Metodi di base in biologia cellulare e molecolare

Molti esperimenti biomedici richiedono la manipolazione di una quantità nota di cellule, al fine di ottenere dati accurati, riproducibili e statisticamente rilevanti. Pertanto, imparare a contare le cellule è una tecnica particolarmente essenziale per qualsiasi scienziato biomedico di successo. Il modo più comune per contare le cellule è usare un emacitometro - uno strumento che porta due griglie incise al laser, che aiutano nell'enumerazione di una cella aliquota sotto un semplice microscopio...

Le linee cellulari sono spesso utilizzate in esperimenti biomedici, in quanto consentono una rapida coltura ed espansione dei tipi di cellule per l'analisi sperimentale. Le linee cellulari vengono coltivate in condizioni simili rispetto alle cellule appena isolate o primarie, ma con alcune importanti differenze di base: (i) le linee cellulari richiedono i propri cocktail specifici di fattori di crescita e (ii) la loro crescita deve essere monitorata più da vicino rispetto alle cellule primarie,...

La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica utilizzata per amplificare il DNA attraverso il termociclizzazione – cicli di variazioni di temperatura a intervalli di tempo fissi. Utilizzando una DNA polimerasi termostabile, la PCR può creare numerose copie di DNA da blocchi di costruzione del DNA chiamati dNTP. Ci sono tre passaggi nella PCR: denaturazione, ricottura e allungamento. La denaturazione è il primo passo del ciclo e fa sì che il DNA si sciolga interrompendo i legami...

L'elettroforesi su gel di DNA è una tecnica utilizzata per il rilevamento e la separazione di molecole di DNA. Un campo elettrico viene applicato a una matrice di gel composta da agarose e, all'interno del gel, le particelle di carica migreranno e si separeranno in base alle dimensioni. I fosfati caricati negativamente della spina dorsale del DNA fanno sì che i frammenti di DNA si spostino verso l'anodo - un elettrodo caricato positivamente. Il video spiega il meccanismo con cui i frammenti di...

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, o SDS-PAGE, è una tecnica ampiamente utilizzata per separare miscele di proteine in base alle loro dimensioni e nient'altro. SDS, un detergente anionico, viene utilizzato per produrre una carica uniforme attraverso la lunghezza delle proteine che sono state linearizzate. Caricandole prima in un gel a base di poliacrilammide e poi applicando un campo elettrico al gel, le proteine rivestite di SDS vengono quindi separate. Il campo...

La trasformazione è il processo che si verifica quando una cellula ingerisce DNA estraneo dall'ambiente circostante. La trasformazione può avvenire in natura in alcuni tipi di batteri. In biologia molecolare, la trasformazione viene riprodotta artificialmente in laboratorio attraverso la creazione di pori nelle membrane cellulari batteriche. Le cellule batteriche che sono in grado di prendere il DNA dall'ambiente sono chiamate cellule competenti. In laboratorio, le cellule batteriche possono...

Il termine "trasformazione" si riferisce all'ingestione cellulare di DNA estraneo. In natura, la trasformazione può avvenire in alcuni tipi di batteri. In biologia molecolare, tuttavia, la trasformazione è indotta artificialmente attraverso la creazione di pori nelle pareti cellulari batteriche. Le cellule batteriche che sono in grado di prendere il DNA dall'ambiente sono chiamate cellule competenti. Le celle elettrocompetenti possono essere prodotte in laboratorio e la trasformazione di...

Un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) viene in genere eseguito per rilevare la presenza e/o la quantità di una proteina bersaglio di interesse all'interno di un campione sperimentale. Il rilevamento della proteina bersaglio è reso possibile dagli anticorpi, che rendono l'ELISA un test immunologico. Attraverso una serie di fasi di incubazione e lavaggio, questi anticorpi, che sono spesso collegati, o coniugati, a un enzima, rileveranno il rivestimento proteico del fondo di un pozzo...

La purificazione del plasmide è una tecnica utilizzata per isolare e purificare il DNA plasmidico dal DNA genomico, dalle proteine, dai ribosomi e dalla parete cellulare batterica. Un plasmide è un DNA piccolo, circolare, a doppio filamento che viene utilizzato come vettore di specifiche molecole di DNA. Quando introdotto in un organismo ospite attraverso la trasformazione, un plasmide verrà replicato, creando numerose copie del frammento di DNA in studio. In questo video, viene descritta una...

La purificazione del gel viene utilizzata per recuperare frammenti di DNA dopo la separazione elettroforetica. Il recupero del DNA da un gel di acarosio comprende tre passaggi fondamentali: legatura, lavaggio ed eluizione da una colonna di silice. Si ritiene che il DNA si leghi alla silice in presenza di sale alto attraverso un ponte di sale. Dopo il legame, il DNA viene lavato dalle impurità ed eluito in condizioni di basso contenuto di sale interrompendo questa interazione. Questo video...

Western Blotting viene utilizzato per identificare la presenza di proteine specifiche in campioni separati elettroforeticamente. Dopo la separazione con una tecnica nota come elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio, o SDS-PAGE, il trasferimento occidentale viene utilizzato per spostare le proteine da un gel di poliacrilammide su un pezzo di membrana che intrappola le proteine nelle rispettive posizioni. Successivamente, le membrane vengono sonde con anticorpi in un...

La trasfezione è il processo di inserimento di materiale genetico, come il DNA e l'RNA a doppio filamento, nelle cellule di mammifero. L'inserimento di DNA in una cellula consente l'espressione, o la produzione, di proteine utilizzando il macchinario delle cellule, mentre l'inserimento di RNA in una cellula viene utilizzato per down-regolare la produzione di una proteina specifica interrompendo la traduzione. Mentre il sito di azione per l'RNA trasfettato è il citoplasma, il DNA deve essere...

In biologia molecolare, la legatura si riferisce all'unione di due frammenti di DNA attraverso la formazione di un legame fosfodiestere. Un enzima noto come ligasi catalizza la reazione di legatura. Nella cellula, le ligases riparano le rotture a singolo e doppio filamento che si verificano durante la replicazione del DNA. In laboratorio, la DNA ligasi viene utilizzata durante la clonazione molecolare per unire frammenti di DNA di inserti con vettori - molecole di DNA portatrici che...

Gli enzimi di restrizione o le endonucleasi riconoscono e tagliano il DNA in una sequenza specifica. Questi enzimi si trovano naturalmente nei batteri come difesa contro i batteriofagi - virus che infettano i batteri. Gli enzimi di restrizione batterica tagliano il DNA del batteriofago invasore lasciando illeso il DNA genomico batterico a causa dell'aggiunta di gruppi metilici. Questo video spiega i principi di base degli enzimi di restrizione, tra cui: come vengono denominati gli enzimi di...

La clonazione molecolare è un insieme di metodi, che vengono utilizzati per inserire DNA ricombinante in un vettore - un vettore di molecole di DNA che replicherà frammenti di DNA ricombinante negli organismi ospiti. Il frammento di DNA, che può essere un gene, può essere isolato da un campione procariotico o eucariotico. Dopo l'isolamento del frammento di interesse, o inserto, sia il vettore che l'inserto devono essere tagliati con enzimi di restrizione e purificati. I pezzi purificati sono...