$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Questo protocollo è un estratto da Tong et al, Elettrotassi basata su microfluidica per l'analisi quantitativa su richiesta della locomozione di Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2013).
1. Esperimento di elettrotassi
- Posizionare il microcanale sul tavolino (preferibilmente XY-mobile) di un microscopio con una telecamera montata collegata a un monitor (Figura 1).
- Collegare l'alimentatore o i cavi di uscita dell'amplificatore agli elettrodi del microcanale. Un semplice alimentatore CC è sufficiente se si desidera solo un segnale CC, ma un amplificatore collegato a un generatore di funzioni consente anche l'applicazione di segnali CC e CA pulsati.
- Collegare il tubo di uscita del microcanale a una siringa monouso. Immergere la bocca del tubo di ingresso nel tampone fisiologico M9 e aspirare delicatamente il liquido nel canale applicando una pressione negativa all'interno della siringa (manualmente o utilizzando una pompa a siringa). Quando i tubi di ingresso e di uscita sono entrambi riempiti con M9, scollegare la siringa dal tubo. Livellare entrambi i tubi alla stessa altezza per evitare il flusso idrostatico.
- Applicare una tensione CC al canale e assicurarsi che la resistenza (R= V/I) sia di circa 0,6 MΩ (per un microcanale lungo 50 mm, largo 0,3 mm e profondo ~0,1 mm).
- Se si è soddisfatti dell'integrità del canale, seguire i passaggi precedenti per caricare le viti senza fine da una sospensione diluita nel canale.
- Scollegare la siringa e manipolare idrostaticamente il flusso regolando l'altezza relativa dei tubi. Usa questo metodo per posizionare un verme al centro del canale e poi appoggiare entrambi i tubi alla stessa elevazione.
- Impostare l'alimentazione sulla tensione appropriata: 4-12 V/cm per gli animali da stadio L3, 4-10 V/cm per gli L4 e 2-4 V/cm per i giovani adulti. Attivare il segnale elettrico e attendere 1 minuto di pre-esposizione affinché il verme si acclimati al campo. Il verme dovrebbe iniziare a muoversi verso il catodo. Trascorso il minuto, utilizzare la fotocamera per iniziare la registrazione.
- Per gli esperimenti in corrente alternata e continua pulsata, il campo elettrico massimo reattivo può essere adottato dall'alto e la frequenza e il ciclo di lavoro del segnale possono essere modulati a piacere.
- Al termine dell'esperimento, rimuovere tutto il liquido (e le viti di scorrimento) dal canale, sciacquarlo con dH20 e lasciare asciugare il dispositivo su una piastra calda a 125 °C.
- Estrai manualmente i dati locomotori dai video registrati utilizzando NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o un software di tracciamento worm personalizzato basato su MATLAB.
