Summary
lysate الصفيحات الإنسان هو مصدر غني من عوامل النمو وقوية في ملحق ثقافة الخلية. يعرض هذا البروتوكول عملية إعداد مجموعة كبيرة من الصفائح الدموية lysate الإنسان بدءا من البلازما الغنية الصفائح الدموية ، وأداء العديد من تجميد أذاب الدورات واستنزاف شظايا الصفائح الدموية.
Abstract
وقد تبين أن الصفيحات عوامل النمو المشتقة لتحفيز تكاثر الخلايا بكفاءة
Protocol
1. بدءا المواد
تبدأ الصفيحات الغنية وحدات (PRP) البلازما التي أعدتها فصادة الكريات أو مشتقة من المعاطف الشهباء.
2. عقم الاختيار
للعقم الاختيار أخذ عينة من 20 مل من كل وحدة الحزب الثورى عن طريق نقل وحدة التخزين إلى حقيبة صغيرة متصلة (باكستر). قطع هذه الحقيبة التي لحام.
3. تجميد وحدات PRP
مباشرة بعد تحضير وتجميد وحدات PRP وصولا الى ما لا يقل عن -20 درجة مئوية في حقيبة التخزين الأصلي دون مزيد من التلاعب.
4. ذوبان حدات HPL
عندما الاختبارات البكتيرية سلبية ، تحسن الإنسان وحدات lysate الصفائح الدموية ، التي تسمى الآن وحدة HPL عند 37 درجة مئوية (حمام مائي) حتى يختفي الجليد جلطات. لا الدافئة على هبل.
5. تجميع وحدات HPL
يستغرق على الاقل 10-15 حدات HPL إذابة لتجمع الصفيحات one lysate لإعداد المنتج موحدة. توصيل الحقائب HPL تباعا لحقيبة مزدوجة تجمع (MacoPharma) ونقل هبل في هذه الحقيبتين. افصل أكياس فارغة HPL بواسطة اللحام. الحصول على الحجم النهائي من 3 إلى 4 لتر من تجمع الصفيحات lysate الإنسان (pHPL) عن طريق خلط محتويات الحقيبتين. الاتصال حقيبة صغيرة (باكستر) وأخذ عينة من 20 مل pHPL للتحقق من العقم الناتج المجمعة. قطع هذه الحقيبة التي لحام.
6. Portioning من pHPL
جزء من pHPL للحصول على aliquots مناسبة لمزيد من المعالجة. توصيل الحقائب الصغيرة (باكستر) إلى حقيبة تجمع مزدوجة (Macopharma) ونقل كميات تصل الى 250 مل لتخزين الحقائب الصغيرة (باكستر). افصل أكياس مليئة بواسطة اللحام.
7. إعادة تجميد aliquots pHPL
زيادة معدل تجزئة الصفائح الدموية وكمية من عوامل النمو الصادرة عن خطوة التجميد / الذوبان أخرى. تجميد أكياس صغيرة من pHPL مقسمة مرة أخرى على الأقل -20 درجة مئوية.
8. إعادة الذوبان وportioning من aliquots pHPL
ذوبان الجليد في أكياس pHPL عند 37 درجة مئوية (حمام مائي). نقل المحتوى إلى قارورة سعة 50 مل (الصقور دينار بحريني) عن طريق قطع أنبوب من الحقيبة باستخدام مقص العقيمة وسكب pHPL في قوارير. تنفيذ هذه الخطوة في التدفق الصفحي مقاعد البدلاء لتفادي التلوث البكتيري أو الفطري.
9. إزالة شظايا الصفيحات
كما تميل الصفائح الدموية إلى شظايا الركام وربما تتسبب في alloimmunization ، بإزالتها من pHPL. الطرد المركزي قوارير pHPL ذلك في 4000 ز (15 دقيقة و 4 درجات مئوية). في مقعد ماصة الصفحي تدفق البلازما طاف في قنينة التخزين النهائي (الصقور دينار بحريني) ، وتجاهل الكريات الصفيحات لتجنب الشظايا في ثقافة الخلية.
10. تخزين pHPL
تجميد aliquots من 50 قارورة pHPL مل مرة أخرى في أقل من 20 درجة مئوية ، وتخزينها للاستخدام التجريبي.
11. استخدام pHPL في خلية ثقافة
إضافة البداية الهيبارين خالية من المواد الحافظة على المدى المتوسط إلى تجنب تشكيل هلام. أذاب a قسامة pHPL في 37 درجة مئوية ، وتكملة المتوسطة الثقافة عن طريق إضافة 8 -- 10 ٪.
وسائل
MSC - المتوسطة :
استخدام 500 مل من MEM ، إضافة 56 مل من pHPL إذابة (أنظر المرجع أيضا 1 لمزيد من التفاصيل) وحدة دولية / 2 مل (= 224 ميكرولتر من محلول المخزون) من الهيبارين ، الصائن الحرة (يجنب تجلط الدم من خلال تكتل المتوسطة والفيبرينوجين في البلازما) للوصول إلى التركيز النهائي للpHPL 10 ٪. بالإضافة إلى ذلك إضافة البنسلين (100U/mL) / الستبرتوميسين (100μg/mL) من الحل و2mm وL - Glutamin (سواء سيغما).
تصفية المتوسطة من خلال 20 ميكرون ، حجم المسام تصفية فراغ (ميليبور). تسمية زجاجة مناسب (المحتوى والتاريخ).
ECFC المتوسطة :
استخدام زجاجة واحدة (500 مليلتر) من EBM ، إضافة aliquots خلوى ، 56 مل من pHPL ، 10 وحدة دولية / مل (= 1120μl من محلول المخزون) من الهيبارين ، الصائن الحرة ، البنسلين (100U/mL) / الستبرتوميسين (100 غرام / مل) من الحل و2mm وL - Glutamin إلى القاعدية والمتوسطة مع فلتر - 20 ميكرولتر حجم المسام تصفية فراغ (ميليبور). تسمية زجاجة مناسب (المحتوى والتاريخ).
الشكل 1 : إعداد الصفيحات الغنية البلازما من التبرع بالدم الكامل من بنك الدم المحلية أو أي مزود آخر مخول. بعد الطرد المركزي يمكن أن يتم فصل الدم الى البلازما ، ومعطف الشهباء وخلايا الدم الحمراء. ويمكن تجميع أربع وحدات معطف الشهباء ، فصيلة الدم O واحد فصيلة الدم AB البلازما قبل الطرد المركزي لفصل الصفائح الدموية البلازما الغنية. وينبغي أن يكون وحدة الجودة العادية الصفيحات البلازما الغنية 300mL تقريبا تحتوي على الصفائح الدموية في 9 1x10 أو 3x10 مل platele 11TS الاجمالى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ربما في بعض المناطق يمكن الحصول على الصفائح الدموية البلازما الغنية (PRP) من الشهباء ، المعاطف يجري خلاف ذلك مضيعة للمنتج معبأة انتاج خلايا الدم الحمراء من تبرعات الدم اختبار (الشكل 1). على النحو الأمثل ، يتم استخدام PRP على الفور لإعداد المزيد من pHPL ، كما في الصفائح الدموية التي عفا عليها الزمن ويركز على توافر عوامل النمو قد انخفض بسبب الآفات وتدهور تخزين الصفائح الدموية 20. ويوصى كذلك لانتاج الصفائح PRP عن طريق مطابقة لفصيلة الدم O مع بلازما الدم AB المجموعة لتجنب التأثيرات الممكنة للمستضدات ABH وisoagglutinins. حتى الآن ، استخدمت في معظمها الثقافات الخلية مصل بقري جنيني (FBS) والذي يحمل مخاطر xenoimmunization 21 وانتقال مسببات الأمراض المعروفة وغير المعروفة. لم بدائل مثل وسائل الاعلام المصل الذاتي أو مصل الحرة لم تنجح حتى الآن في استبدال FBS في العديد من التطبيقات. (22) وفي دراسات سابقة لدينا مقارنة آثار pHPL FBS وعلى التوسع في الكشف عن خلايا انسجة الوسيطة أعلى كفاءة في نشر pHPL الخلية. وقد تبين 7،8،23 التوسع العزلة واسعة النطاق من الخلايا البطانية السلف في ظل ظروف خالية من المصل الحيواني في EGM - 2 التي تستكمل مع pHPL Reinisch آخرون. ويرد مزيد من بن 11 و كبروتوكول إن الرب بواسطة A. نيكول هوفمان. موصوفة البروتوكولات لإعداد والتحضير لجنة السلامة البحرية في المتوسط ECFC أرقام 2 و 3.
استخدام pHPL بديلا قويا لFBS يمثل خطوة نحو جاذبية الحيوان مصل خالية من ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) المتوافقة مع تطوير علاجات الخلية التطبيق السريري. 9،24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث النمساوية (FWF ، منح N211 - NAN إلى DS) وتعزيز البحوث النمساوية وكالة (FFG ، ومنحة لN200 DS). الكتاب نشكر كلوديا رابط للحصول على مساعدة فنية ممتازة وفاريل مونيكا لتحرير اللغوي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double bag (2 x 3.5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | originally for ascites puncture |
| 50 mL Falcon tube | Falcon BD | 2098 | |
| 50 mL Stripettes | Costar | 4501 | |
| Plasma bags (600mL) | Baxter Internationl Inc. | R4R2021 | |
| Sterile tubing welder | Terumo Medical Corp. | TSCD-II | |
| Welding equipment | Fresenius Kabi | Compo Seal | |
| Water bath | |||
| Sterile scissors | |||
| Clamps | |||
| Centrifuge |
References
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
- Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
- Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
- Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
- Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
- Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
- Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
- Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
- Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
- Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
- Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
- Frechette, J. P., Martineau, I. &, Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
- Seghatchian, J., Krailadsiri, P.
- Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
- Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
- Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. , (2009).
- Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. Gad, S. C. , John Wiley and Sons, Inc. 97-115 (2008).
