Summary
우리는 섬 항원 특정 기본 CD4 + T 세포의 입양 전송하여 두 주 이내에 생쥐에서 제 1 형 당뇨병 (T1D)를 유도하는 재생 방법을 제공합니다.
Abstract
nonobese 당뇨병 (NOD) 마우스 자발적 연령 12 주 후에 면역 당뇨병을 개발하고 인간 1 형 당뇨병 (T1D)의 가장 광범위하게 연구 동물 모델입니다. 조사받는 생쥐의 세포 이동 연구는 T 세포가이 모델 T1D 발병에 중요한 것을 설립했다. 우리는 빠르게 정화의 입양 전송에 T1D 유도하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명, 기본 CD4 + NOD.SCID받는 생쥐에 섬 특정 T 세포 수용체 (TCR) BDC2.5위한 형질 전환 전 당뇨병 NOD 생쥐에서 T 세포. 이 기술의 주요 장점은 같은 일 이내에, 수신자의 조사가 필요하지 않으며 T1D의 높은 발병률이 T 세포 전송 후 2 주 안에 이끌어됩니다 diabetogenic T 세포의 분리 및 입양 전송이 완료 될 수 있습니다. 따라서, T1D의 병인과 치료 개입의 연구는 이종 T 세포 집단 또는 복제에 의존하는 방법으로보다 빠른 속도로 진행할 수 있습니다당뇨병 NOD 생쥐에서 파생.
Introduction
NOD 마우스는 자발적으로자가 면역 당뇨병을 개발하고 널리 인간의 T1D 1,2에 대한 동물 모델로 사용되었습니다. NOD 생쥐에서 T1D의 발병 기전은 T와 B 세포에 의해 다음 수지상 세포와 대 식세포에 의한 랑게르한스의 췌장의, 나이, 3-4 주에 시작 침윤이 특징입니다. 비파괴 요정 인슐린 염이 단계는 3 세 ~ 6 개월 명백한 당뇨병의 결과로 인슐린 생산 췌장 β 세포의 느린 진보적 인 파괴에 이르게한다. 4,5 비장 세포, CD4 + 당뇨병 NOD 생쥐에서 6,7 또는 CD8 + 8,9 T 세포의 이동은 섬 반응 T 세포가 T1D 병인에 중요한 역할을한다는 것을 나타내는 면역 NOD 생쥐에서 당뇨병을 중재하기 위해 표시되었습니다. 실험 조건에 따라 당뇨병이 연구의 여러 주에 걸쳐 서서히받는 생쥐에서 개발했습니다. 마찬가지로, 다양한 T 세포 클론은 시간과 비용에 의해 파생diabetogenic T 세포의 배양은 몇 주받는 마우스 7,10로 전송 한 후 당뇨병을 중재하는 것으로보고되었다. CD4 또는 CD8 제한된 diabetogenic T 세포 클론, 여러 실험실에서 파생하는 TCR 표현 형질 전환 생쥐의 가용성이어서는 마우스에서 비장 T 세포가 11-13 사람에게 당뇨병을 전송 할 수 있었던 것으로 나타났습니다. 특히, BDC2.5 NOD 마우스는 chromogranin A, 췌장 베타 세포 14-16에서 단백질 특정 BDC2.5 TCR에 대한 형질 전환합니다. 체외 활성화 또는 효율성에게 11,17-19 다양한에서 신생아 나 면역 결핍 NOD 마우스로 당뇨병을 전송 공공연히 당뇨병 또는 prediabetic BDC2.5 생쥐 해제 활성화 또는 전부를 분별 비장 세포에서의 전송합니다.
우리는 정제 된 형질 전환 CD4를 사용하는 간단한 방법 + 높은 효율과 consiste에서받는 생쥐에서 T1D 유도하는 사전 당뇨병 BDC2.5 생쥐에서 T 세포를 설명NCY. 순진, 섬 항원 특이 CD4 + T 세포의 큰 숫자는 CD4에 대한 형광 활성 세포 정렬 (FACS) 형질 전환 TCR Vβ4 체인을 표현 + CD62L + T 세포에 의해 이러한 생쥐에서 격리됩니다. 정제 된 유전자 변형 T 세포는 그 기능 T 및 B 세포의 부족과 인슐린 염 및 당뇨병 무료 20아르 NOD.SCID 마우스로 작동하지 않는 전송됩니다. 받는 마우스는 T 세포 전송 후 2 주 이내에 신속하게 개발 T1D를 나타내는 소변 포도당의 높은 농도를 모니터링합니다.
이종 특이성과 diabetogenic T 세포를 전송, 우리의 프로토콜은 FACS 정렬 된 CD4 + 거의 독점적으로 diabetogenic BDC2.5 TCR을 표현하는 T 세포를 사용하는 다른 방법과 달리. 자신의 동질성으로 인해, 전송 T 세포 (~ 1X10 6 세포 / 마우스) 만 작은 숫자가 100 % 발생에서 2 주 안에 신속하게 T1D 개발을 위해 필요합니다. 우리의 프로토콜의 또 다른 장점은 irradiatio입니다받는 생쥐의 N은 다른 방법입니다 필요하지 않습니다. 이 방법의 잠재적 인 제한은 모두 CD4와 CD8 T 세포의 하위 집합 또는 특정 당뇨병 CD8 T 세포의 공헌에 대해 조사를 허용하지 않는 것입니다.
설명 프로토콜은 대상 기관에 섬 항원 특이 목 세포의 유도에 개입 순진, monospecific CD4 + T 세포뿐만 아니라 치료 전략에 의해 중재 빠른 T1D 개발, 연구에 유용 할 것입니다.
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Protocol
1. 비장과 BDC2.5 쥐의 림프절에서 T 세포의 분리
- diabetogenic CD4 + T 세포의 기증자로 6 주 된 사전 당뇨병 여성 BDC2.5 마우스를 사용합니다. 소변 포도당 측정 (아래 참조)에 의해 결정되는 마우스는 당뇨병이 없어야합니다.
- CO 2 질식을 사용하여 각 마우스를 안락사 및 무균 조건 하에서 비장, 겨드랑이 및 상완 림프절을 제거합니다. 비장을 제거하려면, 70 % 에탄올로 모피를 흡수 한 다음 잘라 피부를 철회. 비장은 마우스의 왼쪽에 어두운 붉은 기관으로 볼 수 있습니다. 작은 가위를 사용하여 복막의 1 인치 절개를 부드럽게 작은 핀셋 한 쌍의 중앙에 비장을 파악. 조심스럽게 결합 조직과 연결된 지방 최대한 트림과 비장을 제거합니다.
- 얼음에 15 ML 원뿔 튜브 10 ML Dulbecco's으로 수정 이글의 중간 (DMEM)에서 비장과 림프절을 수집합니다.
- 일을 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다부드럽게 70 μm의 셀 스트레이너 (여과기 당 하나의 비장과 스트레이너 당 4-6 림프절) 같은 50 ML 원뿔 튜브로를 통해 림프 기관을 누릅니다 멸균 10 ML의 주사기 플런저의 전자 끝.
이 과정에서, 스트레이너에서 세포의 회복을 최대화하기 위해 1 ML DMEM 여러 번 각 스트레이너 린스.
- RT에서 12 분 동안 300 ~ 400 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 50 ML 원뿔 튜브에서 수집 된 세포를 전송합니다.
- 적혈구를 용해하는, 상층 액을 버리고, 5 ML 암모늄 - 염화 칼륨 (ACK) 버퍼 (산도 7.2)에서 세포를 다시 일시 중지하고 5 분 RT에서 ACK 세포 현탁액을 품어.
- ACK 세포 현탁액에 DMEM 10 ML을 추가하고 위와 같이 튜브를 원심 분리기. 10 ML DMEM에 한 번 세포 펠렛을 씻으십시오.
2. Diabetogenic CD4의 형광 활성 세포 정렬 + BDC2.5 마우스에서 T 세포
- 5 ML 외과의에서 다시 일시 중지합니다 세포버퍼를 함유 성 및 판 블루 염색 배제하여 가능한 세포 (위상차 현미경과 혈구를 사용하여)의 수를 계산합니다.
- FACS 버퍼를 사용하여 5 × 10 7 세포 / ML에 세포 현탁액 볼륨을 조정합니다. ~ 제거 1 × 10 염색 제어 당 6 셀 (1 아무 얼룩, 3 단 얼룩). 비 활성화 된 유전자 변형 CD4 + 안티 CD4와 T 세포 (APC), 안티 TCR Vβ4 (FITC)와 15 ML 튜브에 반대로 CD62L (PE) 단일 클론 항체 (단클론 항체)에 대한 샘플을 얼룩. 어둠 속에서 4시에 20 ~ 30 분 동안 제조업체에서 권장하는 단클론 항체의 농도 ° C를 사용하여 세포 염색을 수행합니다.
- > 배 염색 반응 볼륨 FACS 버퍼와 샘플 및 단일 얼룩 컨트롤을 씻으십시오. (1-2 X 10 6 세포 / 샘플을 정렬 ML 300 μL 하나의 얼룩 컨트롤)과 얼음에 저장 다음까지 300 ~ 400 XG에서 튜브를 원심 분리, 상층 액을 제거하고 FACS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다 단계.
- 35 μm의 세포를 통해 세포 샘플을 전달스트레나 캡 튜브는 세포 덩어리를 제거합니다. CD4에 대한 샘플을 정렬 + TCR Vβ4 + CD62L + 훈련 연산자 세포 분류기의 셀. 15 ML 튜브에 3 ML DMEM으로 정렬 세포를 수집합니다. 2 × 10 총 4 개 이벤트 / 초의 정렬 속도 1.5 X 10 8 셀 (3 공여 생쥐에서 얻은 세포의 대략적인 개수) 정렬하려면, 설치 등 2.5-3 시간을 허용합니다. 기대 ~ 2.5 × 10 6 비 활성화 된 유전자 변형 CD4 + 세포 분류 한 후 마우스 당 T 세포.
- 정렬의 끝에 정렬 된 세포의 절대 수를 기록하고 300 ~ 400 X g에서 12 분을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 다시 중단 세포 (2 × 10 6 세포 / ㎖)의 멸균 인산 완충 입양 T 세포의 이동을위한 식염수 (PBS) (MG 2 + / 칼슘 2 + 무료).
3. BDC2.5 쥐에서 Diabetogenic CD4의 입양 전송 + T 세포
- 다시 일시 중지합니다 FACS - 정제 된 CD4 부드럽게, 1 ML의 주사기와 18-1 ½ 게이지 바늘을 사용하여 +1 ML의 주사기를 T 세포를로드합니다. 주입을위한 준비, 18-1를 교체 ½ 게이지 바늘을 27과 ½ 게이지 바늘을.
- 그들은 행동을 손질 전시 될 때까지 가열 램프 6-8 주 된 여성 NOD.SCID받는 쥐를 노출합니다.
- 고정 장치에서받는 생쥐을 억제하고 주사 부위를 소독 70 % (V / V) 에탄올로 자신의 꼬리를 닦아냅니다.
- 측면 꼬리 정맥 중 하나에 1-2 X 10 6 FACS 분류 세포 / 마우스 (최대 500 μL PBS)로 주입한다.
플런저를 강요하지 않습니다. 바늘이 정맥에 적절하게있는 경우, 주입 거의 저항 일어날 것입니다.
4. 고혈당에 대한받는 사람 쥐 모니터링 및 T1D
- T 세포 전송 후 5 일부터 NOD.SCID받는 마우스는 제조업체의 지침에 따라 시약 스트립을 (바이엘 Diastix)를 사용하여 높은 소변 포도당 동안 매일 모니터링됩니다. 두 개의 연속 urin와 마우스전자 포도당 수치가> 250 ㎎ / dl로는 당뇨병 간주됩니다.
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Representative Results
우리의 결과는 췌장 림프절로 차 림프 기관에 집 T 세포에 대한 중요한 CD62L을 표현 형질 전환 BDC2.5 세포의 분리를 보여줍니다. 우리의 연구 결과는 더 빠르게 전송하고 효율적으로 NOD.SCID받는 마우스에 T1D이 monospecific T 세포 인구의 강력한 기능을 보여줍니다.
diabetogenic CD4 + BDC2.5 생쥐에서 T 세포의 분리는 그림 2에 표시됩니다. 풀 비장과 림프절에서 약 5 × 10 7 세포는 세포 분류하기 전에 기증자 마우스를 당 하였다. 유세포 종류에 따라, ~ 2.5 × 10 6 순진 형질 전환 된 CD4 + T 세포 (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +)가 표시된 게이팅 전략을 사용하여 각 BDC2.5 기증자 마우스에서 얻은 하였다.
CD4의 작은 숫자의 예상 입양 전송 등 + TCR Vβ4 + CD62L + 세포 (1 ~ 6 셀 / 마우스 X 10) BDC2.5 공여 생쥐의 모든 NOD.SCID 재에 T1D 유도 하루 11로 cipients (100 % 발생률)와 같은 소변 포도당의 높은 수준 (그림 3)에 의해 결정됩니다. 비교 이기종 CD3의 전송 + BDC2.5 T 세포 3 주 (21)에 의해 80 % NOD.SCID받는 사람에 T1D 유도하기 3-5 배 더 많은 세포를 요구했다.
이 자료는보다 신속하고 효율적으로 T1D 유도 NOD.SCID 마우스로 FACS - 정제 BDC2.5 형질 전환 CD4 + CD62L + T 세포의 작은 숫자의 입양 전송을 보여줍니다.
그림 1. 실험적인 이벤트의 시퀀스입니다. 비장과 림프절 BDC2.5 생쥐에서 수집되었다. 순진 형질 전환 CD4 + T 세포 (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +)를 FACS로 분리 하였다. T 세포는 PBS에 재 부유하고 이후 T1D를 나타내는 높은 소변 포도당 감시했다 NOD.SCID 수신자로 정맥 주사 하였다.
그림 2. 정렬 CD4에 게이팅 전략 + TCR Vβ4 + CD62L + FACS로 BDC2.5 생쥐 비장과 림프절에서 파생 된 세포. 풀 비장과 림프 노드의 단일 세포 현탁액은 형광 표지 된 항-CD4 (APC)로 염색 한 반 - TCR Vβ4 (FITC), 및 안티-CD62L (PE) 단클론 항체. 왼쪽에있는 점 줄거리 CD4를 보여줍니다 + TCR Vβ4 게이트 오른쪽 도트 플롯에 표시된 CD62L + 세포를,에 사용 된 + 세포 인구. 박스 셀은 게이트 세포 인구의 비율을 나타냅니다.
그림 3. diabetogenic CD4 + T 세포의 입양 전송. FACS 절연 CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + BDC2.5 생쥐의 세포를 정맥 NOD.SCID받는 마우스 (N = 5)로 (1.3 X 10 6 세포 / 마우스) 주입 하였다. 마우스 WERE는받는 사람의 소변 포도당 농도를 측정하여 T1D에 대한 감시. > 250 ㎎ / dl로 두 개의 연속적인 판독 마우스는 당뇨병으로 간주 하였다.
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Discussion
T1D은 당뇨병 NOD 마우스 또는 diabetogenic T 세포 클론에서 유래 TCR는 형질 전환 생쥐에서 전체 비장 세포 또는 T 세포 부분 집합의 입양 전송하여 효율성을 다양한에서받는 생쥐에서 유도 할 수 있습니다. 우리는 여기 NOD.SCID 생쥐에 FACS - 정제 CD62L + BDC2.5 형질 전환 된 CD4 + T 세포를 전송하여 100 % 발생에서 2 주 이내에받는 생쥐에서 T1D 유도하는 재생 방법을보고합니다.
BDC2.5 T 세포 이동 모델 별 장점은 자연 당뇨병 개월 및 최대 diabetogenic T 세포의 하위 집합 또는 T 세포 클론에 의한 당뇨병 전송을위한 몇 주에 비해 T1D의 매우 짧은 유도 시간을 포함 여기에 설명. 또한, 자신의 동질성으로 인해 BDC2.5 형질 전환 된 T 세포를 정화의 단지 작은 숫자는 높은 효율성과 일관성 T1D 전송해야합니다. 이전 TRA에 형질 전환 BDC2.5 T 세포의 생체 활성에 다른 T 세포의 전송 방법과 달리nsfer은 우리의 프로토콜 필요가 없습니다. 우리 monospecific T 세포 전송 방법의 또 다른 장점이 대상 기관에 섬 항원 특이 T 세포의 유도에 개입하는 새로운 치료 전략이다 더 많은 선택적으로 다른 프로토콜에 비해 조사 할 수있는 이기종 T 세포 인구 이동 당뇨병.
우리의 방법의 잠재적 인 한계는 그것이 monospecific, diabetogenic CD4 + T 세포가 당뇨병을 전송하는 데 사용되기 때문에 모두 CD4 +와 T1D 병인에서 CD8 + T 세포 부분 집합의 기여를 결정하는 데 적합하지 않습니다 것입니다.
FACS 악기의 부재, BDC2.5 형질 전환 된 T 세포는 CD4 다음 PE - 라벨 안티 TCR Vβ4 단클론 항체와 anti-PE 자석 구슬을 사용하여 컬럼 정제로 분리 할 수 있습니다 + CD62L + 자석 구슬 (있는 Miltenyi).
그것은 FACS - 정제는,뿐만 아니라 T 세포를 열 정화 주목해야한다, CD4의 작은 인구를 포함합니다 + T 세포에게 일을에서 내생 TCR 유전자의 불완전한 대립 유전자 배제 15에 의한 형질 전환 TCR을 표명하지 아니합니다. 정제 된 T 세포 비율은받는 사람의 T1D 개발을 억제 할 수 CD4 + CD25 + Treg 세포를 포함 할 수 있습니다. 모두 T 세포 인구가 나이 BDC2.5 생쥐에서 증가하는 것으로보고되고 있기 때문에, 우리는 육주 22,23 세 이상없는 BDC2.5 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. CD4 + CD25 + Treg 세포가 선택적으로 CD4와 FACS - 정렬 또는 분리에 의해 BDC2.5 T 세포에서 제외 할 수 있습니다 + CD25 세 BDC2.5 쥐 + 자석 구슬 (있는 Miltenyi).
또한, 소변 포도당 측정을 통해 T1D 모니터링뿐만 아니라, 혈당 수치는 휴대용 glucometer에를 사용하여받는 생쥐에서보다 정확하게 측정 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 중요한 단계는 BDC2.5 기증자와 NOD.SCID받는 생쥐의 나이를 이용하실 수 있습니다. 젊은 BDC2.5 마우스 (6 주)를 사용하여 그들이 당뇨병이없는 것을 확인하고있는 것 EN 양의 주파수dogenous 비 형질 전환 T 세포와 Treg 세포가 낮은 위와 같이 지적했다. 그것은이 변형 24 세 20 주 이후에 자신을 매니 페스트와 입양 T 세포의 이동에 따라 T1D 개발을 혼동 할 수 thymomas을 개발하는 경향이 있기 때문에받는 사람이 마우스로 젊은 (<12 주) NOD.SCID 마우스를 사용하는 것도 중요합니다.
설명 방법의 미래 응용 프로그램은 CD4의 조사를 포함 T T1D 발병과 인간에 적합하지 않습니다 질병 유도에 선택적으로 개입하는 새로운 전략의 세포 성 메커니즘.
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Disclosures
모든 마우스는 펜 스테이트 기관 동물 관리의 지침에 따라 및 사용위원회 의과 특정 병원균이없는 (SPF) 시설의 펜실베니아 주립 대학에서 지내게되었다.
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 Drs에 감사드립니다. 도움이 덧글에 대한 로버트 BONNEAU 닐 크리스텐슨.
이 작품은 의학 자금의 펜실베니아 주립 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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