Noi forniamo un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 (T1D) nei topi entro due settimane dal trasferimento adottivo di isolotto antigene-specifiche, CD4 + cellule T primarie.
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Articolo metodologico
Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il diabetico (NOD) topo non obesi sviluppa spontaneamente il diabete autoimmune dopo 12 settimane di età ed è il modello animale più studiato di umani di tipo 1 diabete (T1D). Studi trasferimento di cellule in topi riceventi irradiati hanno stabilito che le cellule T sono fondamentali nella patogenesi T1D in questo modello. Descriviamo qui un metodo semplice per indurre rapidamente T1D dal trasferimento adottivo di purificato, CD4 + cellule T primarie di pre-diabetici topi NOD transgenici per il recettore delle cellule T isolotto-specifica (TCR) BDC2.5 in topi riceventi NOD.SCID. I principali vantaggi di questa tecnica sono che isolamento e trasferimento adottivo di cellule T diabetogene può essere completato entro il giorno stesso, non è richiesta irradiazione dei destinatari, e una elevata incidenza di T1D è suscitato entro 2 settimane dopo il trasferimento delle cellule T. Così, gli studi di patogenesi e di interventi terapeutici nel diabete di tipo 1 possono avvenire a un ritmo più veloce rispetto ai metodi che si basano su eterogenee popolazioni di cellule T o cloniderivato da topi NOD diabetici.
Introduzione
Topo NOD sviluppa diabete autoimmune spontaneo ed è stato ampiamente utilizzato come modello animale per 1,2 T1D umana. Patogenesi del diabete di tipo 1 nei topi NOD è caratterizzata da infiltrazione, con inizio alle 3-4 settimane di età, delle isole pancreatiche di Langerhans da parte delle cellule dendritiche e macrofagi, seguiti da cellule T e B. Questa fase di non distruttiva peri-insulitis porta ad una lenta, progressiva distruzione delle cellule che producono insulina β pancreatiche, con conseguente diabete manifesto da 4-6 mesi di età 3. Trasferimento di splenociti 4,5, CD4 + 8,9 + 6,7 o cellule CD8 T da t....
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Protocollo
1. Isolamento delle cellule T da Milza e linfonodi di topi BDC2.5
- Utilizzare 6 settimane di età pre-diabetici femminili BDC2.5 topi come donatori di cellule CD4 diabetogenici cellule T. I topi devono essere diabete libero come determinato dalla misurazione del glucosio nelle urine (vedere sotto).
- Euthanize ogni mouse utilizzando CO 2 asfissia e rimuovere i linfonodi milza, ascellare e brachiale in condizioni sterili. Per rimuovere la milza, bagnare il pelo con il 70% di etanolo, quindi tagliare e ritrarre la pelle. La milza sarà visibile come un organo rosso scuro sul lato sinistro del mouse. Effettuare una incisione di 1 pollice nel p....
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Risultati
I nostri risultati mostrano l'isolamento di transgenici BDC2.5 cellule che esprimono CD62L, che è fondamentale per le cellule T a casa per organi linfoidi secondari, come i linfonodi pancreatici. I nostri risultati dimostrano ulteriormente la potente capacità di questa popolazione di cellule T monospecifico per il trasferimento rapido ed efficiente T1D di topi riceventi NOD.SCID.
Isolamento di diabetogeni CD4 + cellule T dei BDC2.5 topi è mostrato in Figura 2. Circa 5 x .......
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Discussione
T1D può essere indotta in topi riceventi a varie efficienze di trasferimento adottivo di cellule della milza intere o sottoinsiemi di cellule T da topi NOD diabetici o topi transgenici per il TCR derivati da cloni di cellule T diabetogenici. Riportiamo qui un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 in topi riceventi entro due settimane al 100% di incidenza con il trasferimento di FACS-purificati CD62L + BDC2.5 CD4 transgenici cellule T nei topi NOD.SCID.
Vantaggi specifici de.......
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Dichiarazioni
Tutti i topi sono stati alloggiati presso la Penn State College of Medicine impianto privo di patogeni (SPF) specifico in conformità con le linee guida del Penn State Institutional Animal Care e uso Comitato.
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo Drs. Robert Bonneau e Neil Christensen per gli utili commenti.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Pennsylvania State University College of Medicine fondi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| I topi transgenici BDC 2.5 TCR NOD (NOD. Cg-Tg(Tcr&alfa; BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD. Topi SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml tubi conici | Falcon | 352095 | |
| 50 ml tubi conici | Falcon | 352070 | |
| Pinzette chirurgiche | |||
| Forbici | |||
| Forbici | |||
| 70 μ filtri per cellule m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μ | Biosciences | 352235 | |
| ammonio-cloruro-potassio (ACK) | 0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM | |||
| colorante 342003 FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, sterilizzato con filtro | |||
| Microscopio | |||
| Emocitometro | |||
| a blu | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend 1005616 | clone RM4-5 | |
| Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Selezionatore cellulare | BD Biosciences | es. BD FACSAria III | |
| Lampada | |||
| Mouse retrattino | |||
| 1 ml siringhe | Becton Dickinson | 309602 | |
| Aghi calibro 18-1½ (sterili) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27&fratc12; aghi calibro (sterili) | Becton Dickinson | 305109 |
Riferimenti
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011....
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Ristampe e permessi
