Summary
この論文では、ブラッドフォードアッセイとスマートフォンを分析デバイスとして使用したタンパク質定量のためのプロトコルを提供します。サンプル中のタンパク質レベルは、スマートフォンで撮影したマイクロプレートの写真から抽出したカラーデータを使用して定量化できます。
Abstract
タンパク質の定量は、ライフサイエンス研究において不可欠な手順です。他のいくつかの方法の中でも、ブラッドフォードアッセイは最も使用されている方法の1つです。ブラッドフォードアッセイは広く普及しているため、その性能を向上させるための元の方法のいくつかの変更を含め、限界と利点が徹底的に報告されています。元の方法の変更点の1つは、分析機器としてスマートフォンのカメラを使用することです。この論文では、ブラッドフォードアッセイの条件に存在する3種類のクマシーブリリアントブルー色素を利用して、マイクロプレートの1枚の写真から抽出したカラーデータを使用して、サンプル中のタンパク質を正確に定量する方法について説明します。マイクロプレートでアッセイを行った後、スマートフォンのカメラで写真を撮影し、その画像から無料のオープンソースの画像解析ソフトウェアアプリケーションを使用してRGBカラーデータを抽出します。次に、タンパク質濃度が不明なサンプルの青と緑の強度の比率(RGBスケール)を使用して、標準曲線に基づいてタンパク質含有量を計算します。RGBカラーデータを用いて計算した値と従来の吸光度データを用いて計算した値との間に有意差は認められなかった。
Introduction
下流の用途(ELISA、酵素動態、ウェスタンブロッティング、タンパク質精製、質量分析など)にかかわらず、ライフサイエンスラボでの正確な分析にはタンパク質の定量が不可欠です。二次読み出し(タンパク質の質量あたりの分析種の相対レベルを計算する)としての使用に加えて、サンプル中のタンパク質レベルは、それ自体が目的の出力になることもあります。例えば、食物資源1や尿2のタンパク質レベルに関心を持つことができます。サンプル3のタンパク質濃度の測定には、UV吸光度の直接測定4、タンパク質-銅キレート化5,6、タンパク質-色素結合比色アッセイ7、タンパク質-色素結合蛍光アッセイ8など、多くの方法があります。タンパク質定量の関連性は、最も引用された文献9,10のトップ3にタンパク質測定法5,7を説明する2つの論文が存在することによって証明されています。多くの著者が、一次文献以外の文献を引用したり、何も引用しなかったりして、実際の引用を無視しているという事実にもかかわらず、Lowryタンパク質アッセイとブラッドフォードタンパク質アッセイを記述した元の論文は、それぞれ200,000>引用されています10。
ブラッドフォードアッセイの人気は、その手頃な価格、シンプルさ、スピード、感度に起因しています。このアッセイは、酸性条件下でのタンパク質と色素Coomassie Brilliant Blue Gとの相互作用に基づいています。アッセイの条件下(すなわち、低pH)では、色素は3つの形態で存在します:470 nmでλmaxを有する赤色のカチオン型。650 nmにλmaxを有する緑色の中性体。λmaxが590 nm11,12の青色アニオン型です(図1)。カチオン型は、タンパク質の非存在下で優勢である。タンパク質が色素と相互作用すると、青色の陰イオン性形態が安定化し、溶液の色が茶色がかった色から青色に顕著な変化が生じます。通常、青色の色素の濃度の変化は分光光度法で定量化され、その590〜595nmでの吸光度はアッセイ中のタンパク質の量に比例します。
図1:ブラッドフォードアッセイの条件下でのクマシーブリリアントブルーG吸収スペクトル。 3 つの主要なピークには、赤色(470 nm)、緑色(650 nm)、青色(590 nm)の色素の λmax を示す矢印が付いています。スペクトルは、タンパク質の非存在下(黄色の線)および3 μg(灰色の線)および10 μg(青の線)のウシ血清アルブミンの存在下で記録されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
ブラッドフォードアッセイの広範な使用は、いくつかの制限(例えば、異なるタンパク質に対するさまざまな応答11、脂質13と界面活性剤7による干渉)の特定と、その性能を改善するための修飾の開発(例えば、界面活性剤の添加14,15、アルカリ化14,16、吸光度の比率の使用17)の開発につながった).アッセイ自体の変更に加えて、分析シグナルを捕捉するためのスマートフォンやカメラなどの代替デバイスの使用も説明されています18,19,20。実際、スマートフォンを携帯型化学分析装置として活用する方法の開発は、活発な研究分野です。スマートフォンを使用する動機は、これらのデバイスの手頃な価格、携帯性、使いやすさ、および広範な可用性に起因しています。
この論文では、スマートフォンを分析デバイスとして使用するRGBradfordアッセイ20を使用したタンパク質定量のためのプロトコルを提供します。元のRGBradford公報20とは対照的に、ここでは、色抽出プロセスを合理化する手順が導入されている。これは、無料で入手できるソフトウェアアプリケーションを利用して、マイクロプレート画像の各ウェルから色情報を自動的に抽出し、時間と労力を大幅に節約することを含みます。これは、グラフィックエディタソフトウェアアプリケーション20を用いて、各ウェルから色データを1つずつ手動で取得する以前の方法に代わるものである。最終的には、スマートフォンで撮影したマイクロプレートの写真から抽出したカラーデータを使用して、サンプル中のタンパク質レベルを定量化できます。
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Protocol
1. ブラッドフォードタンパク質アッセイ試薬の調製
- 100 mgのクマシーブリリアントブルーGを50 mLの95%(w/v)エタノールに溶解します。クマシーブリリアントブルーGが完全に溶けるまで混ぜます。
注意: エタノールは可燃性であり、目の炎症を引き起こします。炎を避け、ゴーグルを使用してください。 - 前の溶液に、100 mLの85%(w / v)リン酸を注意深く加えます。
注意: リン酸は金属を腐食し、皮膚の腐食、深刻な眼の損傷、および急性経口毒性を引き起こします。手袋とゴーグルを着用してください。 - クマシーブリリアントブルーG、エタノール、リン酸を含む溶液を600 mLの脱イオン水にゆっくりと加えます。
- 溶液を最終容量1,000 mLに希釈します。分析するサンプルの数に応じてスケールアップまたはスケールダウンします。元のメソッド7 に記載されているように、作業中の Bradford 試薬の最終濃度は、0.01% (w/v) の Coomassie Brilliant Blue G、4.7% (w/v) のエタノール、および 8.5% (w/v) のリン酸です。
- ろ紙(Whatman#1紙または同等品)でろ過された不溶性材料を取り除きます。
- この試薬は、室温(RT)で保存し、光から保護すると、数週間安定しています。時間の経過とともに沈殿物が形成される可能性があるため、必要に応じてろ過してください。
注:あるいは、すぐに希釈して使用できるブラッドフォード試薬が市販されています。試薬を調製するための製造元の指示に従い、次のステップに進みます。
2. 蛋白質標準液の調製
- 標準として使用する単離タンパク質のストック溶液(ステップ2.4を参照)を調製します。手頃な価格で一般的に使用されているタンパク質は、ウシ血清アルブミン(BSA)です。他の選択肢は、オボアルブミンとウシガンマグロブリンです。
- 標準物質として用いるタンパク質のモル吸収率がわかっている場合は、分光光度計で原液の濃度を確認してください。
- BSA の場合、一般的に使用される式は BSA (mg/mL) = (A280/6.6) × 10 であり、ここで A280 は、適切なブランクに対して読み取られた光路長 1 cm の 280 nm での吸光度です(つまり、ε2801% = 6.6)7。例えば、0.8 mg/mL BSA の吸光度は 280 nm で 0.528 です。
- 検量線を生成するには、0.025 mg/mL から 1.0 mg/mL の範囲で BSA を数倍希釈します。これらは、ウェルあたり10μLのサンプル量を追加した後、ウェルあたり0.25〜10μgのBSAになります。
注:タンパク質標準溶液は、サンプルの調製に使用した培地と同じ組成(最終濃度)の培地で調製する必要があります。
3. アッセイ
- サンプルを希釈して、タンパク質濃度が標準曲線の 0.025-1.0 mg/mL の範囲内に収まるようにします。範囲内に複数(少なくとも 3 つ)のサンプル希釈がある。
注:サンプルは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはブラッドフォード試薬と互換性のあるその他の培地/緩衝液組成物で希釈できます。培地成分の最終濃度は、標準試料とサンプルで異なるべきではありません。 - 各タンパク質標準溶液 10 μL を 96 ウェルマイクロプレートの 3 ウェル(3 ウェル)に添加します。タンパク質ポイントが 0(ゼロ)の場合は、標準溶液の調製に使用したバッファー/培地を 10 μL 添加し、サンプルを希釈します。
- 別のウェルセットに、同じ 96 ウェルマイクロプレートの 3 つのウェル(つまり、3 回に分けて)に希釈した各サンプル 10 μL を加えます。1つのアプローチは、異なる容量のサンプルを添加し、ウェルあたり最大10 μLの培地(例えば、0.5 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μLのサンプルと、9.5 μL、9 μL、8 μL、6 μL、2 μLの培地)で完成させることです。
- 250 μLのBradfordタンパク質アッセイ試薬をすべてのウェルに加えます。典型的なマイクロプレートのセットアップを 図 2 に示します。この例では、260 μL(ウェルあたりの最終容量)の水を含むブランクウェルのセットを、マイクロプレートリーダーのブランクとして含めました(ステップ4.5)。これは、吸光度データも収集する場合にのみ必要です。
注:アッセイを行うたびに、サンプルの同じマイクロプレートに検量線を調製してください。つまり、サンプル数に応じて別のプレートが必要な場合は、2枚目のプレートに別の検量線を用意します。 - 5〜15分以内に結果(セクション4)を記録します。
図2:Bradfordタンパク質アッセイの典型的なプレートレイアウト。 ブランクとは、マイクロプレートリーダーでブランクとして使用する260μLの水を含む3つのウェルを指します。STDとは、タンパク質の標準物質を指します。S1-S6 は 6 つの異なるサンプルです。SX_1-SX_4は、サンプルごとに 4 つの異なるサンプル希釈液です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
4. 結果の記録
- 明るい部屋で、マイクロプレートをベンチと平行に、均一な白い背景(紙シートなど)を片手で持ちます。プレートに水準器を配置して、正確な位置合わせを確保します。
- 一方、スマートフォンをベンチとマイクロプレートに平行に持ち(一部のカメラアプリケーションはデバイスの傾きを便利に示します)、マイクロプレート全体の写真を1枚または数枚撮影します(図3)。iOSデバイスでは、 グリッド オプションを有効にして、カメラ設定でカメラレベルインジケーターをオンにします。Android デバイスでは、 フレーミング ヒントを有効にして、カメラ設定でカメラ レベル インジケーターをオンにします。
- 特別な照明器具は必要ありませんが、影や反射に注意してください。例えば、スマートフォンでプレートや背景を陰影化したり、マイクロプレートで背景を陰影化したりしないでください。井戸領域の端の小さな反射は問題ではありません。カラーデータは、各ウェルの中央にある非常に小さな領域から抽出できます。
- 背景の均一性、影、反射について画像を簡単に確認します。また、井戸の角度を見てください。各井戸の中心は、直接見えるようにする必要があります(つまり、井戸の壁の後ろではありません)。
- マイクロプレートの吸光度測定値とピクチャーカラーデータの比較が必要な場合は、マイクロプレートリーダー21で590nmと450nmのマイクロプレートを読み取ります。
図3:ブラッドフォードタンパク質アッセイの結果をキャプチャ 。明るい部屋では、マイクロプレートを片手で均一な背景に対してベンチと平行に配置します。一方、スマートフォンはベンチとマイクロプレートに平行に保持されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
5.カラーデータの抽出-自動
- ImageJ と ReadPlate22 のダウンロード、ImageJ プラグインは https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (これは .txt ファイルです) から入手できます。
- ImageJ を開き、[プラグイン] > [インストール ] をクリックして、手順 6.1 でダウンロードしたファイルを選択します。
- [分析]>[測定値の設定]をクリックして測定パラメータを設定し、次のオプションをオンにします。標準偏差;最小および最大のグレー値。平均グレー値。モーダルグレー値。ウィンドウの下部で、[リダイレクト] を [なし] と [小数点以下の桁数 (0-9): 3] に設定します。
- [ファイル]>[開く]に移動し、手順4で撮影したマイクロプレートの写真を選択します。
- ReadPlate>プラグインに移動します。指示を読み、[OK] をクリックします。
- ウェルの数を 96 から選択します。
- プラグインによって自動的にロードされる 矩形選択 ツールを使用して、A1ウェルの中心から始まり、H12ウェルの中心で終わる長方形を作成します。次に、「 OK」をクリックします。
- 青チャンネルを選択し、「OK」をクリックします。
- [ OK]をクリックして、デフォルトのパラメータを確認します。
- ソフトウェアが各ウェル内の領域を描写しているかどうか、および選択した領域が異常な影や反射で領域を覆っていないかどうかを確認します。[ OK] をクリックします。
- 結果を保存し、緑チャンネルに対して手順5.8〜5.10を繰り返します。
- 青と緑の比率は、各色のモードを使用して計算します。
注意: 計算は、手動で行うことも、R、Microsoft Excel、GraphPad Prismなどのリーダー設定のソフトウェアを使用して行うこともできます。
6.カラーデータの抽出-手動
- 無料のオープンソースグラフィックエディタであるInkscapeをダウンロードしてください。
注意: カラーピッカーツール(通常はスポイトとして描かれています)を備えたソフトウェアを使用して、色を識別し、RGBデータを抽出できます。 - Inkscapeを開き、[ファイル]>[開く]に移動します。手順4で撮影したマイクロプレートの画像を選択します。
- 左上に矢印で表示されている オブジェクトの選択と変換(S) ツールを選択し、画像をクリックします。破線の境界線は、選択を示します。
- 左側にスポイトとして描かれている 画像から色を選択(D) ツールを選択します。
- ウェルの中央をクリックします。それに応じて、下部パネルの色(「塗りつぶし:」)が変わります。色をクリックすると、右側に [塗りつぶしとストローク ]タブがポップアップ表示されます。
- [ フラットカラー] ドロップダウンメニューを [RGB]に変更します。各ウェルの青と緑のチャンネルに表示された値を記録します。
- 記録された値を使用して、青と緑の比率を計算します。
注意: 計算は、手動で行うことも、R、Microsoft Excel、GraphPad Prismなどのリーダー設定のソフトウェアを使用して行うこともできます。
7. 検量線の作成と未知数の外挿
- 緑と青の平均強度比をタンパク質標準濃度の関数としてプロットします。
注: データは手動で印刷するか、R、Microsoft Excel、GraphPad Prism などのリーダー設定のソフトウェアを使用してプロットします。 - 各サンプルと希釈液の平均緑と青の強度比を計算します。
- サンプルで得られたシグナルがタンパク質標準試料の線形範囲内にあるかどうかを確認します。
- 検量線の最小値または最大値を下回る値または上回る値は無視します。
- 検量線を表す線形方程式を使用して、サンプル中のタンパク質の量を推定します。それに応じて、計算値に希釈係数を掛けます。
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Representative Results
図4は、カラーデータを抽出したマイクロプレートの写真で、450nmと590nmの吸光度を記録しました。ここで代表として報告されたRGBカラーデータは、セクション5で説明したように自動的に取得されました。カラーデータの典型的なパターンは、青の値が増加し、赤と緑の値が減少することです(図5)。すべてのウェルで明らかな反射があり、マイクロプレートが完全に位置合わせされていないにもかかわらず(図 4)、画像から抽出されたカラーデータは吸光度の測定値を正確に反映しています(図 6)。また、サンプルの希釈率とシグナルの間には、吸光度の読み取り値とカラーデータの両方に直線的な関係があります(図7)。これらの代表的な結果について、20 前述のように調製した BV-2 細胞溶解物 (B001) およびガレリア メロネラ ホモジネート (G001) の 2 つのサンプルを使用し、そこから各ウェルに 0.5 μL、1 μL、2 μL、4 μL、および 8 μL を使用しました。容量をバッファーで 10 μL に調整してから、250 μL の Bradford 試薬を添加しました。
図4:Bradfordアッセイマイクロプレートの代表的な写真。 各ウェルのランプの反射とウェルの位置ずれ(つまり、プレートの右側が下に傾いている)に注意してください。これらは可能な限り最小限に抑える必要がありますが、完全な位置合わせと照明は必要ありません(代表的な結果を参照)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:タンパク質濃度の関数としての3つのRGBチャネルからの色の強度。 各点は、 図 4 に示すマイクロプレート内の検量線のウェルを表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:吸光度の読み取り値 と 画像から抽出されたRGBカラーデータ。 各点は、 図 4 に示すマイクロプレート内の検量線のウェルを表しています。黄色の網掛けは、95%信頼区間を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:シグナル強度 と サンプル量の関係。 カラムは、吸光度の読み取り値(吸光度)と抽出されたRGBカラーデータ(RGBデータ)など、さまざまな方法からのさまざまな信号です。列は、BV-2細胞ライセート(B001)と Galleria mellonella ホモジネート(G001)の異なるサンプルです。各ポイントは、特定のサンプル量の 3 つのウェルの平均値です。黄色の網掛けは、95%信頼区間を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
BSA 濃度 0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL の代表的な検量線(図 8)に示すように、検量線(シグナル対 BSA 濃度)は厳密に直線的です。
図8:ウシ血清アルブミン(BSA)濃度による青と緑の比率の直線性を示す典型的な検量線。 標準的な検量線に使用される濃度は、0 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL です。各点は、各BSA濃度の3つのウェルの平均値である。エラーバーは標準偏差を表します。黄色の網掛けは、95%信頼区間を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
この代表的な結果の例では、一部の希釈液が検量線の直線範囲内にありませんでした(図 9)。サンプル B001 では、8 μL のシグナルが検量線の最高点を超えました。G001 の場合、0.5 μL と 1 μL のシグナルは検量線の最低点を下回りました。どちらのサンプルでも、検量線の直線範囲外にある希釈液は廃棄する必要があります。検量線の範囲外の読み取り値を無視した後、吸光度の測定値を使用して計算されたタンパク質レベルは、両方のサンプルのRGBデータを使用して計算されたタンパク質レベルと変わりません(図10)。 t 検定を用いた吸光度データとRGBデータの比較では、サンプルB001でp = 0.63、サンプルG001でp = 0.17となった。
図9:RGBradford法を使用して得られた青と緑の比率とサンプル量。水平線は、検量線の青と緑の比率の最小値と最大値を区切ります(図8)。青色の円はBV-2細胞ライセート(B001)を表し、赤色の記号はGalleria mellonellaホモジネート(G001)を表します。エラーバーは標準偏差を表します。一部のサンプル希釈液は検量線の範囲外であることに注意してください。黄色の網掛けは、95%信頼区間を表します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図10:従来の吸光度測定値(ABS)とRGBradford法(RGB)を使用したBradfordタンパク質アッセイで定量された2つの生物学的サンプル中のタンパク質濃度。 青色の記号はBV-2細胞ライセート(B001)を表し、赤色の記号は Galleria mellonella ホモジネート(G001)を表します。各円は、データが得られた単一のウェルを表します。ひし形は平均を示し、縦線は各サンプル/メソッドの最小値から最大値までです。方法間に差はありません(B001、 t 検定、p = 0.63;G001、 t 検定、p = 0.17)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図1:異なるスマートフォンを使用して取得した信号。 異なるスマートフォンモデルで得られたシグナル(青と緑の比率)と、Spectramax iD3マイクロプレートリーダーからのシグナル(A590/A450)のピアソン相関係数。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この論文では、スマートフォンのカメラを使用してブラッドフォードタンパク質アッセイからのデータを記録し、カラーデータを抽出し、生物学的サンプル中のタンパク質レベルを正確に定量する方法であるRGBradfordについて説明します。元のRGBradfordメソッドとの違いの1つは、ここではImageJプラグイン22 でカラーデータを自動的に取得する手順が用いられていることである。RGBradford法の主な目新しさは、RGBデータを分析信号として使用することです。したがって、Coomassie Brilliant Blue Gによるタンパク質測定にラボで使用されているルーチンプロトコルを使用し、その写真を撮ってカラーデータを抽出することができます。言い換えれば、プロトコルのステップ1〜3は、特定の実験室で使用される通常の手順に従って変更できます。オリジナルのブラッドフォードタンパク質アッセイには複数の修飾が存在するため、サンプルの種類や性質に適したものを使用して、データ記録に進むことができます。
このプロトコルには、画像キャプチャとカラーデータ抽出という2つの重要なステップがあります。ここでも、前回20では、特別な照明装置は必要なく、満足のいく結果が得られました(すなわち、吸光度測定値からの結果と画像から抽出された色データとの間に差はありませんでした)。それにもかかわらず、例えば、トランスイルミネーター19、22を使用して、画像取得を最適化するためにプラットフォームを使用することを選択することができる。主な問題は、背景と照明を均一にすることです。さらに、異なるスマートフォンモデルで同等の結果を得ることができます。各デバイスで得られた信号にはわずかな違いがありますが、テストした4つのスマートフォンモデル(Samsung S22 Ultra、Apple iPhone 11、Apple iPhone 14 Pro、XIAOMI Redmi Note 9 Pro)の間には、強い相関関係(ピアソンのr > 0.99)と有意な相関関係(p < 0.0001)があります。また、それらで得られた信号とプレートリーダーからの信号の間にも有意な相関関係があります(補足図1)。カラーデータ抽出の場合、ReadPlateプラグインを使用する際、特にグリッドチェックのステップでは、グリッドが各ウェルの位置に合っているかどうかを検査する必要があるため、注意が必要です。グリッド円に井戸の壁や異常な領域(光が反射する領域など)が含まれていないことを確認する必要があります。図のプレートが背景に対して垂直に配置されていない場合、グリッドの位置合わせは特に困難になり、ウェルの中心から中央への長方形の選択(左上隅から右下隅まで)を適切に描画することが困難になります。
RGBradford法の利点は、従来の分光測定値と比較して、特殊なデバイス(マイクロプレートリーダーなど)の代わりにスマートフォンを使用する他の方法と同じです。スマートフォンは広く普及しており、分光光度計よりも安価で、バッテリーで何時間も機能し、データストレージ容量があり、他のデバイスとワイヤレスおよびリモートで通信します。これらにより、遠隔地や、ポイントオブケアユニット、教室、フィールド遠征、資源の少ないコミュニティなど、非標準的な実験室条件でブラッドフォードタンパク質アッセイを使用することができます。キャプチャされた画像は、後でさらに分析して解釈できます。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、ブラジルの国家科学技術開発評議会(CNPq)[助成金番号428048/2018-8および402556/2022-4]とブラジリア大学(ブラジル)から資金提供を受けました。著者は、この研究で使用したスマートフォンへのアクセスを提供してくれたDuarte Nuno Carvalho博士とEvelyn Santos博士(i3s、ポルトガル、ポルト)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
- Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
- Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
- Peterson, G. L.
- Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
- Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R.
- Elsevier, B. V. Scopus. , Available from: https://www.scopus.com/ (2022).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
- Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
- Gogstad, G. O., Krutnes, M. -B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
- Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
- Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
- de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
- Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
- Ernst, O., Zor, T.
- Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).
