Photoacoustic cystografi

Summary

Photoacoustic cystografi (PAC) har en stor potential att kartlägga urin blåsor, en strålningskänslig inre organ hos pediatriska patienter, utan att använda någon joniserande strålning eller toxiska kontrastmedel. Här visar vi användning av PAC för kartläggning av urin blåsor med en injektion av optisk-opaka spårämnen i råttor

Abstract

Konventionell pediatrisk cystografi, som är baserad på diagnostisk röntgen med användning av en radio-opak färg, lider av användning av skadlig joniserande strålning. Risken för urinblåsan cancer hos barn på grund av exponering för strålning är större än många andra cancerformer. Här kan vi visa på möjligheterna att ICKE och icke-invasiv photoacoustic (PA) avbildning av urin blåsor, så kallade photoacoustic cystografi (PAC), med nära-infraröda (NIR) optiska absorbenter (dvs. metylenblått, plasmoniska guld nanostrukturer, eller enda muromgärdad kolnanorör ) som en optisk-grumlig spårämne. Vi har framgångsrikt avbildas en råtta blåsa fylld med de optiska absorberande medel med ett mörkt fält konfokala PAC-system. Efter transuretral injektion av kontrastmedel, var råttans blåsor photoacoustically visualiseras genom att uppnå betydande PA signalförstärkning. Ansamlingen validerades genom spektroskopiska PA avbildning. Vidare, genom användning av endast en laser pulsenergipå mindre än 1 mJ / cm ² (1/20 av säkerhetsgränsen), skulle vårt nuvarande bildsystem kartlägga metylenblåaktiva ifyllda råtta-blåsan på ett djup av mer än 1 cm i biologiska vävnader in vivo. Både in vivo och ex vivo PA bildbehandling resultat validera att kontrastmedlen naturligt utsöndrades via urinering. Således finns det ingen oro långsiktig toxiskt medel ackumulering, som kommer att underlätta klinisk översättning.

Introduction

Röntgen cystografi ¹ är en avbildning process att identifiera blåsan-relaterade sjukdomar, såsom cancer i urinblåsan, vesikouretär reflux, blockering av urinledare, neurogen blåsa, osv. ^2-5 Normalt är urin ogiltiga och en radio-opak medlet injiceras genom en katetern. Därefter fluoroskopiska röntgenbilder förvärvats för att avgränsa urin blåsor. Dock är den viktigaste säkerhetsfrågan som skadlig joniserande strålning används i denna procedur. Den procentuella andelen kumulativa cancerrisk för åldern 75 år på grund av diagnostiska röntgenbilder skiljer mellan 0,6 till 1,8%. ⁶ Dessutom är det cancerframkallande hotet signifikant hos pediatriska patienter. En brittisk studie visade att bland 9 stora inre organ, var den genomsnittliga årliga stråldosen från diagnostisk röntgen högst i blåsorna i flickebarn mindre än 4 och näst högst i manliga barn mindre än 4. ⁷ Detta indikerar att urinblåsan cancerrisk är viktigast hos pediatriska patienter. AltHough pediatriska radiologer sträva efter att reducera exponeringen så låg som möjligt, joniserande strålning kan inte helt uteslutas. Därför skapar begränsning ett behov av en helt strålningsfria, känslig, kostnadseffektiv, och högupplösta avbildningsmodalitet med icke-radioaktiva kontrastmedel i cystografi.

Nyligen har photoacoustic tomografi (PAT) blivit en ledande biomedicinsk avbildning modalitet eftersom PAT kan ge starka optisk absorption kontraster och en hög ultraljud rumslig upplösning i biologiska vävnader. ⁸ Principen om PAT är att ultraljudvågor induceras på grund av termoelastisk expansion av ett mål följt av ljus absorption. Genom att detektera tidsupplösta akustiska vågor färdas via ett medium, två-eller tredimensionella photoacoustic (PA) bilden skapas. Eftersom ultraljud (US) är betydligt mindre spridda i vävnader jämfört med ljus (vanligen två eller tre storleksordningar), denavbildning djup av PAT kan nå upp till ~ 8 cm i vävnader, medan den rumsliga upplösningen bibehålls till 1/200 av det bildgivande djup ⁹ De viktigaste fördelarna med PAT för cystographic ansökan innehålla:. (1) PAT är helt fri från joniserande strålning. (2) ClinicalUSimaging system kan enkelt anpassas för att leverera dual-modal PA och amerikanska bildfunktioner. Således kan den dubbla modal PA / US bildsystem vara relativt portabel, kostnadseffektiv och snabb, vilket är viktiga kriterier för snabb klinisk översättning. Använda både endogena och exogena kontraster, har PAT tillhandahålls högupplösta morfologiska, funktionella och molekylär avbildning av vävnader för att studera tumörens physiopathology, hemodynamiken hjärnan, inre organ, oftalmologi, angiografi, och etc. ^10-16

I den här artikeln visar vi de experimentella protokoll för ICKE photoacoustic cystografi (PAC) med nära-infraröda (NIR) optiska absorbenter (dvs. metylenblått, gåld nanocages, eller enda muromgärdad kolnanorör) som ogiftiga optisk-grumliga spårämnen. Rat blåsor fyllda med kontrastmedel photoacoustically och spektroskopiskt delineated in vivo. Inga medel ackumulerats ihärdigt i blåsor och njurar hos råttorna. Således kan långvarig toxicitet som kan orsakas av ombud ackumulering uteslutas. Detta resultat antyder att PAC med kombination av optiska absorbenter potentiellt kan vara ett verkligt ofarlig cystographic modalitet för pediatriska patienter. Systemkonfiguration,, systemjustering och in vivo / ex vivo imaging procedurer diskuteras i den här artikeln.

Protocol

Ett. Djup reflektion läge photoacoustic cystografi (PAC) System

1. Systemkonfiguration ^{17, 18}
   1. En Q-switchad Nd: YAG-laser (SLII-10, Continuum, 532 nm) pumpar en våglängd-avstämbara laser (Surelite OPO PLUS, Continuum, våglängdsavstämning intervall: 680 till 2500 nm).
   2. Pulslängden för varje laser skott är ~ 5 ns, och lasern repetitionsfrekvens är 10 Hz.
   3. Våglängden beror på den optiska absorptionstoppen av det använda kontrastmedlet. Om metylenblått fungerar som kontrastmedel, är en optisk våglängd av 667 nm användes, där toppen absorptionen är. Plasmoniska guld nanostrukturer kan ha avstämbara lokaliserad ytplasmonresonans vid NIR spektrala regionen, baserat på deras fysikaliska och kemiska egenskaper. Vidare kan det breda absorptionsspektrum av enstaka kolnanorör tillhandahålla ett brett alternativ för våglängdsselektering.
   4. Ljus som kommer ut ur inställningsbar laser levereras till en sfärisk konisk lins through rätvinkliga prismor (PS908, Thorlabs).
   5. En donut-formad ljusstråle mönster genereras efter ljuset passerar genom den sfäriska koniska linsen. Den hemgjorda konisk lins är tillverkad av en BK7 objektiv och konvinkeln är 152 °. Diametern hos linsen är 2,5 cm.
   6. Den divergerande munkformad ljusstrålen omdirigeras via en optisk kondensor, tillverkade av genomskinligt akrylark. Diametrarna hos de övre och nedre ytorna är 6,1 och 4,8 cm, respektive. Tjockleken av kondensorn är 2,5 cm. Den omdirigerade ringformade ljusstrålen bildar en donut-formad med en mörk centrum på vävnaden ytan.
   7. Använda en liten vattenbehållare för att öka akustisk koppling. Vattenbehållaren har en botten öppning lindade med en klar tunn polyetenfolie som är optiskt och akustiskt transparent. Små djur är placerade under vattenbehållaren.
   8. De genererade PA vågor detekteras genom en fokuserad sfäriskt ultraljud givare (V308;Olympus NDT, 5 MHz central frekvens), som är monterad i mitten av den optiska kondensorn. Elementet diameter och brännvidd av omvandlaren är 1,9 och 2,5 cm, respektive. Sålunda är f-talet hos omvandlaren ~ 1.3.
   9. De tvärgående och axiella upplösningar är 590 och 144 nm, respektive.
   10. De detekterade PA vågorna först förstärks av en bredbands ultraljud pulser / mottagare (5072PR, Olympus NDT, 35 MHz bandbredd och 59 dB RF Gain), och sedan förvärvades av ett oscilloskop (TDS5054, Tektronix).
   11. Skaffa endimensionella tidsupplösta bilder (kallas A-line) genom att mäta tiden för ankomsten av PA vågorna. För närvarande, är hastigheten på PA vågor antas vara på 1,480 m / sek över hela bilden förvärvet. Två (kallas B-skanningar) och tredimensionella PA bilder kan förvärvas genom att mekaniskt flytta linjärt steg raster scanning (XY6060, Danaher Dover).
   12. Den avbildning tid är ~ 25 min för en volymetrisk enda våglängd PA bild med ensynfält (FOV) på 2,5 x 2,4 x 1,5 cm ³ i XYZ-plan. Vi förvärvade 125 prover längs x-riktningen med en steglängd på 0,2 mm, 60 prover längs y-riktningen med en steglängd på 0,4 mm. 500 datapunkter med en 50-MHz samplingsfrekvens erhölls längs z-riktningen. Den mekaniska skanning styrs av en hemmagjord NI LabVIEW programvarusystem.
   13. Den volymetriska data som representeras av maximal amplitud projektion (MAP) med en MathWorks MATLAB programvarusystem.
2. System uppriktning
   1. Efter den sfäriska koniska linsen, se till att ljusbilden är en perfekt ringform. Om munkformad ljusbild inte är korrekt genereras, PA signaler härstammar från hudytan är dominerande. Således är det svårt att uppnå djup vävnad avbildning.
   2. Linjen-formade ljusfokus i vatten skall koaxiellt inriktad med ultraljud fokal zon. Om de inte är koaxiellt inriktade, lider systemet från låg signal-till-brusförhållande.
   3. Den bestrålade laserpuls energi på hudytan varieras från ~ 1 - 2 mJ / cm ² när våglängden är inställd från 680 till 1000 nm, respektive. Dessa laserpuls energier är mycket lägre än i American National Standards Institute säkerhetsgränsen, varierande från 20 till 80 mJ / cm ² under den spektrala regionen, respektive.

2. In vivo och ex vivo Imaging Förfaranden

1. Djurpreparering
   1. Använd kvinnliga Sprague-Dawley med en vikt på 200 - 250 g i alla PA imaging experiment.
   2. Till att börja med, söva råttan genom intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin (85 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (15 mg / kg).
   3. Vaxning av hår i buken.
   4. Placera råttan på toppen av en skräddarsydd djur hållaren.
   5. Coat en 22-gauge kateter med smörjmedel för att förbättra katetrar.
   6. Håll katetern Vertically över urinrörsöppningen. Därefter sätter den distala änden av katetern, horisontellt, in i urinröret tills navet av katetern slutligen når öppningen.
   7. Urin i blåsan kommer att ogiltigförklara via katetern.
2. In vivo PAC imaging
   1. Placera råtta, ligger på toppen av djuret hållaren, under vattenytan behållaren i PAC-systemet.
   2. Applicera ultraljud gel (Sonotech) mellan djur hudytan och plast membran för att förbättra akustisk koppling.
   3. Fullt söva råtta med förångad isofluran (1 L / min av syre och 0,75% isofluran) under in vivo-PA imaging experiment.
   4. Få en kontroll PA bild före injektion av kontrastmedel.
   5. Införa en vattenlösning av metylenblått (0,8 l / g kroppsvikt med en koncentration av 30 mM), guld nanocages (1,2 l / g kroppsvikt med en koncentration av 2 nM), eller enda muromgärdad kolnanorör (0,8 l / g kroppsvikt vikt meden koncentration av 0,3 ^ M) till urinblåsan via katetern. Använd en 1-ml-spruta med en 22-gauge kateter.
   6. Skaffa en serie av PA bilder.
3. Ex vivo-PAC imaging
   1. Offra råttan efter in vivo PAC imaging, genom att injicera en överdos av pentobarbital.
   2. Ta bort de två stora orglar, blåsor och njurar, att undersöka biodistribution, och på en glasplatta.
   3. Placera glasplattan under vattenbehållaren i PAC-systemet.
   4. Applicera ultraljud gel (Sonotech) mellan de utskurna organ och plast membran för att förbättra akustisk koppling.
   5. Acquire PA bilder.
   6. Photoacoustically image de organ som har avlägsnats från en frisk råtta som en kontroll.

Representative Results

Figur 1 visar in vivo ICKE och icke-invasiv PAC med användning av optiskt grumlig metylenblått (MB). Kontrollen PA bilden erhölls vid 667 nm, vid toppen optiska absorptionen för MB (Figur 1A). Även om blodkärlen i FOV är visualiseras tydligt, är blåsan osynlig eftersom det är optiskt transparent vid denna våglängd. Som visas i figur 1B, är blåsan tydligt visade i PA bilden förvärvats vid 0,2 h efter injektion av MB. För att bekräfta ackumulering av MB i urinblåsan, använde vi två optiska våglängder (667 och 850 nm) för att skilja mellan blåsan fylls med MB från de omgivande strukturerna. Såsom visas i Figur 1C, PA amplituderna inuti blåsan är inte visas eftersom den optiska absorptionskoefficienten för MB vid 850 nm är nästan 0. Sålunda visar detta resultat att blåsan är fylld med MB. Som ett resultat visar det sig att den spektroskopiskaPA bilden kan tydligt urskilja olika endogena och exogena choromophores. Figurerna 1D och 1E visar djup-upplösta PA B-scan bilder, skannade längs den streckade linjen i figurerna 1A och 1B, respektive. Den övre ytan hos blåsan var belägen vid ultraljudsomvandlaren brännpunkt både in vivo och ex vivo-avbildning. Placeringen av blåsan längs djupled är tydligt identifierat ~ 3,5 mm under hudytan. Dessutom PA signaler inom blåsan uppmätt vid 24 och 48 h efter injektionen är nästan identiska med den signal som erhålls vid pre-injektion. Detta resultat antyder att den injicerade kontrastmedlet fullständigt avlägsnades från kroppen, och inget medel ackumuleras. Därför är ingen långsiktig agent toxicitet förväntas i vår strategi. Vidare är djupet av efter injektion PA bild (Figur 1B) kodad med användning av en pseudo färg i figur 2. Than ställning av urinblåsan är ~ 3,5 mm under hudytan, som korrelerar väl med djup-resolved PA B-scan bild (figur 1E). De typiska djupen på de övre och nedre gränserna för en pediatrisk urinblåsan är ~ 1,4 och 4,3 cm, respektive från den abdominala ytan. Genom att använda bara en energi laser puls på mindre än 1 mJ / cm ² (1/20 av säkerhetsgränsen), skulle vårt nuvarande bildsystem kartlägga metylenblåaktiva ifyllda råtta-blåsan med djup bortom 1 cm i biologisk vävnader in vivo. ¹⁷ Som vi ovan nämnts kan avbildning djup av PAT nå upp till ca 8 cm i vävnader med hjälp av metylenblått. ^nio

När allt in vivo imaging experiment, skars vi två viktiga organ, urinblåsa och njure för att undersöka fördelningen i organismen. Som en kontroll odlades en urinblåsa och njure exciderades från en frisk råtta. PA-signalerna mäts inom de borttagna blåsor och njurar från två grupper av råttor är nästan identiska, demonstrating att inget medel ackumulerats i organen.

Figur 1. In vivo ICKE och icke-invasiv PAC använder optiskt ogenomskinlig metylenblått (MB). (A) Kontroll PA bild av en råtta buken förvärvat vid pre-injektion av MB med en optisk våglängd av 667 nm, som endast visar blodkärl (BV ). Denna våglängd matcher med optiska absorptionstoppen MB. (B) PA bilden som erhålls vid 0,2 timmar efter transuretral-injektion av MB med en optisk våglängd av 667 nm, avslöjar både BV och urinblåsan (BD) ackumulerat med MB. (C ) PA bilden som erhålls vid 850 nm efter injektion av MB. BD fylld med MB försvinner i PA bilden eftersom den optiska absorptionen av MB är minimal vid denna våglängd.(D) och (E) Djup-löst PA B-scan bilder klippa längs de streckade linjerna i (A) och (B), respektive. Omtryckt med tillåtelse från ref ^17. Copyright 2011 Optical Society of America.

Figur 2. Djup-kodade PA bilden i figur 1B. Färgen representerar djupinformation. BV, blodkärl, BD, urinblåsa, och MB, metylenblått.

Discussion

Sammanfattningsvis har vi visat möjligheten att ICKE PAC använda ogiftiga optiska absorbatorer i en råttmodell in vivo. Vi har framgångsrikt avbildas en råtta blåsa fylld med optiska absorbenter använder vår ICKE-och icke-invasiv PAC-system. Två kritiska säkerhetsfrågor har lösts i vår strategi: (1) användning av ICKE strålning för cystographic applikationer och (2) Ingen ackumulering av kontrastmedel i kroppen.

Vår kliniska intresse omfattar övervakning vesikoureteral reflux (VUR) hos barn. Cirka 3% av barnen i USA påverkas av urinvägsinfektioner ^19, och cirka 1,5% av de patienter lider av VUR. I nuvarande klinisk praxis, alla dessa patienter genomgår direkt joniserande röntgen genomlysning imaging. Den amerikanska Urologiska Association pediatrisk VUR kliniska riktlinjer Panelen rekommenderar starkt att minimera användningen av joniserande strålning till den pediatriska patients. ²⁰ Vårt långsiktiga mål är att övervaka VUR med kombination av ogiftiga optiska kontrastmedel med PAC. Således, om det finns VUR hos patienter, förväntar vi oss att den injicerade medlet rinner tillbaka från blåsan till njurarna. Jämfört med x-ray cystografi, har PAC en begränsad penetration djup. Således är vårt främsta mål för klinisk PAC för pediatriska patienter. Även om utskriftshastighet ur vårt nuvarande PAC systemet är relativt långsam på grund av mekanisk scanning, kan en realtid klinisk ultraljud systemet enkelt anpassas för PAC. ^21-27 Följaktligen ger denna lösning eventuellt ett portabelt och billigt sätt att få tillgång VUR övervakning, vilket är ytterligare en fördel. Därför tror vi att det är möjligt att kliniska översättningen av vår ansökan är mycket hög. För framtida studier, innan det testas i klinisk miljö, kommer PA VUR övervakning med hjälp av optiska absorbenter undersökas i en gris modell.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q-switched Nd:YAG laser	Continuum	SLII-10	pump laser
OPO laser	Continuum	Surelite OPO PLUS	tunable laser
Prisms	Thorlabs	PS908	light deliver
Ultrasound transducer	Olympus NDT	V308	5 MHz
Ultraoundpulser/receiver	Olympus NDT	5072PR	amplifier
Oscilloscope	Tektronix	TDS5054	data acquisition
Scanning stage	Danaher Dover	XY6060	raster scanning
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140-25G	contrast agent
Rats	Harlan	Spague-Dawley	animal subject
Isoflourane vaporizer	Euthanex	EZ-155	anesthesia
Ultrasound gel	Sonotech	Clear Image singles	acoustic coupling