Summary
Это видео показывает эффективную технику для дифференциации и рассекает различные полупрозрачные структуры стекловидного тела человека после смерти в глаза.
Abstract
Стекловидного является оптически прозрачные, коллагеновых внеклеточного матрикса, которая заполняет внутри глаза и перекрывает сетчатки. 1,2 Аномальные взаимодействия между стекловидного подструктур и сетчатки лежат в основе нескольких витреоретинальной заболеваний, в том числе сетчатки слезу и отряд, макулярной морщиться, макулярного отверстия, Возрастная дегенерация желтого пятна, vitreomacular тяги, пролиферативная витреоретинопатия, пролиферативная диабетическая ретинопатия, и унаследовал vitreoretinopathies. 1,2 молекулярного состава стекловидного подструктур, не известно. Так как стекловидное тело прозрачное с ограниченными хирургического доступа, было трудно, чтобы изучить его подструктур на молекулярном уровне. Мы разработали метод для разделения и сохранения этих тканей для протеомных и биохимического анализа. Рассечение технику в это экспериментальное видео показывает, как изолировать стекловидного базы, передняя гиалоидная, стекловидное ядро, кору и стекловидного тела от посмертных человеческих глаз. Одномерный SDS-PAGE анализ каждого компонента стекловидного показал, что наша техника рассечение в результате четырех уникальных профилей белка, соответствующие каждой подструктуры человеческого организма стекловидное тело. Идентификация дифференциально разобщенным белков покажет кандидата молекул основного различных витреоретинальной заболеваний.
Protocol
1. Передняя Dissection сегмента.
- Роговицы удаляется первый принятия разрез лимба в переднюю камеру использованием 15 ° лезвия (рис. 1). Тогда один лезвие кривизны роговицы, склеры ножницы вставляется в переднюю камеру. Окружная разрезы делаются в роговице, только впереди лимба.
- 0,12 Colibri щипцы и ножницы Уэсткотт используются для сокращения диафрагмы окружности впереди цилиарного тела.
- Объектив ядра удаляется с 0,12 щипцы Колибри или 15 ° лезвия (сверхкоротких) и коре головного мозга и капсулу с пинцета.
2. Стекловидное Стремление Core.
- 23-иглы на 5-мл шприца вводится в середине стекловидного (рис. 1).
- Примерно в 1 мл или более стекловидное ядро мягко наддува.
- Затем образец помещают в микроцентрифужную трубки, а затем в жидком азоте.
3. Передняя Dissection гиалоидная.
- Передняя гиалоидная рассматривается как полупрозрачные кольца, регулируя падающего света от световой микроскоп шеи гуся. Предыдущая стремление стекловидное ядро отделяет передние гиалоидная от других структур для облегчения идентификации.
- Лист эластичной ткани, тщательно оторвался от цилиарного тела с Колибри или соус щипцы и вырезать ножницами Vannas. Этот маневр повторяется.
- Затем образец помещают в микроцентрифужную трубки, а затем в жидком азоте.
4. Стекловидное Dissection Base.
- Использование 0,12 щипцы для стабилизации наглазник, Уэсткотт ножницы используются для «цветок» глаза, сделав четыре равномерно расположенных снятия стресса порезы от цилиарного тела к головке зрительного нерва.
- Plicata Парс из цилиарного тела (рис. 2) удаляется от каждого из квадрантов использованием Уэсткотт ножницами.
- Стекловидного база, то понял по обе стороны от ора Серрата щипцами за Парс Плана и сетчатки (рис. 2).
- Непрерывная тяга на стекловидного базы применяется с щипцами. Последовательная резки с Уэсткотт ножницы экстракты полупрозрачной ткани с "нитка жемчуга" внешний вид, как это вырезали.
- Затем образец помещают в микроцентрифужную трубки, а затем в жидком азоте.
5. Стекловидное Удаление Cortex.
- Парс Плана иссекается от каждого из квадрантов с ножницами Уэсткотт, сокращая листовки около 3-мм кзади от ора Серрата (рис. 2).
- Между ткани листовки, стекловидное коры себе как полупрозрачные пленки.
- Эластичную пленку, либо захватили с 0,12 щипцов или находящиеся в приверженности Weck-Cel хирургической губки. Стекловидной коры, затем оторвался от сетчатки и вырезали ножницами с Уэсткотт (рис. 1).
- Образец помещается в микроцентрифуге трубки, а затем в жидком азоте. Все образцы хранятся при температуре -80 ° C до использовались для экспериментов.
6. Представитель Результаты
Образцы тканей могут быть обработаны различными методами для конкретных экспериментов. В нашем случае, образцы были переданы для анализа белков с помощью ДСН-ПААГ (рис. 3).
Рисунок 1. Кросс-разрез глаз человека изображающие различные подструктуры стекловидного тела. Самой передней стекловидного представляет собой тонкий слой коллагеновых называют передней гиалоидная. Стекловидное ядро включает в себя всю центральную область стекловидного тела. Эта часть стекловидного более водный, в отличие от стекловидного базы, которая является достаточно вязкой, чтобы быть охваченным щипцов и прочно прикрепляются к базовому цилиарного тела и сетчатки. Охватывая стекловидное ядро очень тонкие коллагеновые оболочки называется стекловидным коры головного мозга.
Рисунок 2. Стекловидное анатомии базы. Стекловидного база полупрозрачные подструктура стекловидного тела, расположенных вдоль ора Серрата (белые стрелки), который является разделительной линией разделения цилиарного тела и сетчатки. Переднему краю стекловидного базы распространяется на Парс-Плана (белая линия) цилиарного тела. Заднему краю стекловидного базы распространяется 2-3-мм кзади от ора Серрата (белый тире). Для акцизного стекловидного базы, щипцы используются для понимания ткани и потяните его от основной цилиарного тела и сетчатки. Как только повышается, Уэсткотт ножницы для резки вдоль основания.
Рисунок 3. Одномерный SDS-PAGE стекловидного Элементы органа. Общие концентрации белка для передних гиалоидная, стекловидное базы, витreous ядро, и стекловидного коры 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 мг / мл, соответственно. Гель-электрофорез проводили при 200 кВ в течение 45 минут, окрашивали Фламинго (Bio-Rad), а также визуализировать использованием VersaDoc Система визуализации (Bio-Rad). Профили для различных тканей показать несколько подобных групп, указывающие либо сохраняется или перекрестного загрязнения белков, а также уникальные полос (звездочка), что указывает на дифференциально локализованы белки.
Discussion
Стекловидное тело полупрозрачный гель которой молекулярный состав мало изучен, особенно на уровне ее подструктур: стеклообразное базу, ядро, кору, и передней гиалоидная. Стекловидное ядро содержит коллагены II, V, IX, XI и, наряду с хондроитин сульфат протеогликаны, протеогликанов гепаран сульфата и гиалуроновой кислотой. 1,2 белка биомаркеров в стекловидное ядро были связаны с такими заболеваниями, как диабетическая ретинопатия. 3-5 Как эти белки разному экспрессируются в каждой из подструктур, а во многих случаях конкретные идентичности белка, не известны. Эти данные могут дать представление о происхождении белков, связанных с конкретными заболеваниями витреоретинальной и помочь терапии целевой будущем. Хотя оптимальная после смерти интервал для ткани вскрытия не было определено, деградации белка может повлиять вниз по течению экспериментов. Например, иммуногистохимического оказывает влияние в 12-часовом глаза вскрытие и некоторых конкретных мероприятий фермента может быть уменьшен в течение нескольких часов (неопубликованные наблюдения). Все ткани в этом исследовании были собраны от 2 до 8 часов после смерти без существенного изменения в экспрессии белка или пригодности для протеомики analsyis. Жидкого азота методом замораживания сохранения выбирается по фиксации, чтобы предотвратить небольшие изменения в структуре белка вызванных фиксатором сшивки, которая была продемонстрирована в других тканях LC-MS/MS 6. Протеомных исследований будет зависеть от способности точно анализировать различные отделы стекловидного тела, как показано в этом видео эксперимента. Мы протестировали вскрытие технологии с использованием 1-мерных SDS-PAGE. Как наши результаты показывают, Есть разному экспрессируются белков в различных подструктур тела стекловидного тела. Выявление этих белков обеспечит более детального понимания стекловидного раздробленности.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Борьба за зрение. Ткани были получены из глаз банк Айова Львов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.12 forceps | Storz Ophthalmics | E1502 | |
| 5-cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Straight Dressing Forceps With Serrations | Storz Ophthalmics | E1400 | |
| 23 gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Castroviejo angled corneal scissors | Storz Ophthalmics | E3223 | |
| Vannas Curved Capsulotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3387 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Westcott Curved Tenotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3320 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J.
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
