Summary
Dit artikel biedt een protocol voor eiwitkwantificering met behulp van de Bradford-test en een smartphone als analytisch apparaat. Eiwitniveaus in monsters kunnen worden gekwantificeerd met behulp van kleurgegevens die zijn geëxtraheerd uit een foto van een microplaat die met een smartphone is gemaakt.
Abstract
Eiwitkwantificering is een essentiële procedure in biowetenschappelijk onderzoek. Van de verschillende andere methoden is de Bradford-test een van de meest gebruikte. Vanwege de wijdverbreide verspreiding zijn de beperkingen en voordelen van de Bradford-test uitputtend gerapporteerd, inclusief verschillende wijzigingen van de oorspronkelijke methode om de prestaties te verbeteren. Een van de wijzigingen ten opzichte van de oorspronkelijke methode is het gebruik van een smartphonecamera als analytisch instrument. Door gebruik te maken van de drie vormen van de Coomassie Brilliant Blue-kleurstof die bestaan in de omstandigheden van de Bradford-test, beschrijft dit artikel hoe eiwit in monsters nauwkeurig kan worden gekwantificeerd met behulp van kleurgegevens die zijn geëxtraheerd uit een enkele afbeelding van een microplaat. Na het uitvoeren van de test in een microtiterplaat, wordt een foto gemaakt met behulp van een smartphonecamera en worden RGB-kleurgegevens uit de foto geëxtraheerd met behulp van een gratis en open-source softwaretoepassing voor beeldanalyse. Vervolgens wordt de verhouding tussen blauwe en groene intensiteit (in de RGB-schaal) van monsters met onbekende eiwitconcentraties gebruikt om het eiwitgehalte te berekenen op basis van een standaardcurve. Er wordt geen significant verschil waargenomen tussen waarden die zijn berekend met behulp van RGB-kleurgegevens en waarden die zijn berekend met conventionele absorptiegegevens.
Introduction
Ongeacht het stroomafwaartse gebruik (bijv. ELISA, enzymkinetiek, western blotting, eiwitzuivering en massaspectrometrie), is eiwitkwantificering cruciaal voor nauwkeurige analyse in biowetenschappelijke laboratoria. Naast het gebruik ervan als secundaire uitlezingen (d.w.z. om de relatieve niveaus van analyten per massa eiwit te berekenen), kunnen eiwitniveaus in een monster ook de gewenste output zelf zijn. Men kan bijvoorbeeld geïnteresseerd zijn in het eiwitgehalte in voedselbronnen1 of in urine2. Er zijn veel methoden beschikbaar om de eiwitconcentratie in monsters3 te meten, waaronder directe UV-absorptiemetingen4, eiwit-koperchelatie 5,6, eiwit-kleurstofbindende colorimetrische assays7 en eiwit-kleurstofbindende fluorescerende assays8. De relevantie van eiwitkwantificering blijkt uit de aanwezigheid van twee artikelen die eiwitmeetmethodenbeschrijven 5,7 in de top-3 van de meest geciteerde literatuur 9,10. Ondanks het feit dat veel auteurs hun eigenlijke citaat verwaarlozen door niet-primaire referenties te citeren of helemaal niets te citeren, bedragen de originele artikelen die de Lowry-eiwittest en de Bradford-eiwittest beschrijven elk > 200.000 citaties.
De populariteit van de Bradford-test komt voort uit de betaalbaarheid, eenvoud, snelheid en gevoeligheid. De test is gebaseerd op de interactie tussen eiwitten en de kleurstof Coomassie Brilliant Blue G onder zure omstandigheden. Onder de omstandigheden van de test (d.w.z. lage pH) bestaat de kleurstof in drie vormen: een rode kationische vorm met λmax bij 470 nm; een groene neutrale vorm met λmax bij 650 nm; en een blauwe anionische vorm met λmax bij 590 nm11,12 (Figuur 1). De kationische vorm overheerst bij afwezigheid van eiwitten. Terwijl eiwitten interageren met de kleurstof, stabiliseren ze de blauwe anionische vorm, waardoor een merkbare verandering in de kleur van de oplossing ontstaat, van bruinachtig naar blauw. Gewoonlijk wordt de verandering in de concentratie van de blauwe vorm van de kleurstof spectrofotometrisch gekwantificeerd, waarvan de absorptie bij 590-595 nm evenredig is met de hoeveelheid eiwit in de test.
Figuur 1: Coomassie briljantblauwe G-absorptiespectra onder de omstandigheden van de Bradford-test. De drie hoofdpieken zijn gemarkeerd met pijlen die de λmax aangeven van de rode (470 nm), groene (650 nm) en blauwe (590 nm) vormen van de kleurstof. Spectra werden geregistreerd in afwezigheid van eiwit (gele lijn) en in aanwezigheid van 3 μg (grijze lijn) en 10 μg (blauwe lijn) runderserumalbumine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het wijdverbreide gebruik van de Bradford-test heeft geleid tot de identificatie van verschillende beperkingen (bijv. variabele reacties op verschillende eiwitten11 en interferentie door lipiden13 en wasmiddelen7) en de ontwikkeling van modificaties om de prestaties ervan te verbeteren (bijv. de toevoeging van wasmiddelen14,15, alkalinisatie14,16 en gebruik van de verhouding van absorptie17). Naast aanpassingen in de test zelf, is ook het gebruik van alternatieve apparaten, zoals smartphones of camera's, om analytische signalen op te vangen beschreven 18,19,20. De ontwikkeling van methoden die gebruik maken van smartphones als draagbare chemische analysatoren is inderdaad een actief onderzoeksgebied geweest. De motivatie voor het gebruik van smartphones komt voort uit de betaalbaarheid, draagbaarheid, gebruiksgemak en wijdverbreide beschikbaarheid van deze apparaten.
Dit artikel biedt een protocol voor eiwitkwantificering met behulp van de RGBradford-assay20, die een smartphone als analytisch apparaat gebruikt. In tegenstelling tot de originele RGBradford-publicatie20 is hier een procedure geïntroduceerd die het kleurextractieproces stroomlijnt. Het omvat het gebruik van een vrij beschikbare softwaretoepassing om automatisch kleurinformatie uit elk putje van een microplaatafbeelding te extraheren, wat veel tijd en moeite bespaart. Dit is een alternatief voor de vorige methode om handmatig één voor één kleurgegevens uit elk putje te verkrijgen met behulp van een softwaretoepassing voor grafische editor20. Uiteindelijk kunnen eiwitniveaus in monsters worden gekwantificeerd met behulp van kleurgegevens die zijn geëxtraheerd uit een foto van een microplaat die met een smartphone is gemaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van het Bradford-eiwittestreagens
- Los 100 mg Coomassie Brilliant Blue G op in 50 ml 95% (w/v) ethanol. Mix tot Coomassie Brilliant Blue G volledig is opgelost.
LET OP: Ethanol is ontvlambaar en veroorzaakt oogirritatie. Vermijd vlammen en gebruik een veiligheidsbril. - Voeg aan de vorige oplossing voorzichtig 100 ml fosforzuur van 85% (m/v) toe.
LET OP: Fosforzuur is corrosief voor metalen en veroorzaakt huidcorrosie, ernstig oogletsel en acute orale toxiciteit. Draag handschoenen en een veiligheidsbril. - Voeg de oplossing met Coomassie Brilliant Blue G, ethanol en fosforzuur langzaam toe aan 600 ml gedeïoniseerd water.
- Verdun de oplossing tot een eindvolume van 1.000 ml. Schaal omhoog of omlaag op basis van het aantal te analyseren monsters. Zoals beschreven in de oorspronkelijke methode7, moeten de uiteindelijke concentraties in het werkende Bradford-reagens 0,01% (m/v) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7% (m/v) ethanol en 8,5% (m/v) fosforzuur zijn.
- Verwijder al het onoplosbare materiaal dat door filtreerpapier filtert (Whatman #1 papier of gelijkwaardig).
- Het reagens is enkele weken stabiel wanneer het bij kamertemperatuur (RT) wordt bewaard en tegen licht wordt beschermd. Filter indien nodig, aangezien zich na verloop van tijd neerslag kan vormen.
OPMERKING: Als alternatief zijn kant-en-klare Bradford-reagentia in de handel verkrijgbaar. Volg de instructies van de fabrikant voor het bereiden van het reagens en ga verder met de volgende stap.
2. Bereiding van standaardoplossingen voor eiwitten
- Bereid een standaardoplossing (zie stap 2.4) van een geïsoleerd eiwit. Een betaalbaar en veelgebruikt eiwit is runderserumalbumine (BSA). Andere opties zijn ovalbumine en rundergammaglobuline.
- Als de molaire absorptie van het standaard gebruikte eiwit bekend is, controleer dan de concentratie van de stockoplossing in een spectrofotometer.
- Voor BSA is een veelgebruikte formule BSA (mg/ml) = (A280/6,6) × 10, waarbij A280 de extinctie is bij 280 nm met een weglengte van 1 cm afgelezen tegen een geschikte blanco (d.w.z.ε 2801% = 6,6)7. Zo heeft 0,8 mg/ml BSA een extinctie van 0,528 bij 280 nm.
- Om de standaardcurve te genereren, bereidt u verschillende verdunningen BSA binnen 0,025 mg/ml en 1,0 mg/ml. Dit resulteert in 0,25-10 μg BSA per putje na toevoeging van een monstervolume van 10 μL per putje.
OPMERKING: Standaardeiwitoplossingen moeten worden bereid in een medium met dezelfde samenstelling (eindconcentratie) als het medium dat wordt gebruikt voor de bereiding van monsters.
3. Analyse
- Verdun de monsters om een eiwitconcentratie te bereiken binnen het standaardcurvebereik van 0,025-1,0 mg/ml. Zorg voor meerdere (ten minste 3) monsterverdunningen binnen het bereik.
OPMERKING: Monsters kunnen worden verdund met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of een andere medium/buffersamenstelling die compatibel is met het Bradford-reagens. De uiteindelijke concentratie van mediumcomponenten mag niet verschillen tussen standaard- en monsters. - Voeg 10 μL van elke eiwitstandaardoplossing toe aan drie putjes (d.w.z. in drievoud) van een microplaat met 96 putjes. Voeg voor het eiwitpunt 0 (nul) 10 μl van de buffer/het medium toe dat is gebruikt voor de bereiding van de standaardoplossingen en monsterverdunningen.
- Voeg aan een andere set putjes 10 μL van elke monsterverdunning toe aan drie putjes (d.w.z. in drievoud) van dezelfde microtiterplaat met 96 putjes. Een benadering is om verschillende volumes van een monster toe te voegen en te vullen met een medium van maximaal 10 μL per putje (bijv. 0,5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL en 8 μL van het monster plus 9,5 μL, 9 μL, 8 μL, 6 μL en 2 μL medium).
- Voeg 250 μL Bradford-eiwittestreagens toe aan alle putjes. Een typische opstelling van de microtiterplaat wordt weergegeven in figuur 2. In dit voorbeeld werd een set blanco putten met 260 μL (het uiteindelijke volume per put) water opgenomen om als blanco te dienen in een microplaatlezer (stap 4.5). Dit is alleen nodig als er ook absorptiegegevens worden verzameld.
OPMERKING: Maak elke keer dat de test wordt uitgevoerd een standaardcurve in dezelfde microplaat van monsters. Met andere woorden, als het aantal monsters een andere plaat vereist, maak dan een andere standaardcurve in de tweede plaat, enzovoort. - Noteer de resultaten (sectie 4) binnen 5-15 min.
Figuur 2: Een typische plaatlay-out voor de Bradford-eiwittest. Blank verwijst naar drie putjes met 260 μL water die als blanco in een microplaatlezer kunnen worden gebruikt. SOA verwijst naar eiwitstandaarden. S1-S6 zijn zes verschillende monsters. SX_1-SX_4 zijn vier verschillende monsterverdunningen voor elk monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Resultaten vastleggen
- Houd in een goed verlichte ruimte de microtiterplaat evenwijdig aan de bank met één hand tegen een egale witte achtergrond (bijv. een vel papier). Zorg voor een nauwkeurige uitlijning door een waterpas op de plaat te plaatsen.
- Houd met de andere hand de smartphone parallel (sommige camera-applicaties geven handig de helling van het apparaat aan) tegen de bank en de microtiterplaat en maak een of meerdere foto's van de hele microtiterplaat (Figuur 3). Schakel op iOS-apparaten de cameraniveau-indicator in de camera-instellingen in door de optie Raster in te schakelen. Schakel op Android-apparaten de cameraniveau-indicator in de camera-instellingen in door Framing Hints in te schakelen.
- Er is geen speciale verlichtingsapparatuur nodig, maar zorg ervoor dat schaduwen en reflecties worden vermeden. Vermijd bijvoorbeeld het schaduwen van de plaat of de achtergrond met de smartphone en vermijd schaduw van de achtergrond met de microplaat. Kleine reflecties in de randen van het putgebied zijn geen probleem; Kleurgegevens kunnen worden geëxtraheerd uit een zeer klein gebied in het midden van elke put.
- Controleer de afbeelding kort op uniformiteit van de achtergrond, schaduwen en reflecties. Kijk ook eens naar de hoek van de putten; Het midden van elke put moet direct zichtbaar zijn (d.w.z. niet achter putwanden).
- Als de vergelijking tussen de absorptiemetingen van microplaten en de kleurgegevens van de afbeelding gewenst is, leest u de microplaat af bij 590 nm en 450 nm in een microplaatlezer21.
Figuur 3: Vastleggen van de resultaten van de Bradford-eiwittest. In een goed verlichte ruimte wordt de microplaat met één hand parallel aan de bank tegen een uniforme achtergrond geplaatst. Met de andere hand wordt de smartphone parallel aan de bank en de microplaat gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Automatisch kleurgegevens extraheren
- Download ImageJ en ReadPlate22, een ImageJ plugin is beschikbaar op https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (dit is een .txt bestand).
- Open ImageJ, klik op Plugins > Install en selecteer het bestand dat in stap 6.1 is gedownload.
- Stel de meetparameters in door te klikken op Analyseren > Metingen instellen en vink de volgende opties aan: Gebied; Standaarddeviatie; Min & max grijswaarde; Gemiddelde grijswaarde; Modale grijswaarde. Stel onderaan het venster Omleiden in op: Geen en Decimalen (0-9): 3.
- Ga naar Bestand > Openen en selecteer de foto van de microplaat die in stap 4 is gemaakt.
- Ga naar Plug-ins > ReadPlate. Lees de instructies en klik vervolgens op OK.
- Selecteer het aantal putjes: 96.
- Met behulp van het rechthoekige selectiegereedschap dat automatisch door de plug-in wordt geladen, maakt u een rechthoek die begint in het midden van het A1-vak en eindigt in het midden van het H12-vakje. Klik vervolgens op OK.
- Selecteer het blauwe kanaal en klik op OK.
- Bevestig de standaardparameters door op OK te klikken.
- Controleer of de software een gebied in elke put heeft afgebakend en of de geselecteerde gebieden geen gebieden met abnormale schaduwen of reflectie bedekken. Klik op OK.
- Sla de resultaten op en herhaal stap 5.8-5.10 voor het groene kanaal.
- Bereken de verhouding tussen blauw en groen met behulp van de modus voor elke kleur.
OPMERKING: De berekening kan handmatig worden uitgevoerd of met behulp van de software van de lezervoorkeuren, zoals R, Microsoft Excel of GraphPad Prism.
6. Kleurgegevens extraheren - handmatig
- Download Inkscape, een gratis en open-source grafische editor.
OPMERKING: Alle software met de kleurkiezer (meestal afgebeeld als een pipet) kan worden gebruikt om de kleur te identificeren en RGB-gegevens te extraheren. - Open Inkscape, ga naar Bestand > Openen. Selecteer de foto van de microtiterplaat die in stap 4 is gemaakt.
- Kies het gereedschap Objecten selecteren en transformeren (S), dat wordt weergegeven als een pijl in de linkerbovenhoek, en klik op de afbeelding. Een stippellijn geeft de selectie aan.
- Selecteer het gereedschap Kleuren kiezen uit afbeelding (D), dat aan de linkerkant wordt weergegeven als een pipet.
- Klik in het midden van een put. De kleur op het onderste paneel ("Vulling:") verandert dienovereenkomstig. Klik op de kleur en er verschijnt aan de rechterkant een tabblad Vulling en lijn .
- Wijzig het vervolgkeuzemenu Vlakke kleur in RGB. Noteer de waarden die worden weergegeven voor de blauwe en groene kanalen voor elke put.
- Bereken de blauw-groenverhouding aan de hand van de geregistreerde waarden.
OPMERKING: De berekening kan handmatig worden uitgevoerd of met behulp van de software van de lezervoorkeuren, zoals R, Microsoft Excel of GraphPad Prism.
7. Standaardcurven bouwen en onbekenden extrapoleren
- Zet de gemiddelde groen-blauwe intensiteitsverhouding uit als functie van de standaardconcentratie van eiwitten.
OPMERKING: Plot de gegevens handmatig of met behulp van de software van de lezervoorkeuren, zoals R, Microsoft Excel of GraphPad Prism. - Bereken de gemiddelde groen-blauwe intensiteitsverhouding voor elk monster en elke verdunning.
- Controleer of het verkregen signaal voor het monster binnen het lineaire bereik van de eiwitstandaard ligt.
- Negeer waarden onder of boven de minimum- of maximumwaarden van de standaardcurve.
- Gebruik de lineaire vergelijking die de standaardcurve beschrijft om de hoeveelheid eiwit in het monster te extrapoleren. Vermenigvuldig de berekende waarden dienovereenkomstig met de verdunningsfactor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4 is een afbeelding van een microplaat waaruit kleurgegevens werden geëxtraheerd en absorptie bij 450 nm en 590 nm werd geregistreerd. De RGB-kleurgegevens die hier als representatief worden gerapporteerd, zijn automatisch verkregen zoals beschreven in sectie 5. Een typisch patroon van kleurgegevens is een toename van de blauwe waarden en een afname van de rode en groene waarden (Figuur 5). Merk op dat ondanks de duidelijke reflectie in alle putjes en een niet perfect uitgelijnde microplaat (Figuur 4), de kleurgegevens die uit de afbeelding zijn geëxtraheerd, de absorptiemetingen nauwkeurig weergeven (Figuur 6). Er is ook een lineair verband tussen monsterverdunning en signaal voor zowel absorptiemetingen als kleurgegevens (Figuur 7). Voor deze representatieve resultaten werden twee monsters gebruikt, een BV-2-cellysaat (B001) en een Galleria mellonella-homogenaat (G001) bereid zoals eerder beschreven20, waarvan 0,5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL en 8 μL voor elk putje werden gebruikt. Het volume werd aangepast tot 10 μL met buffer vóór toevoeging van 250 μL Bradford-reagens.
Figuur 4: Een representatief beeld van een Bradford-testmicrotiterplaat. Let op de lampreflectie op elke put en de verkeerde uitlijning van de putjes (d.w.z. de rechterkant van de plaat is naar beneden gekanteld). Deze moeten zo min mogelijk worden beperkt, maar perfecte uitlijning en verlichting zijn niet nodig (zie representatieve resultaten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kleurintensiteit van de drie RGB-kanalen als functie van de eiwitconcentratie. Elk punt vertegenwoordigt een putje van de standaardcurve in de microtiterplaat die in figuur 4 wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: Absorptiemetingen versus RGB-kleurgegevens geëxtraheerd uit een afbeelding. Elk punt vertegenwoordigt een putje van de standaardcurve in de microtiterplaat die in figuur 4 wordt getoond. De gele arcering vertegenwoordigt het 95%-betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Signaalintensiteit versus samplevolume. Kolommen zijn verschillende signalen van verschillende methoden: absorptiemetingen (Absorbantie) en RGB-kleurgegevens geëxtraheerd (RGB-gegevens). Rijen zijn verschillende monsters: een BV-2-cellysaat (B001) en een Galleria mellonella-homogenaat (G001). Elk punt is de gemiddelde waarde van drie putjes van een bepaald monstervolume. De gele arcering vertegenwoordigt het 95%-betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De standaardcurve (signaal versus BSA-concentratie) moet strikt lineair zijn, zoals weergegeven voor een representatieve standaardcurve die is opgebouwd met BSA-concentraties van 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml en 1,0 mg/ml (Figuur 8).
Figuur 8: Een typische standaardcurve die de lineariteit van de blauw-groenverhouding met de concentratie van runderserumalbumine (BSA) illustreert. De concentraties die worden gebruikt voor een typische standaardcurve zijn 0 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml en 1,0 mg/ml. Elk punt is de gemiddelde waarde van drie putjes van elke BSA-concentratie. Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. De gele arcering vertegenwoordigt het 95%-betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In dit voorbeeld van representatieve resultaten vielen sommige verdunningen niet binnen het lineaire bereik van de standaardcurve (figuur 9). Voor monster B001 resulteerde 8 μL in een signaal boven het hoogste punt van de standaardcurve. In het geval van G001 resulteerden 0,5 μL en 1 μL in signalen onder het laagste punt van de standaardcurve. Voor beide monsters geldt dat deze verdunningen die buiten het lineaire bereik van de standaardcurve liggen, moeten worden weggegooid. Na het negeren van metingen buiten het bereik van de standaardcurve, verschillen de eiwitniveaus die zijn berekend met behulp van absorptiemetingen niet van de niveaus die zijn berekend met behulp van RGB-gegevens voor beide monsters (figuur 10). De vergelijking tussen absorptiegegevens en RGB-gegevens met behulp van een t-toets resulteerde in p = 0,63 voor monster B001 en p = 0,17 voor monster G001.
Figuur 9: Blauw-groenverhouding zoals verkregen met behulp van de RGBradford-methode versus monstervolume. De horizontale lijnen begrenzen de minimale en maximale blauw-groenverhoudingen van de standaardcurve (figuur 8). Blauwe cirkels vertegenwoordigen een BV-2-cellysaat (B001) en rode symbolen vertegenwoordigen een Galleria mellonella-homogenaat (G001). Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Merk op dat sommige monsterverdunningen buiten het bereik van de standaardcurve vallen. De gele arcering vertegenwoordigt het 95%-betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Eiwitconcentratie in twee biologische monsters gekwantificeerd met de Bradford-eiwittest met behulp van conventionele extinctiemetingen (ABS) en de RGBradford-methode (RGB). Blauwe symbolen vertegenwoordigen een BV-2-cellysaat (B001) en rode symbolen vertegenwoordigen een Galleria mellonella-homogenaat (G001). Elke cirkel vertegenwoordigt een enkele bron waaruit gegevens zijn verkregen. Ruiten geven het gemiddelde aan en de verticale lijnen lopen van de minimum- tot de maximumwaarden voor elk monster/elke methode. Er zijn geen verschillen tussen de methoden (B001, t-toets , p = 0,63; G001, t-toets , p = 0,17). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Signalen verkregen met verschillende smartphones. Pearson-correlatiecoëfficiënten voor het signaal (blauw-groenverhouding) verkregen met verschillende smartphonemodellen en het signaal (A590/A450) van de Spectramax iD3-microplaatlezer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft RGBradford, een methode die een smartphonecamera gebruikt om gegevens van een Bradford-eiwittest vast te leggen, kleurgegevens te extraheren en eiwitniveaus in biologische monsters nauwkeurig te kwantificeren, zoals oorspronkelijk onlangs beschreven20. Een verschil met de originele RGBradford-methode is dat hier een procedure werd gebruikt voor het automatisch verkrijgen van kleurgegevens met een ImageJ-plug-in22 . De belangrijkste nieuwigheid van de RGBradford-methode is het gebruik van RGB-gegevens als analytische signalen; zo kan men elk routineprotocol gebruiken dat in zijn laboratorium wordt gebruikt voor eiwitbepaling met Coomassie Brilliant Blue G en er vervolgens een foto van maken en kleurgegevens extraheren. Met andere woorden, stap 1-3 van het protocol kan worden gewijzigd volgens de gebruikelijke procedure die in een bepaald laboratorium wordt gebruikt. Gezien het bestaan van meerdere modificaties van de oorspronkelijke Bradford-eiwittest, kan men degene gebruiken die het beste werkt voor het type/de aard van het monster en doorgaan met het vastleggen van gegevens.
Dit protocol heeft twee kritieke stappen: het vastleggen van foto's en het extraheren van kleurgegevens. Hier en voorheen20 was geen speciale verlichtingsapparatuur nodig en werden bevredigende resultaten verkregen (d.w.z. er was geen verschil tussen de resultaten van absorptiemetingen en kleurgegevens die uit een foto werden gehaald). Toch zou men ervoor kunnen kiezen om een platform te gebruiken om de beeldacquisitie te optimaliseren, bijvoorbeeld met behulp van een transilluminator19,22. Het belangrijkste is om te zorgen voor een uniforme achtergrond en verlichting. Bovendien kunnen gelijkwaardige resultaten worden verkregen met verschillende smartphonemodellen. Ondanks kleine verschillen in het signaal dat met elk apparaat wordt verkregen, zijn er sterke (Pearson's r > 0,99) en significante (p < 0,0001) correlaties tussen vier geteste smartphonemodellen (Samsung S22 Ultra, Apple iPhone 11, Apple iPhone 14 Pro en XIAOMI Redmi Note 9 Pro). Er zijn ook significante correlaties tussen het signaal dat ermee wordt verkregen en het signaal van een plaatlezer (aanvullende figuur 1). In het geval van extractie van kleurgegevens moet voorzichtig worden geweest bij het gebruik van de ReadPlate-plug-in, vooral in de stap voor het controleren van het raster, wanneer men moet inspecteren of het rooster past bij de positie van elk putje. Men moet ervoor zorgen dat de rastercirkels niet de wanden van de putten of een abnormaal gebied bevatten (bijvoorbeeld een gebied met een lichtreflectie). Rasteruitlijning kan vooral moeilijk zijn als de plaat in de afbeelding niet loodrecht op de achtergrond staat, waardoor het moeilijk wordt om een rechthoekige selectie van putten van midden naar midden correct te tekenen (van de linkerbovenhoek naar de rechterbenedenhoek).
De voordelen van de RGBradford-methode, vergeleken met de conventionele spectroscopische metingen, zijn dezelfde als andere methoden die smartphones gebruiken in plaats van gespecialiseerde apparaten (bijv. microplaatlezers). Smartphones zijn overal verkrijgbaar, goedkoper dan spectrofotometers, werken urenlang op batterijen, hebben gegevensopslagcapaciteit en communiceren draadloos en op afstand met andere apparaten. Al met al maken deze het gebruik van de Bradford-eiwittest mogelijk op afgelegen locaties of in niet-standaard laboratoriumomstandigheden, zoals point-of-care-eenheden, klaslokalen, veldexpedities en gemeenschappen met weinig middelen. De gemaakte foto kan dan later verder worden geanalyseerd en geïnterpreteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq, Brazilië) [subsidienummers 428048/2018-8 en 402556/2022-4] en de Universiteit van Brasilia (Brazilië). De auteur bedankt Dr. Duarte Nuno Carvalho en Dr. Evelyn Santos (i3s, Porto, Portugal) voor het beschikbaar stellen van toegang tot hun smartphones die in dit onderzoek zijn gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
- Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
- Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
- Peterson, G. L.
- Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
- Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R.
- Elsevier, B. V. Scopus. , Available from: https://www.scopus.com/ (2022).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
- Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
- Gogstad, G. O., Krutnes, M. -B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
- Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
- Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
- de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
- Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
- Ernst, O., Zor, T.
- Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).
