Summary
Umano lisato piastrinico è una ricca fonte di fattori di crescita e di un supplemento potente nelle cellule in coltura. Questo protocollo presenta il processo di preparazione di un ampio pool di lisato piastrinico umano partendo da plasma ricco di piastrine, eseguendo numerosi cicli di gelo-disgelo e riducono i frammenti delle piastrine.
Abstract
Fattori di crescita derivato dalle piastrine hanno dimostrato di stimolare la proliferazione cellulare in modo efficiente
Protocol
1. Materiale di partenza
Inizia con plasma ricco di piastrine (PRP) unità preparata da cytapheresis o derivati da buffy cappotti.
2. Sterilità controllo
Per verificare la sterilità prendere un campione di 20 mL da ciascuna unità PRP, trasferendo il volume ad un sacchetto collegato piccolo (Baxter). Scollegare questa borsa mediante saldatura.
3. Congelamento delle unità di PRP
Immediatamente dopo la preparazione, congelare le unità PRP fino ad almeno -20 ° C nel sacchetto originale senza ulteriori manipolazioni.
4. Scongelamento delle unità di HPL
Quando i test batterici sono negativi, disgelo umano unità di lisato piastrinico, ora si chiama unità di HPL a 37 ° C (bagno d'acqua) fino a quando i grumi di ghiaccio scompaiono. Non riscaldare il HPL.
5. Messa in comune delle unità di HPL
Prendere almeno 10-15 unità scongelati HPL per un pool di lisato piastrinico per preparare un prodotto standardizzato. Collegare le sacche HPL consecutivamente per la borsa pooling doppio (MacoPharma) e trasferire la HPL in questi due sacchi. Scollegare le borse vuote HPL mediante saldatura. Ottenere un volume finale di 3 a 4 L di pool di lisato piastrinico umano (pHPL) mescolando il contenuto delle due borse. Collegare un piccolo sacchetto (Baxter) e prendere un campione di 20 mL pHPL per controllare la sterilità del prodotto in pool. Scollegare questa borsa mediante saldatura.
6. Porzionatura dei pHPL
Parte il pHPL per ottenere aliquote adatto per ulteriori elaborazioni. Collegare sacchetti di piccole dimensioni (Baxter) per la borsa pooling doppio (Macopharma) e il trasferimento di volumi fino a 250 ml per le borse di storage di piccole dimensioni (Baxter). Scollegare i sacchi pieni di saldatura.
7. Re-congelamento delle aliquote pHPL
Aumentare il tasso di frammentazione delle piastrine e la quantità di fattori di crescita rilasciati da un ulteriore gelo / disgelo passo. Congelare i sacchetti di pHPL porzionato di nuovo almeno -20 ° C.
8. Re-scongelamento e porzionatura del aliquote pHPL
Scongelare le borse pHPL a 37 ° C (bagno d'acqua). Trasferire il contenuto in flaconcini da 50 ml (Falcons BD) tagliando il tubo del sacchetto con le forbici sterili e versare il pHPL in fiale. Eseguire questo passaggio in un banco a flusso laminare per evitare contaminazioni batteriche o fungine.
9. Rimozione di frammenti di piastrine
Come frammenti di piastrine tendono ad aggregarsi e possono indurre alloimmunizzazione, rimuoverli dalla pHPL. Centrifugare le provette pHPL quindi a 4.000 g (15 minuti, 4 ° C). In una pipetta da banco a flusso laminare il plasma surnatante in fiale stoccaggio finale (Falchi BD) e scartare il pellet di piastrine per evitare di frammenti in coltura cellulare.
10. Conservazione dei pHPL
Congelamento aliquote di 50 ml fiale pHPL ancora almeno-20 ° C e conservarle per uso sperimentale.
11. L'uso di pHPL in coltura cellulare
Inizialmente aggiungere eparina senza conservanti al mezzo per evitare la formazione di gel. Scongelare un'aliquota pHPL a 37 ° C e integrare il terreno di coltura con l'aggiunta di 8 - 10%.
Mezzi
MSC-media:
Utilizzare 500 ml di a-MEM, aggiungere 56 ml di scongelato pHPL (vedi anche riferimento 1 per ulteriori dettagli) e 2 IU / mL (= ml di soluzione madre 224) senza conservanti di eparina (evita la coagulazione del mezzo attraverso aggregazione di il fibrinogeno nel plasma) per raggiungere una concentrazione finale del 10% pHPL. Inoltre aggiungere penicillina (100U/mL) / streptomicina (100μg/mL) soluzione e 2mM di L-Glutamin (entrambi Sigma).
Filtrare il medium attraverso un poro 20 micron filtro dimensioni del vuoto (Millipore). Etichetta della bottiglia appropriato (contenuto, data).
ECFC-media:
Utilizzare una bottiglia (500 ml) di EBM, aggiungere il citochine aliquote, 56 ml di pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl di soluzione madre) di conservanti eparina, penicillina (100U/mL) / Streptomicina (100 g / mL) e 2mM soluzione di L-Glutamin al mezzo basale e il filtro con 20 l poro vuoto dimensione del filtro (Millipore). Etichetta della bottiglia appropriato (contenuto, data).
Figura 1: Preparazione del plasma ricco di piastrine da una donazione di sangue intero da una banca del sangue locale o qualsiasi altro provider autorizzati. Dopo la centrifugazione del sangue può essere separato in plasma, buffy coat e globuli rossi. Quattro unità buffy coat, gruppo sanguigno O e un gruppo sanguigno AB plasma può essere raggruppati prima centrifugazione per separare il plasma ricco di piastrine. A regolare la qualità ricco di piastrine unità di plasma di circa 300mL dovrebbe contenere 1x10 9 piastrine per ml o 3x10 11 platelets totale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In alcune regioni plasma ricco di piastrine (PRP) possono essere ottenuti da buffy-coat altrimenti essendo un prodotto di scarto della confezionato produzione di globuli rossi da donazioni di sangue testato (Figura 1). In modo ottimale, PRP viene utilizzata immediatamente per l'ulteriore preparazione di pHPL, come in piastrine superata concentra la disponibilità di fattori di crescita può essere ridotta a causa di lesioni di stoccaggio delle piastrine e la degradazione 20. Si raccomanda inoltre di produrre PRP abbinando piastrine del sangue di gruppo O con plasma di sangue di gruppo AB per evitare possibili influenze di antigeni ABH e isoagglutinins. Fino ad oggi, colture cellulari sono per lo più utilizzati siero fetale bovino (FBS), che si assume il rischio di xenoimmunization 21 e trasmissione di agenti patogeni conosciuti e sconosciuti. Alternative come mezzi di siero autologo o senza siero non ha ancora riuscire a sostituire FBS in molte applicazioni. 22 In studi precedenti abbiamo confrontato gli effetti di pHPL e FBS sull'espansione delle cellule stromali mesenchimali rivelando una maggiore efficienza di pHPL nella propagazione delle cellule. 7,8,23 L'isolamento e l'espansione su larga scala di cellule progenitrici endoteliali in animali senza siero condizioni in EGM-2 integrato con pHPL è stato dimostrato da Reinisch et. al. 11 e viene presentato come un ulteriore protocollo JOVE da Nicole A. Hofmann. I protocolli per la preparazione di MSC e preparazioni medie ECFC sono descritti nelle figure 2 e 3.
L'uso di pHPL come sostituto potente per FBS rappresenta un passo verso un attraente senza siero animale Manufacturing Practice (GMP) compatibile con lo sviluppo di terapie cellulari per l'applicazione clinica. 9,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per la ricerca austriaco (FWF, concedere N211-NAN per DS) e l'Agenzia austriaca per la promozione della ricerca (FFG, concedere N200 a DS). Gli autori ringraziano URL Claudia per un'eccellente assistenza tecnica e Monica Farrell per la modifica linguistica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double bag (2 x 3.5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | originally for ascites puncture |
| 50 mL Falcon tube | Falcon BD | 2098 | |
| 50 mL Stripettes | Costar | 4501 | |
| Plasma bags (600mL) | Baxter Internationl Inc. | R4R2021 | |
| Sterile tubing welder | Terumo Medical Corp. | TSCD-II | |
| Welding equipment | Fresenius Kabi | Compo Seal | |
| Water bath | |||
| Sterile scissors | |||
| Clamps | |||
| Centrifuge |
References
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
- Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
- Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
- Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
- Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
- Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
- Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
- Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
- Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
- Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
- Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
- Frechette, J. P., Martineau, I. &, Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
- Seghatchian, J., Krailadsiri, P.
- Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
- Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
- Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. , (2009).
- Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. Gad, S. C. , John Wiley and Sons, Inc. 97-115 (2008).
