Summary
我们提供了一个可重复的方法，诱导1型糖尿病（T1D）在小鼠胰岛抗原特异性的，初级的CD4 + T细胞过继转移在两个星期内。
Abstract
非肥胖糖尿病（NOD）小鼠自发地开发自身免疫性糖尿病12周龄后，是最广泛研究的动物模型，人类1型糖尿病（1型糖尿病）。照射的受体小鼠的细胞转移的研究已经建立了1型糖尿病的发病机制在这个模型中，T细胞的关键。我们描述一个简单的方法迅速诱发T1D继转移纯化，小学的CD4 + T细胞前糖尿病NOD小鼠胰岛特定的T细胞受体（TCR）BDC2.5到NOD.SCID受体小鼠的转基因。这种技术的主要优点是可以在同一天，不要求收件人照射型糖尿病的发病率很高，引起T细胞转移后2周内完成隔离和致糖尿病性T细胞过继转移。因此，研究可以继续以更快的速度比I型糖尿病的发病机理和治疗干预的方法依赖于异质性T细胞群或克隆来自糖尿病NOD小鼠。
Introduction
NOD小鼠自发地开发自身免疫性糖尿病，并已被广泛用作人I型糖尿病的动物模型1,2。 I型糖尿病NOD小鼠的发病机制中的浸润，其特征在于，开始在3-4周的年龄，胰腺胰岛的树突状细胞和巨噬细胞，T细胞和B细胞。这一阶段的非破坏性的周边胰岛炎导致一个缓慢的，逐渐产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏，从而导致明显的糖尿病，由4-6个月3岁。已转让4,5脾细胞，CD4 + 6,7或CD8 + 8,9糖尿病NOD小鼠T细胞介导糖尿病NOD小鼠免疫功能低下，表明胰岛反应性T细胞在1型糖尿病的发病机制中发挥了核心作用。根据不同的实验条件下，糖尿病受体小鼠发展缓慢，在几个星期内，在这些研究中。同样，来自不同的T细胞克隆，费时和昂贵的致糖尿病性T细胞的培养，已报告的几个星期后，转移到受体小鼠7,10介导糖尿病。随着转基因小鼠表达的TCR来自CD4或CD8限制的致糖尿病的T细胞克隆，一些实验室的可用性，其后已表明，从小鼠脾脏T细胞能够转移糖尿病收件人11-13。具体来说，NOD小鼠BDC2.5只转基因BDC2.5 TCR，这是具体 的嗜铬粒蛋白A，胰腺β细胞中的一种蛋白质14-16。 在体外激活或者未激活的全部或分馏公然糖尿病或糖尿病前期BDC2.5糖尿病小鼠转移到新生儿或免疫缺陷的NOD小鼠在不同的效率11,17-19脾细 胞的转移。
我们描述了一个简单的方法，利用纯化的转基因的CD4 + T细胞在高效率和consiste的受体小鼠诱导T1D从糖尿病前期BDC2.5小鼠NCY。从这些小鼠中分离大量的幼稚，胰岛抗原特异性CD4 + T细胞通过荧光激活细胞分类（FACS），CD4 + CD62L + T细胞表达的转基因TCRVβ4的链。纯化的转基因T细胞，然后转移无需激活到NOD.SCID的老鼠，缺乏功能性T细胞和B细胞和胰岛炎和糖尿病无20。受体小鼠进行监测尿糖浓度升高，表明I型糖尿病，迅速发展后两周内的T细胞转移。
相比之下致糖尿病异构特异性T细胞转移的其他方法，我们的协议，使用流式细胞仪排序CD4 + T细胞，几乎完全表达的致糖尿病BDC2.5的TCR。由于他们的同质性，只有少数转移T细胞（约1×10 6个细胞/鼠标）T1D发展迅速，需要2个星期内，在100％的发病率。我们的协议的另一个优势是，irradiation的受体小鼠是没有必要的，因为它是为一些其他的方法。这种方法的一个潜在的局限性，它并没有允许调查，CD4和CD8 + T细胞亚群，或特别是CD8 + T细胞在糖尿病的贡献。
所描述的协议将是有用的研究的T1D的快速发展，介导的幼稚的，单特异性CD4 + T细胞，以及治疗策略干预胰岛抗原特异性的Th细胞的归巢至靶器官。
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Protocol
1。从脾和淋巴结肿大BDC2.5小鼠的T细胞的分离
- 使用6周龄糖尿病前期致糖尿病的CD4 + T细胞的捐助者的的女BDC2.5小鼠。应该是无糖尿病老鼠尿葡萄糖测定（见下文）所确定的。
- 安乐死每个鼠标采用CO 2窒息，在无菌条件下取出脾脏，腋窝和肱淋巴结。要取出脾脏，用70％乙醇浸泡皮草，再切和缩回皮肤。脾将是可见的，为暗红色的器官上的左侧的鼠标。 1英寸腹膜切口用小剪刀，，轻轻抓住脾的中心有一对小镊子。小心地修剪的结缔组织和连接的脂肪尽可能地取出脾脏。
- 收集10毫升Dulbecco's改性的Eagle培养基（DMEM）中，在冰上的15毫升锥形管中的脾脏和淋巴结。
- 准备单细胞悬液通过使用日e结束了10ml无菌注射器的柱塞轻轻按压至70微米的细胞过滤器（脾每个过滤器和过滤器每4-6个淋巴结）同样的50毫升锥形管的淋巴器官。
在这个过程中，用1毫升的DMEM几次最大限度地回收细胞从过滤器冲洗每个过滤。
- 从50毫升锥形管中收集的细胞转移到15毫升锥形管，离心300〜400×g离心7分钟，在RT。
- 以裂解红血细胞，弃去上清液，再使细胞悬浮在5ml二氯化铵钾（ACK）缓冲液（pH7.2），和孵化的ACK的细胞悬浮液在室温下5分钟。
- 加入10毫升的DMEM到的ACK的细胞悬浮液，，如上离心管。一次10毫升的DMEM洗涤细胞沉淀。
2。荧光激活细胞分选致糖尿病的CD4 + T细胞从BDC2.5老鼠
- 重悬细胞在5毫升FACSŞ泰宁缓冲液，计数活细胞的数量（用相衬显微镜和血细胞计数器），用台盼蓝染料排斥。
- 用FACS缓冲液中，调整至5×10 7个细胞/ ml的细胞悬液体积。删除〜1×10 6细胞每染色控制（1 3单无污点，污点）。染色样品的非转基因活化的CD4 + T细胞（APC）与抗CD4，抗TCRVβ4（FITC）和抗CD62L（PE）的单克隆抗体（单克隆抗体）在15毫升管。使用的单克隆抗体由生产商建议的浓度在4℃下20-30分钟，在黑暗中进行细胞染色。
- 洗> 3X染色反应体积的样品和单染色流式细胞仪缓冲控制。在300-400×g离心管，除去上清液，在FACS缓冲液中重悬细胞（1-2×10 7细胞/毫升样品进行排序和单染色法控制为300微升），并在冰上保存，直到下一个步骤。
- 通过一个35微米的细胞，通过细胞样品滤网盖管，以去除细胞团块。排序样本的CD4 + TCRVβ4+ CD62L +细胞细胞分选仪与受过训练的操作员。收集3毫升的DMEM将细胞分成15毫升管中。允许2.5-3小时，包括设置，排序1.5×10 8个细胞（细胞的大致数量从3个供体小鼠）中获得某种率2×10共4个事件/秒。期待〜2.5×10 6转基因非激活的CD4 + T细胞的细胞分选后，每只小鼠。
- 录制结束时的排序排序细胞的绝对数量和离心7分钟300-400 X G。弃上清，重悬细胞（2×10 6细胞/ ml），在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（毫克2 + / Ca 2 +的免费）收养T细胞转移。
3。继转移致糖尿病的CD4 + T细胞从BDC2.5老鼠
- 用1毫升注射器和18-1½针头，轻轻重悬流式细胞仪纯化的CD4 +T细胞和加载的1毫升注射器。在准备注射，更换18-1½针头与27½针头。
- 直到他们表现出修饰行为暴露6-8周龄雌性NOD.SCID的收件人小鼠的加热灯。
- 在限制器抑制受体小鼠，并用70％（V / V）乙醇消毒注射部位擦拭他们的尾巴。
- 分为横向的尾静脉注射1-2×10 6流式细胞仪的排序条件（在500μl的PBS）细胞/小鼠。
不要迫使柱塞。如果针头适当地位于在静脉注射的地方几乎没有阻力。
4。监控受体小鼠高血糖和T1D
- 开始5天后的T细胞转移，NOD.SCID受体小鼠每天监测尿糖升高使用试剂条（拜耳Diastix），根据制造商的说明。与两个连续urin老鼠ê血糖读数> 250毫克/分升被认为是糖尿病患者。
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Representative Results
我们的研究结果表明隔离的转基因BDC2.5细胞表达CD62L，这是家二级淋巴器官，如胰腺淋巴结T细胞的关键。我们的研究结果进一步证明了强有力的能力，这个单特异性T细胞的人口转移迅速和有效地T1D到NOD.SCID受体小鼠。
图2中所示的分离的致糖尿病CD4 + T细胞源自BDC2.5老鼠的。每股供体小鼠细胞分选前获得约5×10 7细胞汇集脾和淋巴结肿大。流式细胞仪排序之后，〜2.5×10 6个天真的转基因的CD4 + T细胞（CD4 + T细胞受体Vβ4+ CD62L +）通过使用所指示的选通策略获得从每个BDC2.5的供体小鼠。
正如预期的那样，继转移少量的CD4 + TCRVβ4+ CD62L +细胞（约1×10 6个细胞/鼠标）从供体小鼠BDC2.5只诱导T1D在所有NOD.SCID的重不一样（100％的发病率）由第11天，尿糖水平升高（ 图3）所确定的。相比之下，转让异构CD3 + BDC2.5 T细胞所需的3-5倍以上的细胞诱导3周21在80％NOD.SCID收件人T1D。
这些数据表明，继转移小成NOD.SCID T1D更迅速和有效地诱导小鼠FACS纯化BDC2.5的转基因CD4 + CD62L + T细胞数。
图1。实验事件序列。脾和淋巴结肿大收集BDC2.5小鼠。朴素转基因CD4 + T细胞（CD4 + TCRVβ4+ CD62L +），流式细胞仪分离。 T细胞重新悬浮于PBS中，静脉注射，随后监测尿糖升高指示T1D NOD.SCID收件人。
图2。门战略排序CD4 + TCRVβ4+ CD62L +从用流式细胞仪BDC2.5只脾和淋巴结源性细胞的单细胞悬液汇集脾脏和淋巴结染色，荧光标记的抗CD4（APC），反TCRVβ4（FITC）和抗CD62L（PE）的单克隆抗体。点图的左侧显示的CD4 + TCRVβ4+细胞群体，是用来门CD62L +细胞，在正确的点图所示。盒装门细胞群细胞百分率。
图3。致糖尿病的CD4 + T细胞过继转移。流式细胞仪隔离的CD4 + T细胞受体Vβ4+ CD62L +细胞源自BDC2.5小鼠静脉内注射（1.3×10 6个细胞/小鼠）成NOD.SCID受体小鼠组（n = 5）。小鼠WERê型糖尿病监测，通过测量尿液中的葡萄糖浓度收件人。两个连续的读数> 250毫克/分升的小鼠被认为是糖尿病。
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Discussion
1型糖尿病可以诱发受体小鼠的整个糖尿病NOD小鼠或来自致糖尿病性T细胞克隆的TCR转基因小鼠的脾细胞或T细胞亚群的过继转移在不同的效率。我们在此报告可重复的方法，在两周内100％的发病率在受体小鼠诱发T1D通过流式细胞仪纯化CD62L + BDC2.5转基因的CD4 + T细胞的转移到NOD.SCID小鼠。
这里所描述的特定优势的BDC2.5 T细胞传输模型，包括诱导时间很短，相比T1D月自发糖尿病和糖尿病转移至数周致糖尿病的T细胞亚群或T细胞克隆。此外，由于他们的同质性，只有少数纯化BDC2.5转基因T细胞需要转移T1D具有高效率和一致性。在对比一些其他T细胞转移的方法， 在体外转BDC2.5 T细胞活化的TRA前nsfer在我们的协议是没有必要的。我们的单特异性T细胞的转移方法的另一个优点是，新的治疗策略，干预胰岛抗原特异性T细胞归巢的靶器官，可以更多的选择性比其他协议的调查转移糖尿病与异质性的T细胞群。
我们的方法是一个潜在的局限性，这是不适合来确定单特异性，致糖尿病的CD4 + T细胞CD4 +和CD8 + T细胞亚群的1型糖尿病的发病机制的贡献，因为用来传送糖尿病。
在FACS仪器的情况下，可能会BDC2.5转基因T细胞分离用柱纯化，使用PE标记的抗-TCRVβ4单克隆抗体和抗-PE磁珠其次是CD4 + CD62L +磁珠（Miltenyi公司）。
应当指出，FACS纯化，以及柱纯化的T细胞，将包含未成年人的CD4 + T细胞的第不表达TCR转由于不完全统计等位基因排除内源性TCR基因15。纯化的T细胞的部分可能还包括CD4 + CD25 + Treg细胞可以抑制I型糖尿病发展收件人。由于这两种T细胞种群已报告以增加随着年龄BDC2.5只，我们建议使用BDC2.5小鼠，年龄不超过6周22,23。 CD4 + CD25 +调节性T细胞的细胞也可以被排除从BDC2.5 T细胞，通过FACS分选或分离的CD4 + CD25 +磁珠（Miltenyi公司）在旧BDC2.5老鼠。
可选地，或除了尿糖测量T1D监测血糖水平，可以更精确地确定受体小鼠中，使用手持式血糖仪。
在此协议中的关键步骤包括年龄BDC2.5的捐助者和NOD.SCID的受体小鼠。使用年轻BDC2.5小鼠（6周），以确保它们是无糖尿病，带连接的频率内源性非转基因的T细胞和Treg细胞都低，如上文所指出。同样重要的是使用年轻（<12周），因为这株小鼠作为受体小鼠NOD.SCID发展胸腺瘤表现自己经过20周的24岁1型糖尿病的发展，并可能混淆过继性T细胞转移后很容易。
未来的应用，所述方法包括：调查的CD4 T细胞介导的I型糖尿病的发病机制和新颖的方法，选择性地进行干预疾病的诱导，在人类中是不可行的。
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Disclosures
所有小鼠饲养在宾夕法尼亚州立大学医学院无特定病原体（SPF）设施的指引根据宾夕法尼亚州立大学的机构动物护理和使用委员会。
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
我们感谢博士。罗伯特BONNEAU和尼尔·克里斯滕森有益的意见。
这项工作是由美国宾夕法尼亚州立大学医学院的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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