Summary
Cistografía fotoacústica (PAC) tiene un gran potencial para mapear vejigas urinarias, una sensible órgano interno de radiación en los pacientes pediátricos, sin necesidad de utilizar ningún tipo de radiación ionizante o agente de contraste tóxico. Aquí se demuestra el uso de PAC para el mapeo de vejigas urinarias con una inyección de trazadores óptica-opacos en ratas
Abstract
Cistografía pediátrica convencional, que se basa en diagnósticos de rayos X utilizando un tinte radiopaco, sufre de la utilización de radiación ionizante perjudiciales. El riesgo de cáncer de vejiga en los niños debido a la exposición a la radiación es más importante que muchos otros tipos de cáncer. Aquí se demuestra la viabilidad de la formación de imagen fotoacústica (PA) no ionizante y no invasiva de vejigas urinarias, referidos como cistografía fotoacústica (PAC), utilizando el infrarrojo cercano (NIR) absorbentes ópticos (es decir, azul de metileno, nanoestructuras de oro plasmónica, o nanotubos de carbono de pared individuales ) como un trazador óptico-turbia. Hemos fotografiado con éxito una vejiga de rata llena de los agentes de absorción óptica utilizando un sistema de campo oscuro confocal PAC. Después de la inyección transuretral de los agentes de contraste, vejigas de las ratas fueron photoacoustically visualizado por lograr mejorar la señal PA significativo. La acumulación fue validado por imágenes de PA espectroscópico. Además, mediante el uso de sólo una energía láser de pulsode menos de 1 mJ / cm 2 (1/20 del límite de seguridad), nuestro sistema de imagen actual podría mapear el metileno-relleno de azul-rata-vejiga a la profundidad de 1 cm más allá en los tejidos biológicos in vivo. Tanto in vivo y ex vivo de imágenes de los resultados PA validar que los agentes de contraste se excretan naturalmente a través de la orina. Por lo tanto, no hay preocupación con respecto a la acumulación de agente tóxico a largo plazo, lo que facilitará la traducción clínica.
Introduction
De rayos X cistografía 1 es un proceso de formación de imágenes para identificar enfermedades relacionados con la vejiga, tales como cáncer de vejiga, reflujo vesicoureteral, obstrucción de uréteres, vejiga neurogénica, etc. 2-5 Típicamente, las orinas, se anulan y un agente radiopaco se inyecta a través de un catéter. A continuación, las imágenes de rayos X de fluoroscopia se adquieren para delinear vejigas urinarias. Sin embargo, la cuestión clave de seguridad es que la radiación ionizante perjudicial se utiliza en este procedimiento. El porcentaje de riesgo de cáncer acumulada a la edad de 75 años debido al diagnóstico de rayos X entre un 0,6 a un 1,8%. 6 Además, la amenaza cancerígena es significativo en pacientes pediátricos. Un estudio del Reino Unido mostró que entre 9 principales órganos internos, la dosis de radiación media anual de rayos X de diagnóstico fue más alta en las vejigas en las niñas menos de 4 segundos y más alta en niños varones de menos de 4. 7 Esto indica que el riesgo de cáncer de vejiga es más significativo en los pacientes pediátricos. Although radiólogos pediátricos tratan de reducir la tasa de exposición a la radiación tan bajo como sea razonablemente posible, la radiación ionizante no puede excluirse por completo. Por lo tanto, la limitación crea la necesidad de una radiación libre de modalidad de imagen completamente, sensible, costo-efectiva, y de alta resolución con agentes de contraste no radiactivos en cistografía.
Recientemente, la tomografía fotoacústica (PAT) se ha convertido en una modalidad de imagen biomédica principal porque PAT puede proporcionar contrastes de absorción óptica fuertes y una alta resolución espacial ultrasónica en los tejidos biológicos. 8 El principio de PAT es que las ondas ultrasónicas se inducen debido a la expansión termoelástica de un objetivo seguido por la absorción de la luz. Mediante la detección resuelta en el tiempo las ondas acústicas que viajan a través de un medio, de dos o imágenes tridimensionales fotoacústica (PA) se forman. Dado que el ultrasonido (EE.UU.) es mucho menos dispersa en los tejidos en comparación con la luz (por lo general dos o tres órdenes de magnitud), laprofundidad de formación de imágenes de PAT puede alcanzar hasta ~ 8 cm de tejidos, mientras que la resolución espacial se mantiene a 1/200, de la profundidad de formación de imágenes 9 Las ventajas clave de PAT para la aplicación cistográfica incluyen:. (1) PAT está completamente libre de ionizante la radiación. (2) sistemas de ClinicalUSimaging se pueden adaptar fácilmente para suministrar de doble modal PA y capacidades de imagen de Estados Unidos. Por lo tanto, el sistema de doble modal PA / EE.UU. formación de imágenes puede ser relativamente fáciles de transportar, rentable, y rápido, que son criterios clave para la traducción clínica rápida. Utilizando tanto endógenas como exógenas contrastes, PAT ha proporcionado imágenes de alta resolución morfológica, funcional y molecular de los tejidos para estudiar la fisiopatología tumoral, la hemodinámica del cerebro, los órganos internos, la oftalmología, la angiografía, y etc. 10-16
En este artículo, nos demuestran los protocolos experimentales de cistografía fotoacústica no ionizante (PAC) con el infrarrojo cercano (NIR) absorbentes ópticos (es decir, el azul de metileno, vayanano-cajas ld, o nanotubos de carbono de pared única) como trazadores óptica-turbias no tóxicos. Vejigas llenas de ratas con los agentes de contraste se photoacoustically y espectroscópica delineados en vivo. No hay agentes persistentes acumulados en las vejigas y los riñones de las ratas. Por lo tanto, la toxicidad a largo plazo que puede ser causada por la acumulación de agente puede ser excluido. Este resultado implica que el PAC con la combinación de los elementos de absorción óptica puede potencialmente ser una modalidad cistográfica verdaderamente inofensivos para los pacientes pediátricos. La configuración del sistema, la alineación del sistema y los procedimientos de imágenes in vivo vivo / ex vivo se describe en este artículo.
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Protocol
1. Modo de sistema cistografía fotoacústica Reflexión Profunda (PAC)
- Configuración del sistema 17, 18
- A Q-switched Nd: YAG (SLII-10; Continuum, 532 nm) bombea un láser de longitud de onda sintonizable (Surelite OPO PLUS; Continuum, rango de ajuste de longitud de onda: 680 a 2500 nm).
- La duración del pulso de cada disparo de láser es de ~ 5 nseg, y la tasa de repetición del láser es de 10 Hz.
- La longitud de onda depende del pico de absorción óptica del agente de contraste usado. Si el azul de metileno sirve como el agente de contraste, se utiliza una longitud de onda óptica de 667 nm, donde la absorción es máxima. Nanoestructuras de oro Plasmónicos pueden tener resonancia de plasmón superficial sintonizable localizada en la región espectral NIR, sobre la base de sus propiedades físicas y químicas. Además, el amplio espectro de absorción de los nanotubos de carbono de pared única puede proporcionar una amplia opción para la selección de longitud de onda.
- La luz que sale del láser sintonizable se entrega a una lente esférica cónica tediante prismas en ángulo recto (PS908, Thorlabs).
- Un patrón de haz de luz en forma de rosquilla se genera cuando la luz pasa a través de la lente cónica esférica. La casa hizo-lente cónica está hecho de una lente de BK7 y el ángulo del cono es de 152 °. El diámetro de la lente es de 2,5 cm.
- El haz de luz en forma de dona divergentes se redirige a través de un condensador óptico, hecho de una hoja de acrílico transparente. Los diámetros de las superficies superior e inferior son 6,1 y 4,8 cm, respectivamente. El espesor del condensador es de 2,5 cm. La forma del haz de luz en forma de anillo redirigido una forma de rosquilla con un centro oscuro en la superficie del tejido.
- Utilice un recipiente de agua pequeños para aumentar el acoplamiento acústico. El depósito de agua tiene una abertura inferior envuelto con una película delgada de polietileno transparente que es ópticamente y acústicamente transparente. Los animales pequeños se colocan bajo el recipiente de agua.
- Las ondas generadas PA son detectadas por un transductor de ultrasonido enfocado esférica (V308;Olympus NDT; 5 MHz frecuencia central), que está montado en el centro del condensador óptico. El diámetro de los elementos y la distancia focal del transductor son 1,9 y 2,5 cm, respectivamente. Así, el número f del transductor es de ~ 1,3.
- Los acuerdos transversales y axiales son 590 y 144 m, respectivamente.
- Las olas PA detectadas se amplifican por primera vez por un emisor / receptor (5072PR, Olympus NDT, ancho de banda 35 MHz y 59 dB de ganancia RF) de ultrasonidos de banda ancha, y luego adquirida por un osciloscopio (TDS5054; Tektronix).
- Obtener imágenes de resolución temporal de una dimensión (denominados como A-line), midiendo los tiempos de llegada de las ondas PA. Actualmente, se supone que la velocidad de las ondas PA a estar en 1480 m / seg sobre toda la adquisición de la imagen. Dos (llamado como B-scan) y PA imágenes tridimensionales pueden ser adquiridos por el movimiento mecánico de la fase de exploración de trama lineal (XY6060; Danaher Dover).
- El tiempo de formación de imágenes es de ~ 25 min una imagen PA de una sola longitud de onda volumétrica con una decampo de visión (FOV) de 2,5 x 2,4 x 1,5 cm 3 en los planos xyz. Hemos adquirido 125 muestras a lo largo de la dirección x con un tamaño de paso de 0,2 mm, 60 muestras a lo largo de la dirección y con un tamaño de paso de 0,4 mm. 500 puntos de datos con una velocidad de muestreo de 50 MHz se obtuvieron a lo largo de la dirección z. El barrido mecánico es controlado por un sistema de software NI LabVIEW casera.
- Los datos volumétrica está representado por proyección de máxima amplitud (PAM) utilizando un sistema de software de The MathWorks MATLAB.
- Sistema de alineación
- Después de la lente cónica esférica, asegúrese de que la distribución de la luz es una forma de anillo perfecto. Si no se genera correctamente el patrón de luz en forma de dona, las señales originadas PA de la superficie de la piel son dominantes. Por lo tanto, es difícil de lograr imágenes de tejido profundo.
- El foco de luz con forma lineal en el agua debe ser alineado coaxialmente con la zona central de ultrasonido. Si los que no están alineados coaxialmente, el sistema adolece de baja relación señal-relación de ruido.
- El irradiado energía del pulso láser sobre la superficie de la piel varía de ~ 1 - 2 mJ / cm 2 cuando la longitud de onda está sintonizado a partir de 680 a 1000 nm, respectivamente. Estas energías de impulso láser son mucho menores que el límite de seguridad American National Standards Institute, variando de 20 a 80 mJ / cm 2 sobre la región espectral, respectivamente.
2. In vivo y ex vivo de imágenes Procedimientos
- Preparación de los animales
- Usar ratas Sprague-Dawley hembra con un peso de 200 - 250 g en todos los experimentos de imagen PA.
- Para empezar, anestesiar la rata mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (85 mg / kg de peso corporal) y xilazina (15 mg / kg).
- Depilar los pelos en la zona abdominal.
- Coloque la rata encima de un soporte de los animales a medida.
- Escudo de un catéter de calibre 22 con lubricante para mejorar la inserción del catéter.
- Sostenga el catéter vertically sobre la abertura uretral. A continuación, insertar el extremo distal del catéter, horizontalmente, en la uretra hasta el cubo del catéter finalmente llega a la abertura.
- La orina en la vejiga, se anulará a través del catéter.
- En imágenes in vivo PAC
- Coloque la rata, que se encuentra en la parte superior del soporte de los animales, por debajo del recipiente de agua en el sistema de PAC.
- Aplique el gel de ultrasonido (Sonotech) entre la superficie de la piel animal y la membrana de plástico para mejorar el acoplamiento acústico.
- Anestesiar completamente la rata utilizando isoflurano vaporizado (1 L / min de oxígeno y 0,75% de isoflurano) durante la formación de imágenes in vivo experimentos en PA.
- Obtener una imagen PA de control antes de la inyección de agentes de contraste.
- Introducir una solución acuosa de azul de metileno (0,8 l / g de peso corporal con una concentración de 30 mM), nano-cajas de oro (1,2 l / g de peso corporal con una concentración de 2 nM), o nanotubos de carbono de pared única (0,8 l / g cuerpo peso conuna concentración de 0,3 mM) a la vejiga a través del catéter. Utilice una jeringa-ml-1 con un catéter de calibre 22.
- Adquirir una serie de imágenes PA.
- Ex vivo PAC imágenes
- Sacrificio en la rata después de la formación de imágenes in vivo PAC, mediante la inyección de una sobredosis de pentobarbital.
- Retire los dos órganos principales, vejigas y los riñones, para investigar biodistribución, y en una placa de vidrio.
- Coloque la placa de vidrio por debajo del recipiente de agua en el sistema de PAC.
- Aplique el gel de ultrasonido (Sonotech) entre los órganos extirpados y membrana plástica para mejorar el acoplamiento acústico.
- Adquirir imágenes PA.
- Imagen Photoacoustically los órganos extraídos de una rata sana como un control.
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Representative Results
La figura 1 muestra el vivo PAC no ionizante y no invasiva en el uso de azul de metileno ópticamente turbia (MB). La imagen PA de control se obtuvo a 667 nm, en el pico de absorción óptica para MB (Figura 1A). Aunque los vasos sanguíneos en el campo de visión son claramente visualizada, la vejiga es invisible debido a que es ópticamente transparente a esta longitud de onda. Como se muestra en la Figura 1B, la vejiga se revela claramente en la imagen adquirida PA en 0,2 horas después de la inyección de MB. Para confirmar la acumulación de MB en la vejiga, se utilizaron dos longitudes de onda ópticas (667 y 850 nm) para distinguir entre la vejiga llena de MB de las estructuras circundantes. Como se muestra en la Figura 1C, las amplitudes PA dentro de la vejiga no son visibles debido a que el coeficiente de absorción óptica de MB a 850 nm es casi 0. Por lo tanto, este resultado indica que la vejiga se llena con MB. Como resultado, se demuestra que la espectroscópicoImagen PA puede distinguir claramente diferentes choromophores endógenos y exógenos. Figuras 1D y 1E muestran las imágenes de la profundidad resueltos PA B-scan, escaneadas a lo largo de la línea de puntos en las figuras 1A y 1B, respectivamente. La superficie superior de la vejiga se encuentra en el punto focal del transductor de ultrasonidos tanto in vivo y ex vivo de imágenes. La posición de la vejiga a lo largo de la dirección de profundidad se identifica claramente, ~ 3,5 mm por debajo de la superficie de la piel. Además, las señales de PA dentro de la vejiga medida a 24 y 48 horas después de la inyección son casi idénticas a la señal obtenida en la pre-inyección. Este resultado implica que el agente de contraste inyectado se eliminó completamente del cuerpo, y ningún agente acumulado. Por lo tanto, no se espera toxicidad agente a largo plazo en nuestro enfoque. Por otra parte, la profundidad de la imagen PA después de la inyección (Figura 1B) se codifica utilizando un pseudo color en la Figura 2. Tque la posición de la vejiga es de ~ 3,5 mm por debajo de la superficie de la piel, que se correlaciona bien con la imagen B-scan-PA profundidad resuelto (Figura 1E). Las profundidades típicas de los límites superior e inferior de una vejiga pediátrica son ~ 1,4 y 4,3 cm, respectivamente, de la superficie abdominal. Mediante el uso de sólo una energía de pulso de láser de menos de 1 mJ / cm 2 (1/20 del límite de seguridad), nuestro sistema de imagen actual podría mapear el metileno-relleno de azul-rata-vejiga a la profundidad de 1 cm más allá en biológica tejidos in vivo. 17 Como hemos mencionado, la profundidad de imagen de PAT pueden alcanzar hasta ~ 8 cm en los tejidos con ayuda de azul de metileno. 9
Después de todo, en experimentos de imagen in vivo, que extirpamos dos órganos principales, la vejiga y el riñón para investigar biodistribución. Como control, una vejiga y los riñones fueron extirpados de una rata sana. Las señales de PA medidos dentro de las vejigas retirados y los riñones de dos grupos de ratas son casi idénticos, demonstrating que ningún agente acumula en los órganos.
Figura 1. In vivo PAC no ionizante y no invasiva utilizando azul de metileno ópticamente opaco (MB). (A) Imagen de PA de control de la zona abdominal de una rata adquirido en pre-inyección de MB con una longitud de onda óptica de 667 nm, que muestra sólo los vasos sanguíneos (BV ). Esta longitud de onda coincide con el pico de absorción óptica de MB. (B) Imagen de PA obtenidas en 0,2 horas después de la inyección transuretral de MB con una longitud de onda óptica de 667 nm, revelando tanto BV y la vejiga (BD) acumulada a MB. (C ) PA imagen obtenida a 850 nm después de la inyección de MB. El BD lleno de MB desaparece en la imagen PA debido a la absorción óptica de MB es mínima en esta longitud de onda.(D) y (E) Profundidad resuelta PA imágenes B-scan cortan a lo largo de las líneas de puntos en (A) y (B), respectivamente. Reproducido con permiso del árbitro 17. Derechos de autor 2011 Optical Society of America.
Figura 2. Imagen PA Profundidad con codificación de la figura 1B. El color representa la información de profundidad. BV, vasos sanguíneos, BD, vejiga, y MB, azul de metileno.
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Discussion
En conclusión, hemos demostrado la posibilidad de no ionizantes PAC usando absorbentes ópticos no tóxicos en un modelo de rata in vivo. Hemos captado con éxito una vejiga de rata llenado con absorbentes ópticos utilizando nuestro sistema PAC no ionizante y no invasiva. Dos problemas de seguridad críticos se han resuelto en nuestro enfoque: (1) el uso de radiación ionizante para aplicaciones cistográficas y (2) no acumulación de agentes de contraste en el cuerpo.
Nuestro interés clínico incluye el monitoreo de reflujo vesicoureteral (RVU) en pacientes pediátricos. Alrededor del 3% de los niños en los Estados Unidos se ven afectados por infecciones de las vías urinarias 19, y aproximadamente el 1,5% de los pacientes que sufren de reflujo vesicoureteral. En la práctica clínica actual, todos estos pacientes se someten directamente ionizante imagen fluoroscópica de rayos-X. La Asociación de Urología pediátrica RVU panel de directrices clínicas Americana recomienda minimizar el uso de radiación ionizante para la pat pediátricaients 20. Nuestro objetivo a largo plazo es controlar RVU con la combinación de agentes de contraste ópticas tóxicas utilizando PAC. Por lo tanto, si hay RVU en pacientes, se espera que el agente inyectado fluirá de vuelta desde la vejiga hasta el riñón. En comparación con la radiografía cistografía, PAC tiene una profundidad de penetración limitada. Por lo tanto, nuestro objetivo principal para la clínica PAC es para los pacientes pediátricos. Aunque la velocidad de formación de imágenes de nuestro sistema de PAC actual es relativamente lento debido a la exploración mecánica, un sistema de ultrasonido clínico en tiempo real se puede adaptar fácilmente para la APA. 21-27 En consecuencia, este enfoque ofrece potencialmente un medio portátiles y de bajo costo para acceder a vigilancia RVU, que es un beneficio adicional. Por lo tanto, estamos convencidos de que la viabilidad de la traducción clínica de nuestra aplicación es muy alta. Para estudios futuros, antes de que se pone a prueba en la práctica clínica, el seguimiento PA RVU mediante amortiguadores ópticos se investigó en un modelo porcino.
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Disclosures
Todos los experimentos con animales se ajustaban a la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo Institucional Cuidado de Animales y el empleo.
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del programa de estudios piloto de la Universidad de Buffalo Centro de Investigación Clínica y Traslacional y el Consorcio traslacional Buffalo, una beca de la Fundación Roswell Park Alliance, los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Buffalo, el Programa Creativo Consilience IT de MKE y NIPA (C1515-1121-0003) y la concesión de la NRF MEST (desde 2.012 hasta 0.009.249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Continuum | SLII-10 | pump laser |
| OPO laser | Continuum | Surelite OPO PLUS | tunable laser |
| Prisms | Thorlabs | PS908 | light deliver |
| Ultrasound transducer | Olympus NDT | V308 | 5 MHz |
| Ultraoundpulser/receiver | Olympus NDT | 5072PR | amplifier |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS5054 | data acquisition |
| Scanning stage | Danaher Dover | XY6060 | raster scanning |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | contrast agent |
| Rats | Harlan | Spague-Dawley | animal subject |
| Isoflourane vaporizer | Euthanex | EZ-155 | anesthesia |
| Ultrasound gel | Sonotech | Clear Image singles | acoustic coupling |
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