></table>

בידוד וכימות של mrna אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-rtddpcr

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

נוירונים קורטיקליים עובריים ראשוניים, נוירונים מההיפוקמפוס ו-BFCNs המוצבים על אינסרטים מצופים PLL בגודל 1 מיקרומטר נדבקים בחוזקה ומארחים את הנוירייטים על פני הממברנה ב-5-7 ימים במבחנה (DIV). עד 11 DIV, התרבויות מציגות רשתות צפופות. עבור DRGs של עכברים בוגרים, הוספת שכבת למינין לתוספות 3 מיקרון מצופות PLL מסייעת להשיג הארכה אקסונלית דומה ב-5 DIV. תצפיות אלו מאשרות את יכולת ההכנסות לתמוך בצמיחה ארוכת טווח של נוירונים ולספק חומר אקסוני מספק להפקת RNA במורד הזרם. במקרה הצורך בהרחבה, אנו משלבים מספר תוספות כדי לספק לנו חומר מספק.
הפקת טריזול מהכנסות בודדות מניבה מספיק RNA לשעתוק הפוך ול-ddPCR לאחר מכן. כימות RiboGreen מאשר תפוקות RNA עקביות משברים שלמים של נוירונים (212.85 ng/insert) ותפוקות נמוכות יותר משברים של נויריטים (42.75 ng/insert) (איור 2). בדרך כלל אנחנו מקבלים RNA פי ~5-7 מכל חלק הנוירון לעומת החלק העשיר בנויריט.
כל הפריימרים מאומתים לפני ניסויי RTddPCR. לכל תמלול יעד, לפחות שני סטים של פריימרים מסודרים ונבדקים באמצעות PCR קונבנציונלי על cDNA שנוצר מאותם דגימות נוירונים. זוג הפריימר שמייצר את הרצועה החזקה והספציפית ביותר נבחר עבור RTddPCR (איור 3A). לדוגמה, בחרנו בערכת פריימר 1 עבור Gap43. במקרים של תוצאות דו-משמעיות, כמו אלו שהתקבלו עבור Actγ, אנו מבצעים PCR גרדיאנט לאופטימיזציה של טמפרטורות החישוש (איור 3B). דבר זה מבטיח שרק פריימרים מאומתים היטב משמשים לכימות מוחלט, מה שמפחית את הסבירות ליצירת ארטיפקטים בהפרדת טיפות.
הליך הגירוד והדגימה מפריד באופן אמין בין התאים הסומטיים לנויריטיים. RNA שמבודד מכל חלקי הנוירון מראה העשרת תמלולים, כגון Actγ 46,47,48,49 (איור 4). לעומת זאת, שברי אקסון/נויריט מניבים RNA כולל נמוך משמעותית, בהתאם לנפח המוגבל שלהם, אך מראים העשרה של תמלילים הידועים כממוקמים בתהליכים רחוקים, כמו Gap43 (איור 4). גילוי צולב מינימלי של תמלילים מוגבלים על ידי סומה מצביע על טוהר תא גבוה כאשר ההכנסות מטופלות בזהירות ומצופות בצפיפות אופטימלית.
התוצאות החיוביות מאופיינות ב: (1) מורפולוגיה נוירונית שלמה עם הארכה אקסונלית ברורה, (2) הפרדה נקייה של מחלקות ללא קרע של הממברנה, (3) פריימרים מאומתים שמייצרים הפרדה ברורה בין טיפות חיוביות לשליליות, ו-(4) אותות RTddPCR חזקים לתמלילי אקסון. ניסויים לא אופטימליים גורמים לתפוקת RNA נמוכה, זיהום צולב כפי שניתן לראות על ידי סמני סומה בחלקי נויריטים, או ארטיפקטים של RTddPCR כגון "גשם" טיפות מוגבר עקב דימריזציה של פריימר. בעיות אלו קשורות לרוב לנזק לממברנה הפנימית, לחץ גירוד מופרז או אופטימיזציה לא מספקת לטמפרטורת חימוש הפריימר.
<img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
איור 1: סקירה של בידוד RNA ספציפי לתחום באמצעות תוספות ממברנה. נוירוני מכרסמים גודלו על אינסרטים חדירים למחצה עם גודל נקבובית של 1-3 מיקרון, מה שמאפשר התרחבות נויריטים תוך הגבלת הסומה. להכנת נוירונים שלמים, תאים מהתא העליון נגרדו באמצעות מגרד תאים סטרילי, טופלו ואז פורסמו ב-TRIzol לבידוד RNA, סינתזת cDNA ו-RTddPCR. שאריות תאיות הוסרו מהממברנה המוכנעת באמצעות מטוש כותנה סטרילי. להכנת נויריטים, ממברנת ההכנסה שמכילה כעת רק נוירייטים הופכה ונחתכה עם להב סכין, וטבלה ישירות ב-TRIzol, ולאחר מכן בוצעה בידוד RNA, סינתזת cDNA ו-RTddPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
איור 2: עקומת ריכוז RNA סטנדרטית באמצעות בדיקת RiboGreen. (A) עוצמת הפלואורסצנציה נמדדה באמצעות בדיקת כימות RNA של RiboGreen לאורך סדרת דילול של תקני RNA. ניתוח רגרסיה ליניארית חשף מתאם חזק בין ריכוז ה-RNA לאות הפלואורסצנציה (R² = 0.9956). ערך R² הקרוב לאחד מדגים ליניאריות ואמינות מצוינות של מבחן RiboGreen לכימות RNA מדויק. (B) באמצעות המשוואה (y=19.738x + 14.905) עבור השיפוע שהתקבל ב-A, חושב סך ה-RNA עבור כל שבר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
<img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
איור 3: אימות פריימר באמצעות PCR ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. (א) מוצרי הגברת PCR באמצעות cDNA עבור Actγ ו-Gap43 נפתרו על ג'ל אגרוז 2% להערכת ספציפיות הפריימר. לכל גן נבדקו שתי קבוצות פריימרים עצמאיות (קבוצה 1 וקבוצה 2). סמני גודל DNA (סולמות) מוצגים בנתיבים סמוכים עם משקלים מולקולריים מסומנים (10 קילובאט, 0.5 קילובאט, 0.1 קילובאט). רצועות בודדות מובחנות בגודל הצפוי מאשרות הגברה מוצלחת וספציפיות של קבוצות הפריימר הנבחרות. (B) הגברת PCR בוצעה באמצעות סט פריימר Actγ 2 לאורך גרדיאנט טמפרטורה (55-65 מעלות צלזיוס) לקביעת טמפרטורת החישוש האופטימלית. מוצרים מוגברים נפתרו על ג'ל אגרוז 2% לצד סולם DNA (נתיב 2, גודל מצוין). רצועות בודדות עקביות בגודל הצפוי נצפתו לאורך הטווח הנבדק, כאשר ההגברה החזקה ביותר זוהתה ב-55 מעלות צלזיוס, מה שמרמז שמדובר בטמפרטורה האופטימלית לסט פריימר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
<img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
איור 4: ניתוח RTddPCR של תמלילים נבחרים וכימות עותקי mRNA. (A,B) גרפים חד-ממדיים מייצגים של משרעת חד-ממדית המראים הפרדת טיפות עבור (A) Actγ, ו-(B) Gap43. כל נקודה מייצגת טיפה אחת, כאשר טיפות כחולות מצביעות על הגברה חיובית וטיפות אפורות מצביעות על הגברה שלילית. ציר ה-Y מייצג את המשרעת, וציר ה-X מציין את מיקום הבאר בלוח ddPCR. הפרדה ברורה בין טיפות חיוביות (כחולות) ושליליות (אפורות) מאשרת זיהוי איתן של תמלילי היעד עם קבוצות הפריימר המצוינות. (ג) טבלה המסכמת את מספר העותקים ל-μL והעותקים ל-ng של RNA כולל עבור תמלולים של Actγ ו-Gap43 בחלקי נוירונים ונויריטים שלמים. הערכות מספר עותקים התקבלו מכימות מוחלט באמצעות ספירות טיפות ddPCR (המוצגות בפאנלים A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>

בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

isolation-quantification-axonal-mrnas-using-porous-membrane-inserts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה בידוד וטיהור...

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

נוירונים מאופיינים first electrophysiologically. ואז הציטופלסמה של תא העצב המוקלט aspirated וכפופים להפוך שעתוק-PCR ניתוח כדי לזהות את הביטוי של mRNAs לסינתזה אנזימים הנוירוטרנסמיטר, תעלות יונים, ואת הקולטנים.

פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

מאמר זה מתאר מערכת תרבית עצבית שניתן להשתמש בה כדי להשיג כמויות גדולות של דגימות אקסונליות טהורות לאנליזות ביוכימיות ואימונוציטוכימיות. טכניקה זו תאפשר הבנה משופרת של פיזיולוגיה אקסונלית נורמלית ומסלולי איתות המובילים לניוון עצבי.

הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

במחקר זה, פלטפורמה חדשנית לחקור חתימות מולקולריות intraneuronal של תגובה לטיפול בהפרעה דו-קוטבית (BD) פותחה ומאומת. אפיתל ריח מחולי BD הושג באמצעות ביופסיות האף. אז microdissection לייזר ללכוד היה בשילוב עם זמן אמת RT PCR לחקור את החתימה המולקולרית של תגובה ליתיום בBD.

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי ביטוי microRNA ב קרום עכברוש עכברוש באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז. שיטה זו מתאימה ללימוד פרופיל הביטוי microRNA בקרום עכברוש עכברוש במספר תנאים פתולוגיים.

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

למדו שיטה לבידוד mRNA אקסונלי באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RT-ddPCR. הפרוטוקול מאפשר כימות מוחלט של תעתיקים בנפח נמוך בנוירונים ונויריטים לחקר תרגום מקומי.

בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

גלה סרטונים נוספים