Summary
Noi forniamo un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 (T1D) nei topi entro due settimane dal trasferimento adottivo di isolotto antigene-specifiche, CD4 + cellule T primarie.
Abstract
Il diabetico (NOD) topo non obesi sviluppa spontaneamente il diabete autoimmune dopo 12 settimane di età ed è il modello animale più studiato di umani di tipo 1 diabete (T1D). Studi trasferimento di cellule in topi riceventi irradiati hanno stabilito che le cellule T sono fondamentali nella patogenesi T1D in questo modello. Descriviamo qui un metodo semplice per indurre rapidamente T1D dal trasferimento adottivo di purificato, CD4 + cellule T primarie di pre-diabetici topi NOD transgenici per il recettore delle cellule T isolotto-specifica (TCR) BDC2.5 in topi riceventi NOD.SCID. I principali vantaggi di questa tecnica sono che isolamento e trasferimento adottivo di cellule T diabetogene può essere completato entro il giorno stesso, non è richiesta irradiazione dei destinatari, e una elevata incidenza di T1D è suscitato entro 2 settimane dopo il trasferimento delle cellule T. Così, gli studi di patogenesi e di interventi terapeutici nel diabete di tipo 1 possono avvenire a un ritmo più veloce rispetto ai metodi che si basano su eterogenee popolazioni di cellule T o cloniderivato da topi NOD diabetici.
Introduction
Topo NOD sviluppa diabete autoimmune spontaneo ed è stato ampiamente utilizzato come modello animale per 1,2 T1D umana. Patogenesi del diabete di tipo 1 nei topi NOD è caratterizzata da infiltrazione, con inizio alle 3-4 settimane di età, delle isole pancreatiche di Langerhans da parte delle cellule dendritiche e macrofagi, seguiti da cellule T e B. Questa fase di non distruttiva peri-insulitis porta ad una lenta, progressiva distruzione delle cellule che producono insulina β pancreatiche, con conseguente diabete manifesto da 4-6 mesi di età 3. Trasferimento di splenociti 4,5, CD4 + 8,9 + 6,7 o cellule CD8 T da topi NOD diabetici hanno dimostrato di mediare il diabete nei topi NOD immunocompromessi, il che indica che le cellule T isolotto-reattive giocano un ruolo centrale nella patogenesi T1D. A seconda delle condizioni sperimentali, diabete sviluppato in topi riceventi lentamente, nell'arco di diverse settimane in questi studi. Analogamente, vari cloni di cellule T, derivato dal tempo e costosocoltura di cellule T diabetogenici, sono stati segnalati per mediare diabete diverse settimane dopo il trasferimento in topi riceventi 7,10. Con la disponibilità di topi transgenici che esprimono TCR derivati da CD4-o cloni di cellule CD8-restricted diabetogenici T, diversi laboratori hanno successivamente dimostrato che le cellule T spleniche di questi topi sono stati in grado di trasferire il diabete ai destinatari 11-13. Specificamente, BDC2.5 topi NOD sono transgenici per la BDC2.5 TCR, che è specifico per cromogranina A, una proteina nelle cellule beta pancreatiche 14-16. Trasferimento di in vitro-attivato o cellule della milza interi o frazionati non-attivati dal apertamente diabetici o prediabetico BDC2.5 topi trasferiti diabete di topi NOD neonatali o immunodeficienti a varie efficienze 11,17-19.
Descriviamo un metodo semplice che utilizza CD4 transgenici purificate + cellule T dei pre-diabetici BDC2.5 topi per indurre diabete di tipo 1 in topi riceventi ad alta efficienza e ConsisteNCY. Un gran numero di ingenui, isolotto CD4 antigene-specifiche cellule T sono isolati da questi topi di selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) per CD4 + CD62L + cellule T che esprimono il TCR catena Vβ4 transgenico. Cellule purificate transgeniche T sono poi trasferiti senza attivazione in topi NOD.SCID, che mancano funzionale T e le cellule B e sono insulitis-e diabete-libero 20. I topi riceventi sono monitorati per elevate concentrazioni di glucosio nelle urine che indicano diabete di tipo 1, che si sviluppa rapidamente nel giro di due settimane dopo il trasferimento di cellule T.
A differenza di altri metodi che trasferire le cellule T diabetogene con specificità eterogenee, il nostro protocollo utilizza FACS-ordinati cellule T CD4 + che esprimono quasi esclusivamente il diabetogeno BDC2.5 TCR. A causa della loro omogeneità, solo un piccolo numero di cellule T trasferite (~ 1x10 6 cellule / topo) sono necessari per un rapido sviluppo T1D entro 2 settimane al 100% di incidenza. Un altro vantaggio di questo protocollo è che irradiation di topi riceventi non è necessaria come lo è per alcuni altri metodi. Un potenziale limite di questo metodo è che non consente l'indagine sul contributo di entrambi CD4 e CD8 sottoinsiemi di cellule T CD8 o specificamente cellule T nel diabete.
Il protocollo descritto sarà utile per lo studio di un rapido sviluppo diabete di tipo 1, mediata da ingenui, monospecifici CD4 + cellule T, così come le strategie terapeutiche per intervenire in homing di antigene-specifiche cellule Th isolotto per l'organo bersaglio.
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Protocol
1. Isolamento delle cellule T da Milza e linfonodi di topi BDC2.5
- Utilizzare 6 settimane di età pre-diabetici femminili BDC2.5 topi come donatori di cellule CD4 diabetogenici cellule T. I topi devono essere diabete libero come determinato dalla misurazione del glucosio nelle urine (vedere sotto).
- Euthanize ogni mouse utilizzando CO 2 asfissia e rimuovere i linfonodi milza, ascellare e brachiale in condizioni sterili. Per rimuovere la milza, bagnare il pelo con il 70% di etanolo, quindi tagliare e ritrarre la pelle. La milza sarà visibile come un organo rosso scuro sul lato sinistro del mouse. Effettuare una incisione di 1 pollice nel peritoneo usando le forbici piccole e prenda delicatamente la milza al centro con un paio di pinzette. Tagliare accuratamente il tessuto connettivo e grasso adiacente il più possibile e rimuovere la milza.
- Raccogliere le milze e linfonodi a 10 Media di ml Dulbecco's-Modified Eagle (DMEM) in un tubo da 15 ml su ghiaccio.
- Preparare una sospensione singola cella utilizzando the fine di una sterile 10 ml pistone della siringa, premere delicatamente gli organi linfoidi attraverso 70 filtri cellulari micron (uno milza per filtro e 4-6 linfonodi al colino) nella stessa ml tubo conico 50.
Durante il processo, sciacquare ciascun filtro con 1 ml di DMEM più volte per massimizzare il recupero delle cellule dal filtro.
- Trasferire le cellule raccolte dalla provetta conica da 50 ml in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300-400 xg per 7 minuti a temperatura ambiente.
- Per la lisi dei globuli rossi, scartare il surnatante, risospendere le cellule in 5 ml di ammonio-cloruro-potassio (ACK) tampone (pH 7,2) e incubare la sospensione ACK-cella a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere 10 ml di DMEM alla sospensione ACK-cellula e centrifugare la provetta come sopra. Lavare il pellet una volta in 10 ml DMEM.
2. Cella Ordinamento Fluorescence-activated di CD4 + T Cells diabetogenici da BDC2.5 Mice
- Risospendere le cellule in 5 ml FACS scontenenti tampone e contare il numero di cellule vitali (utilizzando un microscopio a contrasto di fase ed un emocitometro) by trypan blue.
- Utilizzando tampone FACS, regolare il volume di sospensione cellulare per 5 x 10 7 cellule / ml. Rimuovere ~ 1 x 10 6 cellule per il controllo colorazione (1 nessuna macchia, macchie 3 singoli). Colorare il campione per non attivati CD4 transgenici cellule T con anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) e anti-CD62L (PE), anticorpi monoclonali (mAb) in una provetta da 15 ml. Eseguire colorazione cella utilizzando le concentrazioni mAb suggerite dal costruttore per 20-30 min a 4 ° C al buio.
- Lavare il campione e singoli controlli macchia con tampone FACS a> 3 volte il volume di reazione di colorazione. Centrifugare la provetta a 300-400 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in FACS tampone (1-2 x 10 7 cellule / ml per l'ordinamento del campione e 300 microlitri per singoli controlli macchia) e conservare in ghiaccio fino al prossimo passo.
- Passare il campione cellulare attraverso una cella di 35 microncolino tubo tappo da rimuovere grumi di cellule. Ordinare i campioni di cellule CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celle su un cell sorter con un operatore esperto. Raccogliere le cellule filtrate in 3 ml di DMEM in una provetta da 15 ml. Lasciare 2.5-3 ore, la sua installazione, per ordinare 1,5 x 10 8 cellule (il numero approssimativo di cellule ottenute da topi 3 donatori) ad una velocità sorta di 2 x 10 4 totali eventi / sec. Aspettatevi ~ 2.5 x 10 6 non attivati CD4 transgenici cellule T per topo dopo la separazione delle cellule.
- Registrare il numero assoluto di cellule ordinati al termine del genere e li centrifugare per 7 minuti a 300-400 x g. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule (2 x 10 6 cellule / ml) in sterile tampone fosfato salino (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + libero) per il trasferimento di cellule T adottivo.
3. Trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici da BDC2.5 Mice
- Usando una siringa da 1 ml e un ago calibro 18-1 ½, delicatamente risospendere le cellule CD4 FACS-purificati +Cellule T e caricare la siringa da 1 ml. In preparazione per l'iniezione, sostituire il 18-1 ½ ago calibro 27 con un ago calibro ½.
- Esporre 6-8 settimane di età femminile NOD.SCID topi riceventi di una lampada riscaldante fino esibiscono governare il comportamento.
- Frena topi riceventi in un dispositivo di immobilizzazione e pulire la coda con il 70% (v / v) di etanolo per disinfettare il sito di iniezione.
- Iniettare 1-2 x 10 6 FACS filtrate cellule / topo (in 500 microlitri di PBS) in una delle due vene coda laterali.
Non forzare lo stantuffo. Se l'ago si trova opportunamente nella vena, l'iniezione avverrà con quasi nessuna resistenza.
4. Monitoraggio topi riceventi di iperglicemia e diabete di tipo 1
- Cominciando cinque giorni dopo il trasferimento di cellule T, topi riceventi NOD.SCID sono monitorati quotidianamente per elevati livelli di glucosio nelle urine con strisce reagenti (Bayer Diastix) secondo le istruzioni del produttore. I topi con due orino consecutivoletture di glucosio e> 250 mg / dl sono considerati diabetici.
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Representative Results
I nostri risultati mostrano l'isolamento di transgenici BDC2.5 cellule che esprimono CD62L, che è fondamentale per le cellule T a casa per organi linfoidi secondari, come i linfonodi pancreatici. I nostri risultati dimostrano ulteriormente la potente capacità di questa popolazione di cellule T monospecifico per il trasferimento rapido ed efficiente T1D di topi riceventi NOD.SCID.
Isolamento di diabetogeni CD4 + cellule T dei BDC2.5 topi è mostrato in Figura 2. Circa 5 x 10 7 cellule di milza e nei linfonodi pooled stati ottenuti per topo donatore prima separazione delle cellule. In seguito il tipo di citometria di flusso, ~ 2,5 x 10 6 cellule CD4 + T naive transgenici cellule (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) sono stati ottenuti da ciascun BDC2.5 topo donatore utilizzando la strategia di gating indicato.
Come previsto, il trasferimento adottivo di un piccolo numero di cellule CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + cellule (~ 1 x 10 6 cellule / topo) da BDC2.5 topi donatori indotta T1D in tutto NOD.SCID ri stinatari (incidenza al 100%) di giorno 11, come determinati da elevati livelli di glucosio nelle urine (Figura 3). In confronto, il trasferimento di eterogenea CD3 + BDC2.5 cellule T richiede 3-5 volte più cellule per indurre il diabete di tipo 1 nel 80% dei destinatari NOD.SCID da 3 settimane 21.
Questi dati dimostrano che il trasferimento adottivo di un piccolo numero di FACS-purificati BDC2.5 CD4 transgenici cellule + CD62L + T in topi NOD.SCID indotti T1D più rapido ed efficiente.
Figura 1. Sequenza di eventi sperimentali. Milza e linfonodi sono stati raccolti da BDC2.5 topi. Naive CD4 + T cellule transgeniche (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) sono stati isolati da FACS. Le cellule T sono state risospese in PBS ed iniettate per via endovenosa in NOD.SCID destinatari, che sono stati successivamente monitorati per elevati livelli di glucosio nelle urine indica T1D.
Figura 2. Strategia di gating per ordinare i CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + milza e linfa nodo cellule derivate da topi BDC2.5 di FACS. Una cella singola sospensione di milze in pool e dei linfonodi era macchiato di fluorescenza marcata anti-CD4 (APC), anti -TCR Vβ4 (FITC), e anti-CD62L (PE) mAb. La trama puntino a sinistra mostra i CD4 + TCR Vβ4 + popolazione di cellule che è stato utilizzato per cancello le cellule + CD62L, indicato a destra dot-plot. Cellule Boxed rappresentano percentuali di popolazioni di cellule chiuse.
Figura 3. Trasferimento adottivo di cellule CD4 diabetogenici cellule T. FACS-isolato CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + cellule da BDC2.5 topi sono stati iniettati per via endovenosa (1,3 x 10 6 cellule / topo) in topi riceventi NOD.SCID (n = 5). Topi were monitorato per T1D misurando le concentrazioni di glucosio nelle urine nei destinatari. Topi con due letture consecutive di> 250 mg / dl sono stati considerati diabetici.
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Discussion
T1D può essere indotta in topi riceventi a varie efficienze di trasferimento adottivo di cellule della milza intere o sottoinsiemi di cellule T da topi NOD diabetici o topi transgenici per il TCR derivati da cloni di cellule T diabetogenici. Riportiamo qui un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 in topi riceventi entro due settimane al 100% di incidenza con il trasferimento di FACS-purificati CD62L + BDC2.5 CD4 transgenici cellule T nei topi NOD.SCID.
Vantaggi specifici del modello di trasferimento di cellule T BDC2.5 descritti qui includono il tempo di induzione molto breve di diabete di tipo 1 rispetto al mese per il diabete spontaneo e fino a diverse settimane per il trasferimento di diabete di diabetogenici sottogruppi di cellule T o cloni di cellule T. Inoltre, a causa della loro omogeneità, solo un piccolo numero di cellule T purificate BDC2.5 transgeniche sono necessari per trasferire T1D con alta efficienza e coerenza. A differenza di alcuni altri metodi di trasferimento di cellule T, attivazione in vitro di cellule T transgenici BDC2.5 prima tradinsfer non è necessaria nel nostro protocollo. Un altro vantaggio del nostro metodo di trasferimento delle cellule T monospecifico è che le nuove strategie terapeutiche per intervenire nella homing di isolotto cellule T antigene-specifiche per l'organo bersaglio può essere indagato in modo più selettivo rispetto ad altri protocolli che il diabete di trasferimento con popolazioni di cellule T eterogenei.
Un potenziale limite del nostro metodo è che esso non è adatto per determinare il contributo di entrambi CD4 + e CD8 + cellule T nella patogenesi T1D perché monospecifici, diabetogene CD4 + cellule T sono utilizzati per trasferire diabete.
In assenza di uno strumento FACS, BDC2.5 cellule T transgeniche possono essere isolati mediante colonna-purificazione mediante PE-marcato anti-TCR Vβ4 mAb e biglie magnetiche anti-PE seguita da CD4 + CD62L + biglie magnetiche (Miltenyi).
Va notato che FACS-purificato, nonché purificato su colonna cellule T, comprenderà una popolazione minore di cellule T CD4 + Tha non esprimono il TCR transgenico a causa di incompleta esclusione allelica dei geni TCR endogeni 15. La frazione di cellule T purificato può anche comprendere CD4 + CD25 + Treg che potrebbero eliminare sviluppo T1D nei riceventi. Dal momento che sono stati segnalati due popolazioni di cellule T ad aumentare in BDC2.5 topi con l'età, si consiglia di utilizzare BDC2.5 topi che non sono più vecchi di sei settimane 22,23. CD4 + CD25 + Treg possono inoltre essere esclusi dalla BDC2.5 cellule T da FACS-ordinamento o di separazione con CD4 + CD25 + sfere magnetiche (Miltenyi) in più vecchie BDC2.5 topi.
In alternativa, o in aggiunta al monitoraggio T1D da misurazioni di glucosio nelle urine, i livelli di glucosio nel sangue può essere determinato con maggiore precisione in topi riceventi utilizzando un glucometro portatile.
Passaggi critici all'interno di questo protocollo sono l'età del donatore e BDC2.5 topi riceventi NOD.SCID. Utilizzando giovani BDC2.5 topi (6 settimane) farà in modo che essi sono il diabete e senza che la frequenza di entrambi enle cellule T non transgenici endogena e le cellule Treg sono bassi, come sopra evidenziato. E 'anche importante usare i giovani (<12 settimane) i topi NOD.SCID come topi riceventi perché questo ceppo è inclini a sviluppare timoma che si manifestano dopo 20 settimane di età 24 e può confondere sviluppo diabete di tipo 1 dopo il trasferimento delle cellule T adottivo.
Le future applicazioni del metodo descritto includono indagine CD4 T meccanismi cellulo-mediata di patogenesi T1D e nuove strategie per intervenire selettivamente a induzione della malattia, che non è fattibile in esseri umani.
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Disclosures
Tutti i topi sono stati alloggiati presso la Penn State College of Medicine impianto privo di patogeni (SPF) specifico in conformità con le linee guida del Penn State Institutional Animal Care e uso Comitato.
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Drs. Robert Bonneau e Neil Christensen per gli utili commenti.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Pennsylvania State University College of Medicine fondi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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