Summary
Vi giver en reproducerbar metode til at inducere type 1-diabetes (T1D) i mus inden for to uger ved adoptiv overføring af ø-antigen-specifikke, primære CD4 + T-celler.
Abstract
Den nonobese diabetiske (NOD) mus spontant udvikler autoimmune diabetes efter 12 ugers alderen og er den mest omfattende undersøgt dyremodel for human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studier i bestrålede recipientmus har fastslået, at T-celler er afgørende i T1D patogenese i denne model. Vi beskriver heri en simpel metode til hurtigt at inducere T1D ved adoptiv overføring af oprenset, primære CD4 + T-celler fra præ-diabetiske NOD-mus transgene for islet-specifikke T-cellereceptor (TCR) BDC2.5 i NOD.SCID recipientmus. De store fordele ved denne teknik er, at isolation og adoptiv overførsel af diabetogene T-celler kan være afsluttet inden for den samme dag, er bestråling af modtagerne ikke er påkrævet, og en høj forekomst af T1D er fremkaldt senest 2 uger efter T-celle overførsel. Således kan undersøgelser af patogenese og terapeutiske indgreb i T1D fortsætte i et hurtigere tempo end med metoder, der er afhængige af heterogene T-cellepopulationer eller klonerafledt fra diabetiske NOD-mus.
Introduction
NOD mus udvikler autoimmun diabetes spontant og har været udbredt anvendt som en dyremodel for human T1D 1,2. Patogenese T1D i NOD-mus er karakteriseret ved infiltration, der begynder ved 3-4 ugers alderen, af pancreas Langerhanske øer fra dendritiske celler og makrofager, efterfulgt af T-og B-celler. Denne fase af ikke-destruktiv peri-insulitis fører til en langsom, fremadskridende ødelæggelse af insulin-producerende bugspytkirtlen β-celler, hvilket resulterer i åbenlys diabetes med 4-6 måneders alderen 3. Overførsel af splenocytter 4,5, CD4 + 6,7 eller CD8 + 8,9 T-celler fra diabetiske NOD-mus har vist sig at mediere diabetes hos immunkompromitterede NOD-mus, hvilket indikerer, at ø-reaktive T-celler spiller en central rolle i T1D patogenese. Afhængigt af de eksperimentelle betingelser, diabetes udvikles i recipientmus langsomt, over flere uger i disse undersøgelser. Tilsvarende forskellige T-cellekloner, afledt ved tidskrævende og bekosteligdyrkning af diabetogene T-celler, er blevet rapporteret at mægle diabetes flere uger efter overførsel til recipientmus 7,10. Med tilgængeligheden af transgene mus, der udtrykker TCR afledt af CD4-eller CD8-begrænsede diabetogene T-cellekloner, flere laboratorier har efterfølgende vist, at milt-T-celler fra sådanne mus var i stand til at overføre diabetes til modtagere 11-13. Specifikt BDC2.5 NOD-mus er transgene for BDC2.5 TCR, som er specifik for chromogranin A, et protein i pankreatiske betaceller 14-16. Overførsel af in vitro-aktiverede eller un-aktiverede hele eller fraktioneret miltceller fra åbenlyst diabetiske eller prediabetic BDC2.5 mus overført diabetes til neonatale eller immundeficient NOD mus ved varierende effektivitetsgevinster 11,17-19.
Vi beskriver en enkel metode, der bruger rensede transgene CD4 + T-celler fra præ-diabetiske BDC2.5 mus til at fremkalde T1D i modtagerlandene mus ved høj effektivitet og, bestårNCY. Et stort antal af naive, islet antigen-specifikke CD4 + T-celler isoleres fra disse mus ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) for CD4 + CD62L + T-celler, der udtrykker det transgene TCR Vβ4 kæde. Oprensede transgene T-celler overføres derefter uden aktivering i NOD.SCID mus, som mangler funktionelle T-og B-celler og er insulitis-og diabetes-fri 20. De modtagende mus monitoreres for forhøjede koncentrationer af urin glucose angiver T1D, der udvikler sig hurtigt inden for to uger efter T-celle overdragelsen.
I modsætning til andre metoder, der overfører diabetogene T-celler med heterogene særegenheder vores protokol anvender FACS-sorteret CD4 + T-celler, som næsten udelukkende udtrykker diabetogene BDC2.5 TCR. På grund af deres homogenitet, kun små antal overførte T-celler (~ 1x10 6 celler / mus), der kræves for hurtig T1D udvikling inden 2 uger ved 100% forekomst. En anden fordel ved vores protokol er at irradiation af recipientmus er ikke nødvendigt, da det er for nogle andre metoder. En potentiel begrænsning ved denne metode er, at det ikke tillader undersøgelsen bidrag både CD4 og CD8 T-celle delmængder eller specifikt CD8 T-celler i diabetes.
Den beskrevne protokol vil være nyttigt til at studere hurtig T1D udvikling, medieret af naive monospecifikke CD4 + T-celler, såvel som terapeutiske strategier til at gribe ind i målsøgning af ø antigenspecifikke Th-celler til målorganet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Isolering af T-celler fra milt og lymfeknuder BDC2.5 Mus
- Bruge 6-uger gamle prædiabetiske kvindelige BDC2.5 mus som donorer af diabetogene CD4 + T-celler. Mus skal være diabetes-fri som bestemt ved urin glucose måling (se nedenfor).
- Aflive hver mus ved hjælp af CO 2 kvælning og fjerne milten, armhulen og brachialis lymfeknuder under sterile betingelser. For at fjerne milten, sættetid pelsen med 70% ethanol, og derefter klippe og trække huden. Milten vil være synlig som en mørk rød orgel på venstre side af musen. Foretag en 1-tomme snit i peritoneum ved hjælp af en lille saks og forsigtigt gribe milten i midten med et par små pincet. Omhyggeligt trimme bindevæv og vedlagte fedt så meget som muligt og fjerne milten.
- Indsamle milt og lymfeknuder i 10 ml Dulbecco's-modificerede Eagles medium (DMEM) i en 15 ml konisk rør på is.
- Forbered en enkelt celle suspension ved hjælp af the enden af en steril 10 ml sprøjtens stempel tryk forsigtigt de lymfoide organer gennem 70 um celle sier (en milt pr si og 4-6 lymfeknuder pr si) i den samme 50 ml konisk rør.
Under processen, skylles hver si med 1 ml DMEM flere gange for at maksimere genvinding af celler fra sien.
- Overføre de indsamlede celler fra 50 ml konisk rør i en 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 300-400 xg i 7 minutter ved stuetemperatur.
- At lysere røde blodlegemer, supernatanten, genopslæmmes cellerne i 5 ml ammoniumklorid-Kalium (ACK) puffer (pH 7,2), og inkuberes ACK-cellesuspension ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Der tilsættes 10 ml DMEM til ACK-cellesuspensionen og centrifugeres glasset som ovenfor. Vask cellepelleten gang i 10 ml DMEM.
2.. Fluorescensaktiveret cellesortering af diabetogene CD4 + T-celler fra BDC2.5 Mus
- Genopslæmmes celler i 5 ml FACS sopretholdelse puffer og tælle antallet af levedygtige celler (ved hjælp af et fasekontrast mikroskop og et hæmocytometer) efter trypanblåt farveeksklusion.
- Anvendelse af FACS-puffer, cellesuspensionen volumen justeres til 5 x 10 7 celler / ml. Fjern ~ 1 x 10 6 celler pr farvning kontrol (1 nogen plet, 3 enkelt pletter). Farv prøven til ikke-aktiverede transgene CD4 + T-celler med anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) og anti-CD62L (PE) monoklonale antistoffer (mAb) i et 15 ml rør. Udfør cellefarvning hjælp af mAb koncentrationer foreslået af fabrikanten for 20-30 min ved 4 ° C i mørke.
- Vask prøven og enkelt plet kontrol med FACS buffer ved> 3x farvningsreaktionen volumen. Centrifuger røret ved 300-400 xg, supernatanten fjernes, og re-suspendere cellerne i FACS buffer (1-2 x 10 7 celler / ml til sortering prøve og 300 gl for enlige pletten kontrol) og gemme på is indtil næste trin.
- Pass celleprøven gennem en 35 um cellesi kapselrøret at fjerne celleklumper. Sortere prøverne for CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celler på en celle sorteringsanlæg med en uddannet operatør. Indsamle de sorterede celler i 3 ml DMEM i en 15 ml rør. Tillad 2,5-3 hr, herunder opsætning, for at sortere 1,5 x 10 8 celler (det omtrentlige antal celler udtaget fra 3 donormus) ved en slags på 2 x 10 4 alt hændelser / sek. Forvente ~ 2,5 x 10 6 ikke-aktiverede transgene CD4 + T-celler pr mus efter cellesortering.
- Optag det absolutte antal af sorterede celler ved afslutningen af den slags og centrifuger dem i 7 min ved 300-400 x g. Supernatanten fjernes, og resuspendere cellerne (2 x 10 6 celler / ml) i steril phosphatbufret saltvand (PBS) (Mg2 + / Ca2 + fri) for adoptiv T-celle overdragelsen.
3.. Adoptiv overføring af diabetogene CD4 + T-celler fra BDC2.5 Mus
- Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 18-1 ½ kanyle, forsigtigt resuspendere FACS-rensede CD4 +T-celler og indlæse 1 ml sprøjte. Som forberedelse til injektion, udskifte 18-1 ½ gauge kanylen med en 27 ½ kanyle.
- Expose 6-8 uger gamle kvindelige NOD.SCID recipientmus til en varmelampe, indtil de udviser grooming adfærd.
- Begrænse recipientmus i en fastholdelsesanlæg og tørre deres hale med 70% (v / v) ethanol at desinficere injektionsstedet.
- Injicere 1-2 x 10 6 FACS sorterede celler / mus (i op til 500 pi PBS) i en af de laterale halevener.
Tving ikke stemplet. Hvis nålen er placeret korrekt i venen, vil injektionen ske næsten uden modstand.
4.. Overvågning recipientmus for Hyperglycemia og T1D
- Begyndende fem dage efter T-celle overdragelse, er NOD.SCID recipientmus overvåget dagligt for forhøjet urin glucose hjælp reagensstrimler (Bayer DIASTIX) ifølge producentens anvisninger. Mus med to på hinanden følgende urine glukosemålinger> 250 mg / dl betragtes diabetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores resultater viser isoleringen af transgene BDC2.5 celler, der udtrykker CD62L, som er kritisk for T-celler til hjem til sekundære lymfoide organer, såsom pancreas lymfeknuder. Vores resultater demonstrerer yderligere potente evne denne monospecifikke T-cellepopulation til at overføre hurtigt og effektivt T1D til NOD.SCID recipientmus.
Isolering af diabetogene CD4 + T-celler fra BDC2.5 mus er vist i figur 2.. Ca. 5 x 10 7 celler fra poolet milt og lymfeknuder blev opnået pr donor mus før cellesortering. Efter flowcytometrisk sortering, ~ 2,5 x 10 6 naive transgene CD4 + T-celler (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) blev opnået fra hver BDC2.5 donor mus ved hjælp af angivne gating strategi.
Som forventet adoptiv overførsel af små antal af CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celler (~ 1 x 10 6 celler / mus) fra BDC2.5 donormus induceret T1D i al NOD.SCID re modtagere (100% forekomst) efter dag 11, som bestemt ved forhøjede niveauer af urin glucose (figur 3). I sammenligning + BDC2.5 T-celler overførsel af heterogene CD3 kræves 3-5 fold flere celler til at inducere T1D i 80% NOD.SCID modtagere ved 3 uger 21.
Disse data viser, at adoptiv overførsel af små antal af FACS-oprensede BDC2.5 transgene CD4 + CD62L + T-celler i NOD.SCID mus induceret T1D hurtigere og mere effektivt.
Figur 1. Sekvens af eksperimentelle begivenheder. Milt og lymfeknuder blev opsamlet fra BDC2.5 mus. Naive transgene CD4 + T-celler (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) blev isoleret ved FACS. T-celler blev resuspenderet i PBS og injiceret intravenøst i NOD.SCID modtagere, som senere blev overvåget for forhøjet urin glucose indikerer T1D.
Figur 2. Gating strategi at sortere CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + milt og lymfeknude-afledte celler fra BDC2.5 mus ved FACS. En enkelt celle suspension af puljede milt og lymfeknuder var farves med fluorescens-mærkede anti-CD4 (APC), anti -TCR Vβ4 (FITC), og anti-CD62L (PE) mAb. Den dot plot til venstre viser de CD4 + TCR Vβ4 + cellepopulation, der blev brugt til gate de CD62L + celler, der vises i højre dot plot. Boxed celler repræsenterer procentdele gated cellepopulationer.
Figur 3. Adoptiv overføring af diabetogene CD4 + T-celler. FACS-isolerede CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +-celler fra BDC2.5 mus blev injiceret intravenøst (1,3 x 10 6 celler / mus) i NOD.SCID recipientmus (n = 5). Mus were overvåges for T1D ved at måle uringlukose i modtagerne. Mus med to på hinanden følgende aflæsninger af> 250 mg / dl blev betragtet diabetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T1D kan induceres i recipientmus ved varierende virkningsgrader ved adoptiv overføring af hele miltceller eller T-celle delmængder fra diabetiske NOD-mus eller mus transgene for TCR afledt fra diabetogene T-cellekloner. Vi rapporterer her en reproducerbar metode til at inducere T1D i recipientmus inden for to uger med 100% forekomst ved at overføre FACS-oprensede CD62L + BDC2.5 transgene CD4 + T-celler i NOD.SCID mus.
Specifikke fordele BDC2.5 T-celle transfer her beskrevne model omfatter meget korte induktion cirka T1D forhold til måneder for spontan diabetes og op til flere uger for diabetes overgang efter diabetogene T-celle delmængder eller T-celle-kloner. Desuden, på grund af deres ensartethed kun små antal af oprenset BDC2.5 transgene T-celler kræves for at overføre T1D med høj effektivitet og ensartethed. I modsætning til nogle andre T-celle overførselsmetoder, in vitro aktivering af transgene BDC2.5 T-celler før TRAnsfer er ikke nødvendig i vores protokol. En anden fordel ved vores monospecifikke T-celle overførselsmetode er, at hidtil ukendte terapeutiske strategier til at intervenere i den målsøgende af ø-antigen-specifik T-celle til målorganet kan undersøges mere selektivt end med andre protokoller, overførsel diabetes med heterogene T-cellepopulationer.
En potentiel begrænsning af vores metode er, at det ikke er egnet til at bestemme bidraget af både CD4 + og CD8 + T-celle delsæt i T1D patogenese fordi monospecifikke, diabetogene CD4 + T-celler anvendes til at overføre diabetes.
I mangel af en FACS instrument, kan BDC2.5 transgene T-celler isoleres ved kolonne-oprensning ved hjælp af PE-mærket anti-TCR Vβ4 mAb og anti-PE magnetiske perler efterfulgt af CD4 + CD62L + magnetiske perler (Miltenyi).
Det skal bemærkes, at FACS-oprensede, samt kolonne-rensede T-celler, vil omfatte en mindre population af CD4 + T-celler thved ikke udtrykker det transgene TCR grundet ufuldstændig allelisk udelukkelse af endogene TCR-gener 15.. Det oprensede T-celle fraktion kan også omfatte CD4 + CD25 + Treg celler, der kan undertrykke T1D udvikling i modtagerne. Da begge T-celle populationer er blevet rapporteret at stige i BDC2.5 mus med alderen, anbefaler vi at bruge BDC2.5 mus, der ikke er ældre end 6 uger 22,23. CD4 + CD25 + Treg celler kan alternativt udelukkes fra BDC2.5 T-celler ved FACS-sortering eller separation med CD4 + CD25 + magnetiske perler (Miltenyi) i ældre BDC2.5 mus.
Alternativt eller som supplement til T1D overvågning fra urin glukose målinger kan blodsukkerniveauet bestemmes mere præcist i recipientmus ved hjælp af en håndholdt glucometer.
Kritiske trin i denne protokol omfatter en alder af BDC2.5 donor og NOD.SCID recipientmus. Hjælp unge BDC2.5 mus (6 uger) vil sikre, at de er diabetes-fri, og at hyppigheden af både enendogene ikke-transgene T-celler og Treg celler er lav, som nævnt ovenfor. Det er også vigtigt at anvende små (<12 uger) NOD.SCID mus som recipientmus fordi denne stamme er tilbøjelige til at udvikle thymomas der manifesterer sig efter 20 ugers alderen 24 og kan forvirre T1D udvikling efter adoptiv T-celle overdragelsen.
Fremtidige anvendelser af den beskrevne fremgangsmåde omfatter undersøgelse CD4 T-celle-medierede mekanismer T1D patogenese og nye strategier for at gribe selektivt i sygdom induktion, som ikke er mulig i mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle mus blev opstaldet på Penn State College of Medicine SPF-(SPF) facilitet i overensstemmelse med retningslinjerne i Penn State Institutional Animal Care og brug Udvalg.
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Drs. Robert Bonneau og Neil Christensen for nyttige kommentarer.
Dette arbejde blev støttet af Pennsylvania State University College of Medicine midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
