Uova e rivestimenti extracellulare intorno uova di frequente rilascio peptidi, proteine e piccole molecole che comunicano con lo sperma per guidarli verso l'ovulo promuovendo in tal modo la fecondazione. Con sperma rana che descrivere e confrontare due classi di test utilizzato per rilevare chemiotassi degli spermatozoi - analisi di accumulo dello sperma e test di tracciamento degli spermatozoi.
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Articolo metodologico
Due tipi di saggi per chemiotassi Frog rilevamento sperma
In questo articolo
Sommario
Abstract
Chemiotassi degli spermatozoi negli invertebrati può essere sufficientemente robusto che si può mettere una pipetta contenente il peptide attraente in una sospensione di spermatozoi e microscopicamente visualizzare accumulo di sperma intorno alla pipetta 1. Chemiotassi degli spermatozoi nei vertebrati come rane, roditori ed esseri umani è più difficile da rilevare e richiede analisi quantitative. Tali dosaggi sono di due tipi principali - saggi che quantificare il movimento degli spermatozoi ad una fonte di chemoattractant, i cosiddetti saggi di accumulo degli spermatozoi, e saggi che in realtà traccia le traiettorie individuali di nuoto degli spermatozoi.
Saggi di accumulo degli spermatozoi sono decine permettendo relativamente rapido o centinaia di test da fare in un solo giorno, consentendo in tal modo le curve dose-risposta e corsi di tempo per essere eseguiti in modo relativamente rapido. Questi tipi di test sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare molti sistemi chemiotassi ben consolidato - per esempio, chemiotassi dei neutrofili al bacpeptidi materiali e chemiotassi degli spermatozoi al liquido follicolare. Test di tracciamento degli spermatozoi può essere più laborioso, ma offrono ulteriori dati su come chemoattractancts effettivamente alterare i percorsi di nuoto che lo sperma prendere. Questo tipo di test è necessario per dimostrare l'orientamento del movimento degli spermatozoi rispetto all'asse gradiente chemoattrractant e visualizzare trasforma caratteristica o cambiamenti di orientamento che portano lo sperma più vicino al uovo.
Qui si descrivono i metodi utilizzati per ciascuno di questi due tipi di test. Il saggio di accumulazione sperma utilizzato è chiamato un saggio "bicamerale". Spermatozoi anfibi sono inseriti in un inserto piastra di coltura dei tessuti con un pavimento filtro in policarbonato con pori di diametro 12 micron. Inserti con spermatozoi vengono inseriti in pozzi colture di tessuti piastra contenente tampone e un chemoatttractant attentamente pipettati nella parte inferiore e dove il pavimento incontra il muro (vedi fig. 1). Dopo l'incubazione, l'inserto superiore che contiene il serbatoio degli spermatozoi viene accuratamente removed, e lo sperma nella camera di fondo che sono passati attraverso la membrana vengono rimossi, pellettato e poi contati da emocitometro o citometria a flusso.
Il test di tracciamento degli spermatozoi utilizza una camera di Zigmond originariamente sviluppato per l'osservazione chemiotassi dei neutrofili e modificato per l'osservazione di spermatozoi da parte Giojalas e collaboratori 2,3. La camera è costituito da una lastra di vetro di spessore in cui due depressioni verticali sono state lavorate. Questi sono separati da una piattaforma di osservazione 1 mm di larghezza. Dopo l'applicazione di una copertura in vetro, gli spermatozoi vengono caricati in una mangiatoia, l'agente chemiotattico nell'altra e il movimento degli spermatozoi singoli visualizzati al microscopio video. Riprese video viene poi analizzata utilizzando software per identificare bidimensionale movimenti delle cellule nel piano xy in funzione del tempo (XYT set di dati) che formano la traiettoria di ogni sperma.
Protocollo
1. Materiali e tamponi usati
- Buffer Ringer ovocita di (1,5 x OR2) contiene 124 mM NaCl, 3.75 mM KCl, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 10 Hepes mM, pH 7.8. Buffer fecondazione (F-1) contiene 41,25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 0,06 mM MgCl 2, 0.5 mM Na 2 HPO 4, 2,5 Hepes mM, pH 7.8.
- Xenopus laevis acqua uovo è preparato secondo Sugiyama et al. 4. Brevemente descritto, appena deposto le uova uova di rana in gelatina sono roteato in un piccolo volume di F-1 buffer per 30 minuti e il mezzo condizionato....
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Discussione
Chemiotassi di cellule in movimento da entrambe movimento ameboide o flagelli alimentato il nuoto è presente in molti contesti biologici e lo studio di questo fenomeno richiede la disponibilità di test pratici e affidabili. Alcuni esempi del fenomeno, come l'attrazione degli spermatozoi per un uovo di riccio di mare o la raccolta di cellule stampo melma per formare un corpo fruttifero, hanno immediato impatto visivo. La quantificazione di questo fenomeno è stata intrapresa in diversi modi, come descritto da Eisenbac.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Bioimmagini WM Keck Laboratorio per l'uso della propria postazione di lavoro microscopia video. Questo studio è stato supportato da NSF concedere IBN-0615435.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome della voce | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| 24-pozzetti | Becton, Dickinson | 35/1147 | |
| 12 inserti mm di diametro esterno di 12 micron pori della membrana | Millipore | PIXP01250 | In precedenza avevamo usato Costar-Corning piastra transwell # 3403, ora sospeso |
| Zigmond camera | Neuroprobe | Z02 | |
| Olio di silicone | General Electric | SF1154 | Equivalente a Fluido Dow Corning 550 |
| Immagine J software | Wayne Rasband, servizi Settore di Ricerca, Istituto Nazionale di Salute Mentale | Download gratuito all'indirizzo http://rsbweb.nih.gov/ij | Programma Java che gira su Windows, LinUX e Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering / Imagescience / Biomedical Imaging Group , Erasmus MC - University Medical Center di Rotterdam | Scaricabile gratuitamente dal http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | Programma Java che gira su Windows, Linux e Mac |
| Virtual Dub software | GNU General Public licenza software | Download gratuito tramite http://www.virtualdub.org/index.html | Istruzioni di installazione sul sito Immagine J sotto plugins, solo per Windows |
| cellSens software | Olimpo | Vedere il sito: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp? prodotto = 1070 | Controlli e acquisisce immagini da una serie di telecamere. Ha anche capacità di elaborazione immagini |
Riferimenti
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C.
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Ristampe e permessi
