Summary
Vi tillhandahåller en reproducerbar metod för att inducera typ 1 diabetes (T1D) hos möss inom två veckor genom adoptiv överföring av cellöar antigenspecifika, primära CD4 + T-celler.
Abstract
Den nonobese diabetiker (NOD) mus utvecklar spontant autoimmun diabetes efter 12 veckors ålder och är den mest omfattande djurmodell av human typ 1-diabetes (T1D). Cellöverföring studier i bestrålade mottagande möss har visat att T-celler är svängbara i T1D patogenes i denna modell. Vi beskriver häri en enkel metod för att snabbt inducera T1D genom adoptiv överföring av renat, primära CD4 + T-celler från pre-diabetiska NOD-möss transgena för ö-specifik T-cellreceptor (TCR) BDC2.5 in NOD.scid mottagande möss. De stora fördelarna med denna teknik är att isolering och adoptiv överföring av diabetogena T-celler kan slutföras inom samma dag, är bestrålning av mottagarna inte krävs, och en hög förekomst av T1D framkallas inom 2 veckor efter T-cell överföring. Således kan studier av patogenes och terapeutiska ingrepp i T1D fortsätta i en snabbare takt än med metoder som bygger på heterogena populationer T-cell eller klonerhärrör från diabetiska NOD-möss.
Introduction
NOD-musen utvecklar autoimmun diabetes spontant och har i stor utsträckning använts som en djurmodell för mänsklig T1D 1,2. Pathogenesis av T1D i NOD-möss kännetecknas av infiltration, med början vid 3-4 veckors ålder, av de pankreatiska Langerhanska öar från dendritiska celler och makrofager, följt av T-och B-celler. Denna fas av oförstörande peri-insulitis leder till en långsam, gradvis förstörelse av insulinproducerande celler i bukspottkörteln β, vilket resulterar i konstaterad diabetes efter 4-6 månaders ålder 3. Överföring av splenocyter 4,5, CD4 + 6,7 eller CD8 + 8,9 T-celler från diabetiska NOD-möss har visats förmedla diabetes hos immunsupprimerade NOD-möss, vilket indikerar att ö-reaktiva T-celler spelar en central roll i T1D patogenes. Beroende på de experimentella betingelserna, utvecklade diabetes i mottagarmöss långsamt, under flera veckor i dessa studier. Likaså olika T-cell-kloner, som person med tidsödande och kostsamtodling av diabetogena T-celler, har rapporterats att medla diabetes flera veckor efter överföring till mottagaren möss 7,10. Med tillgången av transgena möss som uttrycker TCR härledda från CD4-eller CD8-begränsade diabetogena T-cellkloner, flera laboratorier har senare visat att mjälten T-celler från dessa möss kunde överföra diabetes till mottagare 11-13. Specifikt BDC2.5 NOD-möss är transgena för BDC2.5 TCR, som är specifik för kromogranin A, ett protein i pankreatiska beta 14-16. Överföring av in vitro-aktiverade eller icke-aktiverade hela eller fraktionerade mjältceller från öppet diabetiker eller prediabetic BDC2.5 möss överförda diabetes till neonatala eller immundefekta NOD-möss med varierande effektivitet 11,17-19.
Vi beskriver en enkel metod som utnyttjar renade transgena CD4 + T-celler från pre-diabetiska BDC2.5 möss för att inducera T1D i recipientmöss med hög effektivitet och consisteNCY. Stort antal av naiva, ö-antigen-specifika CD4 + T-celler isoleras från dessa möss genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för CD4 + CD62L + T-celler som uttrycker den transgena TCR Vβ4 kedjan. Renade transgena T-celler överförs sedan utan aktivering i NOD.scid möss, som saknar funktionella T-och B-celler och är insulitis-och diabetes-fria 20. De mottagande möss övervakas med avseende på förhöjda halter av urin glukos anger T1D, som utvecklar snabbt inom två veckor efter det att T-cell överföring.
I motsats till andra metoder som överföra diabetogena T-celler med heterogena specificiteter, använder våra protokoll FACS-sorterade CD4 + T-celler som nästan uteslutande uttrycker den diabetogena BDC2.5 TCR. På grund av sin homogenitet, är endast ett litet antal överförda T-celler (~ 1x10 6 celler / mus) som krävs för snabb T1D utveckling inom 2 veckor vid 100% incidens. En annan fördel med våra protokoll är att irradiation av mottagande möss är inte nödvändigt eftersom det är för några andra metoder. En potentiell begränsning med denna metod är att den inte tillåter utredningen bidrag både CD4 och CD8 T delmängder cell eller specifikt CD8 T-celler i diabetes.
Den beskrivna protokollet kommer att vara användbart för att studera snabba T1D utveckling, förmedlad av naiva, monospecifika CD4 + T-celler, samt terapeutiska strategier för att ingripa i målsökning av ö-antigen-specifika Th-celler till målorganet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Isolering av T-celler från mjälte och lymfknutor BDC2.5 Möss
- Använd 6-veckor gamla pre-diabetiska kvinnliga BDC2.5 möss som donatorer av diabetogena CD4 + T-celler. Möss bör vara diabetes-fri som bestäms genom uringlukos mätningen (se nedan).
- Euthanize varje mus med hjälp av CO 2 kvävning och avlägsna mjälte, armhålan och brachial lymfkörtlar under sterila betingelser. För att ta bort mjälten, blöta pälsen med 70% etanol, sedan klippa och dra huden. Mjälten syns som en mörk röd orgel på vänster sida av musen. Gör en 1-tums snitt i bukhinnan med hjälp av en liten sax och försiktigt tag mjälten i mitten med ett par små pincett. Trimma försiktigt bindväv och vidhängande fett så mycket som möjligt och ta bort mjälten.
- Samla mjältarna och lymfkörtlar i 10 ml Dulbecco's-modifierade Eagles medium (DMEM) i ett 15 ml koniskt rör på is.
- Förbered en enda cell suspension genom the änden av en steril 10 ml spruta kolven för att försiktigt trycka de lymfoida organen genom 70 silar ìm cell (en mjälte per sil och 4-6 lymfkörtlar per sil) till samma 50 ml koniska rör.
Under processen, skölj varje sil med 1 ml DMEM flera gånger för att maximera återvinningen av celler från silen.
- Överför de uppsamlade cellerna från 50 ml koniskt rör i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 300 till 400 xg under 7 min vid rumstemperatur.
- För att lysera röda blodkroppar, kassera supernatanten, återsuspendera cellerna i 5 ml Ammonium-Klorid-Kalium (ACK)-buffert (pH 7,2), och inkubera ACK-cellsuspensionen vid RT i 5 min.
- Tillsätt 10 ml DMEM till ACK-cellsuspensionen och centrifugera röret såsom ovan. Tvätta cellpelleten en gång i 10 ml DMEM.
2. Fluorescens-aktiverad cellsortering av diabetogen CD4 +-T-Celler från BDC2.5 Möss
- Återsuspendera cellerna i 5 ml FACS slande buffert och räkna antalet viabla celler (med användning av ett faskontrastmikroskop och en hemocytometer) genom uteslutning av trypanblått.
- Använda FACS-buffert, justera volymen cellsuspension till 5 x 10 7 celler / ml. Ta ~ 1 x 10 6 celler per färgning kontroll (1 någon fläck, 3 single fläckar). Stain provet för icke-aktiverade transgena CD4 + T-celler med anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) och anti-CD62L (PE) monoklonala antikroppar (mAb) i en 15 ml tub. Utför cellfärgning med Mab koncentrationer som föreslås av tillverkaren för 20-30 min vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta provet och enstaka fläckar kontroller med FACS buffert vid> 3X det färgningsreaktionen volymen. Centrifugera röret vid 300-400 xg, avlägsna supernatanten och slamma upp cellerna i FACS buffert (1-2 x 10 7 celler / ml för sortering prov och 300 ul för enstaka fläck kontroller) och lagra den på is tills nästa steg.
- Passera cellen provet genom en 35 ìm cellsil kapsylröret att avlägsna cellklumpar. Sortera prover för CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celler på en cell sorterare med en utbildad operatör. Samla de sorterade cellerna in i 3 ml DMEM i en 15 ml tub. Tillåt 2,5-3 tim, inklusive installation, för att sortera 1,5 x 10 8 celler (det ungefärliga antalet celler som erhållits från 3 donatormöss) vid en sorts hastighet av 2 x 10 4 totala händelser / sek. Räkna med ~ 2,5 x 10 6 icke-aktiverade transgena CD4 + T-celler per mus efter cell sortering.
- Anteckna absoluta antalet sorterade celler vid slutet av det slag och centrifugera dem för 7 min vid 300 till 400 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna (2 x 10 6 celler / ml) i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + free) för adoptiv T-cell överföring.
Tre. Adoptiv överföring av diabetogen CD4 + T-Celler från BDC2.5 Möss
- Använda en 1 ml spruta och en 18-1 ½ nål försiktigt återsuspendera FACS-renade CD4 +T-celler och ladda 1 ml sprutan. Som förberedelse för injektion, byt 18-1 ½ nål med en 27 ½ nål.
- Exponera 6-8 veckor gamla kvinnliga NOD.scid recipientmöss till en värmelampa tills de uppvisar grooming beteende.
- Tygla mottagande möss i fixeringsutrustning och torka deras svans med 70% (v / v) etanol för att desinficera injektionsstället.
- Injicera 1-2 x 10 6 FACS sorterade celler / mus (i upp till 500 | il PBS) in i endera av de laterala svansvenerna.
Tvinga inte på kolven. Om nålen ligger korrekt i venen, kommer injektionen ske med nästan inget motstånd.
4. Övervakning mottagande möss för Hyperglykemi och T1D
- Början fem dagar efter T-cell överföring, är NOD.scid recipientmöss övervakas dagligen för förhöjda urin glukos med reagensremsor (Bayer Diastix) enligt tillverkarens anvisningar. Möss med två på varandra följande urine glukosavläsningar> 250 mg / dl anses diabetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra resultat visar isolering av transgena BDC2.5 celler som uttrycker CD62L, vilket är kritiskt för T-celler till hem till sekundära lymfoida organ såsom nutor. Våra resultat visar vidare den potenta förmåga denna monospecifikt T-cell population att överföra snabbt och effektivt T1D till NOD.scid mottagaren möss.
Isolering av diabetogena CD4 + T-celler från BDC2.5 möss visas i figur 2. Cirka 5 x 10 7 celler från poolade mjälte och lymfkörtlar erhölls per donator mus innan cell sortering. Efter flödescytometrisk sortera, ~ 2,5 x 10 6 naiva transgena CD4 + T-celler (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) erhölls från varje BDC2.5 donator mus genom användning av den angivna gating strategi.
Som väntat adoptiv överföring av små antal CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celler (~ 1 x 10 6 celler / mus) från BDC2.5 donatormöss inducerad T1D i alla NOD.scid re mottagarna (100% incidens) vid dag 11, enligt bestämning av förhöjda nivåer av urin glukos (figur 3). I jämförelse, överföring av heterogena CD3 + BDC2.5 T-celler krävs 3-5 gånger fler celler för att inducera T1D i 80% NOD.scid mottagare av 3 veckor 21.
Dessa data visar att adoptiv överföring av ett litet antal FACS-renade BDC2.5 transgena CD4 + CD62L + T-celler till NOD.scid-möss inducerade T1D snabbare och mera effektivt.
Figur 1. Sekvens av experimentella evenemang. Mjälte och lymfkörtlar samlades från BDC2.5 möss. Naiva transgena CD4 + T-celler (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) isolerades genom FACS. T-celler återsuspenderades i PBS och injiceras intravenöst i NOD.scid mottagare, som sedan följdes av förhöjda urin glukos anger T1D.
Figur 2. Gating strategi att sortera CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + mjälte och lymfkörtel-härledda celler från BDC2.5 möss genom FACS. En encelliga fjädring av poolade mjälte och lymfkörtlar färgades med fluorescerande-märkta anti-CD4 (APC), anti -TCR Vβ4 (FITC) och anti-CD62L (PE) mAb. Den punktdiagram till vänster visar CD4 + TCR Vβ4 +-cell population som användes för att gate de CD62L + celler, som visas i den högra plotten. Boxed celler representerar procentsatser av gated cellpopulationer.
Figur 3. Adoptiv överföring av diabetogena CD4 + T-celler. FACS-isolerade CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celler från BDC2.5 möss injicerades intravenöst (1,3 x 10 6 celler / mus) i NOD.scid mottagande möss (n = 5). Möss were övervakas för T1D genom att mäta koncentrationer uringlukos i mottagarna. Möss med två på varandra följande värden på> 250 mg / dl ansågs diabetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T1D kan induceras i recipientmöss vid varierande effektiviteten genom adoptiv överföring av hela mjältceller eller T underuppsättningar cell från diabetiska NOD-möss eller möss transgena för TCRs härledda från diabetogena T-cellkloner. Vi redovisar här en reproducerbar metod för att inducera T1D i recipientmöss inom två veckor på 100% incidens genom överföring av FACS-renade CD62L + BDC2.5 transgena CD4 + T-celler i NOD.scid möss.
Specifika fördelar med BDC2.5 T cellöverföring modell som beskrivs här omfattar mycket kort induktionstid av T1D jämfört med månader för spontan diabetes och upp till flera veckor för diabetes överföring från diabetogena T-cell-underuppsättningar eller T-cellkloner. Dessutom, på grund av sin homogenitet, är endast ett litet antal renade BDC2.5 transgena T-celler krävs för att överföra T1D med hög effektivitet och enhetlighet. I motsats till vissa andra överföringsmetoder T-cell metoder, in vitro-aktivering av transgena BDC2.5 T-celler före transfer är inte nödvändig i våra protokoll. En annan fördel med vår monospecifikt T cellöverföring metod är att nya terapeutiska strategier för att ingripa i den målsökande av holmen antigen-specifika T-cell till målorganet kan undersökas mer selektivt än med andra protokoll som överför diabetes med heterogena T-cell populationer.
En potentiell begränsning av vår metod är att det inte lämpar sig för att bestämma bidraget av både CD4 + och CD8 + T delmängder mobiler i T1D patogenes eftersom monospecifika, diabetogena CD4 + T-celler används för att överföra diabetes.
I avsaknad av en FACS-instrument, får BDC2.5 transgena T-celler isoleras genom kolonn-rening med användning av PE-märkt anti-TCR Vβ4 mAb och anti-PE-magnetiska pärlor följt av CD4 + CD62L + magnetiska pärlor (Miltenyi).
Det bör noteras att FACS-renade, samt kolumn-renade T-celler, kommer att innehålla en mindre population av CD4 +-T-celler: evid uttrycker inte transgena TCR grund av ofullständig allelisk uteslutning av endogena TCR gener 15. Den renade T-cell fraktion kan också innefatta CD4 + CD25 + Treg celler som skulle kunna undertrycka T1D utveckling hos mottagaren. Eftersom både T-cell populationer har rapporterats öka i BDC2.5 möss med åldern, rekommenderar vi att du använder BDC2.5 möss som inte är äldre än 6 veckor 22,23. CD4 + CD25 + Treg-celler kan alternativt uteslutas från BDC2.5 T-celler genom FACS-sortering eller separation med CD4 + CD25 + magnetiska kulor (Miltenyi) i äldre BDC2.5 möss.
Alternativt, eller som tillägg till T1D övervakning genom mätningar uringlukos kan blodsockernivåer bestämmas mer noggrant i mottagarländerna möss med användning av en handhållen glukometer.
Kritiska steg i detta protokoll omfattar ålder BDC2.5 donator och NOD.scid möss mottagarländerna. Använda unga BDC2.5 möss (6 veckor) kommer att säkerställa att de är diabetes-fria och att frekvensen av både endogenous icke-transgena T-celler och Treg celler är låga, såsom påpekats ovan. Det är också viktigt att använda unga (<12 veckor) NOD.scid-möss som mottagare möss, eftersom denna stam är benägna att utveckla thymomas som visar sig efter 20 veckors ålder 24 och kan förväxla T1D utveckling efter adoptiv T-cell överföring.
Framtida tillämpningar av den beskrivna metoden innefatta undersökning av antal CD4 T-cell-medierade mekanismer för T1D patogenes och strategier nya att ingripa selektivt i sjukdomsinduktion, vilket inte är möjligt hos människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla möss inrymt på Penn State College of Medicine specifikt patogenfria (SPF) anläggning i enlighet med riktlinjerna i Penn State Institutional Animal Care och användning kommittén.
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Robert Bonneau och Neil Christensen för användare kommentarer.
Detta arbete stöddes av Pennsylvania State University College of Medicine fonder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
