Summary
본 원고는 효모에 polyglutamine의 독성 (polyQ) - 확장 단백질을 평가 삼 보완적인 프로토콜을 설명합니다
Abstract
단백질 misfolding 같은 알츠하이머 질환, 파킨슨병과 헌팅턴의 질병과 한 많은 인간의 질병, 특히 neurodegenerative 질병과 연관됩니다. 헌팅턴의 질병 (HD)은 단백질 huntingtin 이내 polyglutamine (polyQ) 지역의 비정상적인 확대로 인해 발생합니다. polyQ - 확장된 huntingtin 단백질이 비정상적 형태 (즉, 그것이 misfolds)을 attains 및 세포 독성에게 2를 일으 킵니다. 적어도 8 이상 neurodegenerative 질병은 Spinocerebellar Ataxias과 케네디의 질병 3를 포함해 polyQ - 확장에 의해 발생합니다.
모델 생물 효모는 polyQ - 확장을 표현 polyQ - 독성의 내부와 남북 분자 요인의 영향, 그리고 세포에 손상되는 세포 경로의 식별을 포함하여 polyQ - 독성의 세포 및 분자 기초에 중대한 통찰력을 촉진하고있다 단백질 3-8. 중요단조는 효모에서 발견된 polyQ - 독성의 여러 측면 따라서 polyQ - 독성 underpinning 기본적인 메커니즘의 발견을위한 효모 모델의 중요성을 보여주는 다른 실험적인 시스템에서와 HD 환자에서 샘플에 어느 정도까지 재현했다.
효모에 polyQ - 독성을 결정하는 직접적이고 비교적 간단한 방법 polyQ - 확장 단백질을 표현 효모 세포의 성장 결함을 측정하는 것입니다. 본 원고는 polyQ - 확장 단백질을 표현 효모 세포의 성장을 측정하여 효모에 polyQ - 독성을 결정하는 세 보완 실험적인 접근 방법을 설명합니다. 처음 두 실험 방법은 접시에 효모의 성장을 모니터링, 세 번째 접근법은 BioscreenC 악기를 사용하여 액체 효모 문화의 성장을 모니터링합니다.
또한이 원고는 효모 polyQ 모델을 다룰 때 발생할 수있는 실험적인 어려움을 설명하고 또는 피하기 위해 도움이 될 전략을 보여줍니다이러한 어려움을 최소화합니다. 여기에 설명된 프로토콜 식별 및 유전 경로 및 polyQ - 독성을 조절 작은 분자를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 설명 assays는 효모 모델의 다른 질병 관련 misfolded 단백질에 의한 독성의 정확한 분석을위한 템플릿으로 사용될 수 있습니다.
Protocol
1. 효모의 독성 PolyQ - 확장 단백질의 표현
체계적인 분석은 효모 7 독성을 생산하는 데 필요한 polyQ - 확장 단백질의 정확한 아미노산 서열을 확립했습니다. 이 독성 polyQ - 확장 단백질 그림을 참조 huntingtin 단백질, polyQ 지역 및 카르복시 - 터미널 융합의 원래 순서에서 형광 단백질 (GFP 또는 CFP 중 17 아미노산 뒤에 아미노 터미널 깃발 태그가 있습니다 1). inducible와 상대 강한 GAL1 발기인 7, 9의 통제하에 표현하면 46 glutamines 이상의 polyQ 확장과 단백질의 표정은 (72과 103 glutamines를 예) 효모의 독성을 생산하고 있습니다.
이전에 설명한 바와 같이, 효모의 polyQ의 독성는 prion의 형태로 단백질 Rnq1p 가지고 세포에만 없었던 이유는, [RNQ +], 예를 들어 효모 변형 W303 9. 독성 polyQ - 확장 단백질 R이러한 polyQ 길이 종속적인 독성 (아래 참조)과 집계 (그림 1 B)와 같은 효모에 polyQ - 생물학 ecapitulates 중앙 측면. 특히, 독성 polyQ - 확장 단백질은 즉시 효모 세포를 죽이지 않는, 그들은 오히려 손상 또는 세포주기와 세포 devision을 체포하고 따라서 번호판 또는 액체의 문화 (우리의 게시되지 않은 데이터)에 효모 콜로니의 성장을 둔화 또는 억제.
2. 효모 세포가있는 잠재적인 문제는 독성 PolyQ - 확장 단백질을 표현
달리 독성 polyQ 확장 단백질을 표현 효모 세포는 성장 결함 9 표시되지 않을 수 있습니다. polyQ - 독성 이러한 진압의 유전적 성격은 단순 Mendelian 변이에 따라 결정될 나타나지 않습니다하기 때문에 상대적으로 높은 빈도 (우리의 미발표 결과)와 발생할 수 있습니다. 우리는이 자연 진압이 비슷하게를 [RNQ +] polyQ toxicity.Thes을 결정하는데 작동 미확인 prions의 경화에 의해 발생되는 추측polyQ의 독성의 전자 자발적인 진압 장치가 polyQ의 독성을 특성화하거나 식별하고 polyQ의 독성의 수정자를 특성화하는 것을 목표로하는 실험의 성공적인 결과를 위태롭게 만들 수 있습니다.
이러한 자발적인 진압의 빈번한 발생을 방지하기 위해, 매우 효과적일 수있다 아래에 설명된 예방 조치를 따르십시오
- 독성 실험에 신선한 효모 세포를 사용합니다. 장시간 동안 누룩을 보관하지 마십시오. 자주 냉동 주식 신선한 효모 식민지를 검색합니다.
- 자주 형광 현미경에 의한 표현과 독성 polyQ - 확장 단백질의 집합을 모니터링합니다.
- 어떠한 독성 측정을 시작하기 전에 항상 독성 polyQ의 독성 (단독 탄소 소스로 포도당을 포함하는 선택적 미디어 IE)의 표현을 주체할 매체 효모 세포 보관.
- 각 polyQ - 독성 실험을 위해 적어도 세 독립 transformants을 사용합니다. </ 리>
3. 성장 Assays
- 각 실험 조건의 경우 단독 탄소 소스로 포도당과 선택적 효모 미디어 3 ML의 독성 polyQ - 확장 단백질을 품고 효모 세포의 세 독립 transformants에서 각각 식민지의 예방.
- 30에서 하룻밤 이러한 문화를 품어 ° C. 매체에서 포도당 그들의 표현을 represses 때문에 이러한 조건에서 세포 polyQ - 확장 단백질을 표현하지 않습니다. 이러한 문화의 자라다 못하게 해, 1 아래의 하룻밤 문화 OD 600 (600 nm의 파장의 빛을 흡수도) 보관.
- 우리는 일상적으로 독성 polyQ - 확장 단백질을 표현 효모 세포의 성장 결함을 모니터링하는 세 가지 다른 assays를 사용
접시에 3.1 성장
- 나를 선택에 0.0005의 OD 600 (예 : OD600 = 0.5 문화 1:1000 희석)에 하룻밤 효모 문화를 (220 RPM의 진동과 함께 재배) 희석디아 7 함유 포도당.
- 균등 선택적 유일한 탄소 소스로 포도당을 포함하는 매체와 단독 탄소 소스로 갈락토 오스를 포함하는 선택적 매체 한 접시에 하나의 플레이트 (10cm 직경)에 각 희석 문화의 50 μl를 (CA 결과 판 당. 700 식민지) 확산.
- 30 ° C.에 3~4일에 대한 번호판을 품어 부화 후, 각각의 접시의 사진을 가지고 갈락토 오스 접시에 포도당과 식민지의 수에 콜로니의 수를 계산합니다. 높은 독성 polyQ - 확장 단백질 (103Q, 그림 2A) 표현 효모 세포를 사용할 때 이상적인 조건에서, 갈락토 오스 접시에 아무런이나에만 거의 식민지가 없습니다.
3.2 구경 assays
이 검정은 도금 분석은 위에서 설명한보다 양적이고 따라서 같은 접시 같은 실험과 polyQ 독성이 훨씬 미묘한 차이를 보여줄 수 있습니다.
- overn를 희석항공 문화 0.1의 OD 600 ~ 포도당과 매체에 재배.
- 피펫 200 멸균 96 - 웰 플레이트에 이러한 희석 문화 μl와 멀티 채널 피펫을 사용하여 멸균 물 다섯개의 요소가있는 시리얼 dilutions를 준비합니다.
- frogger을 (또한 세포 현탁액의 전달 8 X 6 핀으로 망보고라고도 함)에 사용하는 것은 전적으로 탄소 소스와 단독 탄소 소스로 갈락토 오스와 선택적 미디어를 포함하는 접시와 같은 포도당과 선택적 매체가 들어있는 접시에 세포 현탁액을 전송.
- 접시 30에서 그들을 잠복기 ° C를 3~4일 동안 전에 건조하도록 허용합니다.
- 부화 후, 각각의 접시의 사진 (그림 2B)을 가져가라.
3.3. 액체 배양의 성장에 의해 효모의 polyQ의 독성 모니터링
이 프로토콜은 여기에서 설명한 세 assays의 (OD600 숫자)가 가장 높은 양적이며 심지어 polyQ의 독성에 매우 미묘한 차이를 감지할 수 있습니다. 상기 OC자발적인 진압의 currence 그러나 잠재적으로 오해의 소지가있는 결과를 얻을 수 있습니다. 나는 그러므로 위에서 설명한 두 가지 도금 assays 중 하나 이상으로이 분석을 결합하는 것이 좋습니다. 우리는이 실험을 위해 BioscreenC 악기를 사용하도록 제안합니다. BioscreenC은 정의된 교반과 정의 온도에서 incubated 동안 자동으로 100도 접시에 효모 문화의 광학 밀도를 측정하는 계기이다. 효모 세포의 성장과 그 광학 밀도를 측정하는 다른 방법도 적용될 수 있습니다.
- 3 ML 멸균 물에 단독 탄소 소스로 세 번 포도당을 포함하는 최소한의 미디어에서 효모 세포를 씻으십시오.
- 0.1의 OD 600 ~ 갈락토 오스와 매체 재배 야간 문화를 희석.
- 효모 배양 300 μl로 100 잘 BioscreenC 판의 각 우물을 채웁니다.
- 쉬운 Bioscreen 실험 프로그램을 엽니다. 당신이 (공백 중간만을 포함한 모니터링하고자하는 샘플의 수를 결정제어), 30 ° C로 온도를 설정할 3 일이 실험의 길이를 설정, 15 분 측정 간격을 설정, 600 nm의 필터 / 브라운 설정하고에서 각 측정 전에 15초에 흔들림 모드를 설정 중간 강도.
- BioscreenC 악기 및 부속 소프트웨어는 실험 도중 찍은 각 데이터 포인트의 Excel 스프레드 시트를 생성합니다.
- 각 샘플에 대해 엑셀과 함께 성장 곡선을 준비하고 다른 샘플 (그림 2C)의 성장을 비교합니다. BioscreenC 실험에 의해 생산되는 데이터의 분석에 대한 자세한 설명은 10시 이전까지 제공되었습니다.
4. 대표 결과
1 그림. 효모 polyQ 모델입니다. 짧은, 무독성 polyQ을 표현 효모 세포를 보여주는 독성 polyQ - 확장 단백질. B의) 도식 표현) 형광 현미경확장 단백질 (25Q, 왼쪽 패널)와 효모 세포는 긴 독성 polyQ - 확장 단백질 (103Q, 오른쪽 패널) 표현.
그림 2. polyQ - 확장 단백질을 표현 효모 세포의 성장 assays 대표 결과입니다. ) 도금 분석. 약 700 효모 세포는 30 ° C.에 사흘 동안 접시에 펴고 incubated되었습니다 위쪽 패널은 포도당 매체를 포함하는 접시를 보여주고, 독성 polyQ - 확장 단백질 (103Q)의 표현 즉 것은 유도하지 않습니다. 하단 패널은 갈락토 오스 매체를 포함하는 효모 플레이트를 보여줍니다, 독성 polyQ - 확장 단백질의 표현 즉 것은 유도하고 있습니다. 실험로 표시되어 있습니다, 아무 자발적인 억제가 발생했습니다 없습니다. 나) 분석을 구경하기. 효모 세포의 다섯 직렬 5 배는 dilutions도 무독성 polyQ 단백질 (25Q) 또는 독성 polyQ - 확장 protei를 숨겨주N (103Q)은 단백질 (왼쪽 패널) 또는 그들의 표현을 유도 갈락토 오스 접시에있는 표현을 주체할 수 포도당 플레이트에서 목격됐다. 접시 그러면 ° C. C) BioscreenC의 실험. 중 무독성 polyQ 단백질 (25Q) 또는 독성 polyQ - 확장 단백질 (103Q)를 표현하는 효모 세포의 문화의 성장에 의해 감시되었다 30에서 사흘 동안 incubated되었습니다 BioscreenC 악기. 실험 조건 및 BioscreenC 실험 분석은 메인 텍스트에 설명되어 있습니다.
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Discussion
본 원고는 독성 polyQ - 확장 단백질을 표현 효모 세포의 감소 성장을 바탕으로 모델 유기체 효모에 polyQ - 독성을 측정하는 세 보완적인 실험 방법을 설명합니다. 효모의 작업 polyQ - 확장 단백질 9,11,12의 misfolding과 독성을 포함한 단백질 misfolding의 기본 세포와 분자 메커니즘과 그 다음의 독성,로 심오한 통찰력을 제공하고있다. 여기에 제시된 프로토콜을 기반으로 실험은 이미 polyQ 독성 5-8,13,14을 underpinning 유전 강화하거나 진압 polyQ의 독성의, polyQ의 독성의 작은 분자 조절 및 세포 메커니즘을 식별하고 특성을 위해 기여했다.
제시된 프로토콜은 쉽게 이러한 서로 다른 성장 조건이나 중 polyQ 독성을 감소하거나 더욱 심하게하다 유전자 돌연변이와 같은 polyQ의 독성의 다른 수정자를 탐험하는 데 적용할 수 있습니다. 또한, 제시된 실험 프로토콜쉽게 효모의 다른 유독 misfolded 단백질의 독성을 테스트 조정할 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
Duennwald 연구소의 작품은 노화 연구 (멀리), 유전성 질병 재단 (HDF)와 윌리엄 우드 재단에 대한 미국 연방의 보조금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
References
- Soto, C., Estrada, L. D.
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T.
- Meriin, A. B. Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains. FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).
- Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).
- Duennwald, M. L., Lindquist, S. Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity. Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).
- Meriin, A. B. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells. J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).
- Gitler, A. D. Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Giorgini, F., Muchowski, P. J. Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast. Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).
- Ehrnhoefer, D. E. Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models. Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).
