Summary
Proporcionamos un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 (DM1) en ratones dentro de dos semanas por la transferencia adoptiva de células del islote T específicas de antígeno, células CD4 + primarias.
Abstract
El ratón diabético no obeso (NOD) desarrolla espontáneamente diabetes autoinmune después de 12 semanas de edad y es el modelo animal más ampliamente estudiado de humano de tipo 1 diabetes (DM1). Estudios de la transferencia de células en ratones receptores irradiados han establecido que las células T son esenciales en la patogénesis de DT1 en este modelo. Se describe en este documento un método simple para inducen rápidamente DT1 por transferencia adoptiva de purificado, las células T de ratones NOD prediabéticos transgénicos para el receptor de células T islote-específico (TCR) BDC2.5 en ratones receptores NOD.SCID CD4 + primarias. Las principales ventajas de esta técnica son que el aislamiento y transferencia adoptiva de células T diabetogénicos se puede completar en el mismo día, no se requiere la irradiación de los destinatarios, y una alta incidencia de diabetes tipo 1 está provocada dentro de 2 semanas después de la transferencia de células T. Por lo tanto, los estudios de la patogénesis y las intervenciones terapéuticas en DT1 puedan tener lugar a un ritmo más rápido que con los métodos que se basan en poblaciones de células T heterogéneas o clonesderivados de ratones NOD diabéticos.
Introduction
El ratón NOD desarrolla la diabetes autoinmune espontánea y ha sido ampliamente utilizado como un modelo animal para el 1,2 DT1 humana. Patogénesis de la diabetes tipo 1 en ratones NOD se caracteriza por la infiltración, a partir de las 3-4 semanas de edad, de los islotes de Langerhans del páncreas por las células dendríticas y los macrófagos, seguido por las células T y B. Esta fase de no destructiva peri-insulitis conduce a una destrucción lenta y progresiva de las células β pancreáticas productoras de insulina, lo que resulta en la diabetes manifiesta por 4-6 meses de edad de 3 años. La transferencia de esplenocitos CD4 + 4,5, 6,7 o 8,9 CD8 + células T de ratones NOD diabéticos han demostrado mediar en la diabetes en ratones NOD inmunocomprometidos, lo que indica que las células T de islotes reactivos juegan un papel central en la patogénesis de DT1. Dependiendo de las condiciones experimentales, la diabetes desarrollada en ratones receptores lentamente, durante varias semanas en estos estudios. Del mismo modo, varios clones de células T, que se deriven por mucho tiempo y es costosocultivo de las células T diabetogénicas, se han reportado para mediar la diabetes varias semanas después de la transferencia en ratones receptores 7,10. Con la disponibilidad de ratones transgénicos que expresan TCR derivados de varios laboratorios diabetogénicos clones CD8 restringidas de células T CD4-o posteriormente, han demostrado que las células T esplénicas de tales ratones fueron capaces de transferir la diabetes a receptores 11-13. Específicamente, BDC2.5 ratones NOD son transgénicas para la BDC2.5 TCR, que es específico para la cromogranina A, una proteína en las células beta pancreáticas 14-16. La transferencia de las células enteras o fraccionadas no se han activado bazo de abiertamente diabéticos o prediabéticos BDC2.5 ratones transferidos diabetes a ratones NOD neonatales o inmunodeficientes con eficiencias variables 11,17-19 vitro activada o.
Se describe un método simple que utiliza transgénicos CD4 + células T purificadas de pre-diabéticos BDC2.5 ratones para inducir T1D en ratones receptores a alto rendimiento y consistencia. Un gran número de células T ingenuas, islotes CD4 + específicas de antígeno están aislados de estos ratones por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para CD4 + CD62L + células T que expresan la cadena TCR transgénico de Vβ4. Células T transgénicas purificadas se transfieren a continuación sin activación en ratones NOD.SCID, que carecen de T funcionales y las células B y son-insulitis y la diabetes-libre 20. Los ratones receptores son monitoreados para concentraciones elevadas de glucosa en la orina que indican DT1, que se desarrolla rápidamente dentro de las dos semanas después de la transferencia de células T.
En contraste con otros métodos que transferir las células T diabetogénicas con especificidades heterogéneas, nuestro protocolo utiliza células T que expresan casi exclusivamente la diabetogénico BDC2.5 TCR FACS-ordenados CD4 +. Debido a su homogeneidad, sólo un pequeño número de células T transferidas (~ 1x10 6 células / ratón) se requieren para el desarrollo de DT1 rápida dentro de 2 semanas en el 100% de incidencia. Otra ventaja de nuestro protocolo es que irradiation de los ratones receptores no es necesario, ya que es para algunos otros métodos. Una limitación potencial de este método es que no permite la investigación de la contribución tanto de las células T CD8 en la diabetes CD4 y CD8 subconjuntos de células T o específicamente.
El protocolo descrito será útil para estudiar el desarrollo DT1 rápida, mediada por células T ingenuas, estrategias terapéuticas CD4 + monoespecíficos, así como para intervenir en homing de las células Th específicas de antígeno islotes en el órgano diana.
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Protocol
1. Aislamiento de células T del bazo y los ganglios linfáticos de los ratones BDC2.5
- Use 6 semanas de edad pre-diabéticos hembra BDC2.5 ratones como donantes de células T CD4 + diabetogénicos. Los ratones deben ser libres de diabetes tal como se determina por medición de glucosa en la orina (véase a continuación).
- La eutanasia a cada ratón mediante asfixia con CO2 y extraer los ganglios linfáticos del bazo, axilares y braquiales en condiciones estériles. Para quitar el bazo, empape la piel con etanol al 70%, luego se corta y retraer la piel. El bazo será visible como un órgano de color rojo oscuro en el lado izquierdo del ratón. Hacer una incisión de 1 pulgada en el peritoneo usando las tijeras pequeñas y pellizque suavemente el bazo en el centro con un par de pinzas pequeñas. Recorte con cuidado el tejido conjuntivo y la grasa adjunta tanto como sea posible y extirpar el bazo.
- Recoger los bazos y los ganglios linfáticos en 10 ml de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) en un tubo cónico de 15 ml en hielo.
- Preparar una suspensión de células individuales mediante el uso de thfinal e de 10 ml émbolo de la jeringa estéril para presionar suavemente los órganos linfoides a través de 70 células coladeras micras (una bazo por colador y 4-6 ganglios linfáticos por filtro) en el mismo tubo cónico de 50 ml.
Durante el proceso, enjuague cada filtro con 1 ml de DMEM varias veces para maximizar la recuperación de células del colador.
- Transferir las células recogidas del tubo cónico de 50 ml en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 300-400 xg durante 7 minutos a temperatura ambiente.
- Para lisar las células rojas de la sangre, descartar el sobrenadante, resuspender las células en 5 ml de amonio-cloruro y potasio (ACK) tampón (pH 7,2), y se incuba la suspensión ACK de células a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir 10 ml de DMEM a la suspensión ACK de células y centrifugar el tubo como anteriormente. Lavar el sedimento celular una vez en 10 ml de DMEM.
2. Clasificación de células activadas por fluorescencia de las células CD4 + T diabetogénico células de BDC2.5 Ratones
- Vuelva a suspender las células en 5 ml FACS sconteniendo tampón y contar el número de células viables (usando un microscopio de contraste de fase y un hemocitómetro) por exclusión del colorante azul de tripano.
- Uso de tampón FACS, ajustar el volumen de suspensión celular a 5 x 10 7 células / ml. Retire ~ 1 x 10 6 células por tinción de control (1, 3 sin mancha manchas individuales). Teñir la muestra de células T con anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) y los anticuerpos anti-CD62L (PE) monoclonal (AM) en un tubo de 15 ml CD4 transgénicos no + activadas. Realizar tinción de las células utilizando las concentraciones de mAb sugeridas por el fabricante durante 20-30 min a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar la muestra y los controles de las manchas individuales con tampón FACS a> 3 veces el volumen de reacción de tinción. Centrifugar el tubo a 300-400 xg, separar el sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS (1-2 x 10 7 células / ml para la clasificación de la muestra y de 300 l para los controles de manchas individuales) y almacenar en hielo hasta la próxima paso.
- Pasar la muestra de células a través de una celda de 35 micrastubo colador tapa para eliminar los agregados celulares. Ordena las muestras de CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + células en un clasificador de células con un operador entrenado. Recoger las células clasificadas en 3 ml de DMEM en un tubo de 15 ml. Permitir 2.5-3 horas, incluyendo la instalación, para ordenar 8 células 1,5 x 10 (el número aproximado de células obtenidas a partir de 3 ratones donantes) a una tasa de tipo de 2 x 10 4 Total de eventos / seg. Esperar ~ 2,5 x 10 6 células T por ratón después de la clasificación de células CD4 transgénicos no + activadas.
- Registre el número absoluto de células clasificadas en el extremo de la especie y centrifúguelas durante 7 minutos a 300-400 x g. Descartar el sobrenadante y volver a suspender las células (2 x 10 6 células / ml) en estéril buffer fosfato salino (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + libre) para la transferencia adoptiva de células T.
3. La transferencia adoptiva de células CD4 + T las células diabetogénico de BDC2.5 Ratones
- Con una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 18 a 1 ½, suavemente volver a suspender las células CD4 + purificados por FACSCélulas T y cargar la jeringa de 1 ml. En preparación para la inyección, reemplace la aguja de calibre 18 a 1 ½ con una aguja de calibre 27 ½.
- Exponga 6-8 semanas de edad ratones hembras receptoras NOD.SCID a una lámpara de calentamiento hasta que exhiben comportamiento de acicalamiento.
- Sujetar ratones receptores en una inmovilización y limpie la cola con 70% (v / v) de etanol para desinfectar el sitio de inyección.
- Inyectar 1-2 x 10 6 células / ratón FACS ordenados (en hasta 500 l de PBS) en cualquiera de las venas de la cola lateral.
No fuerce el émbolo. Si la aguja se encuentra adecuadamente en la vena, la inyección se llevará a cabo sin apenas resistencia.
4. Monitoreo ratones receptores de hiperglucemia y diabetes tipo 1
- A partir de cinco días después de la transferencia de células T, los ratones receptores NOD.SCID son monitoreados diariamente por elevación de glucosa en la orina usando tiras de reactivo (Bayer Diastix) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ratones con dos Urin consecutivolecturas de glucosa e> 250 mg / dl se consideraron diabéticos.
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Representative Results
Nuestros resultados muestran el aislamiento de células transgénicas que expresan CD62L BDC2.5, lo cual es crítico para las células T a casa a los órganos linfoides secundarios tales como los ganglios linfáticos pancreáticos. Nuestros resultados demuestran una vez más la potente capacidad de esta población de células T monoespecíficos para transferir rápida y eficazmente DT1 a ratones receptores NOD.SCID.
Aislamiento de células T procedentes de ratones BDC2.5 CD4 + diabetogénicos se muestra en la Figura 2. Aproximadamente 5 x 10 7 células de bazo y los ganglios linfáticos agrupados se obtuvieron por ratón donante antes de la clasificación de células. Después de la especie de citometría de flujo, ~ 2,5 x 10 6 células CD4 + T ingenuas transgénicos células (células CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) se obtuvieron de cada BDC2.5 ratón donante mediante el uso de la estrategia de puerta indicado.
Como era de esperar, la transferencia adoptiva de un pequeño número de CD4 + células TCR Vβ4 + CD62L + (~ 1 x 10 6 células / ratón) de BDC2.5 ratones donantes inducida por diabetes tipo 1 en todo el re NOD.SCID excipientes (100% de incidencia) por 11 días, según lo determinado por los niveles elevados de glucosa en la orina (Figura 3). En comparación, la transferencia de heterogénea CD3 + células T requiere BDC2.5 3-5 veces más células para inducir la diabetes tipo 1 en el 80% en receptores NOD.SCID por 3 semanas 21.
Estos datos demuestran que la transferencia adoptiva de un pequeño número de FACS-purificadas BDC2.5 + CD62L + células T CD4 transgénicos en ratones NOD.SCID inducidas T1D más rápida y eficaz.
Figura 1. Secuencia de eventos experimentales. Bazo y los ganglios linfáticos se obtuvieron de ratones BDC2.5. CD4 transgénicos Naive + células T (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) se aislaron por FACS. Las células T se resuspendieron en PBS y se inyectaron por vía intravenosa en los receptores NOD.SCID, que fueron monitoreados posteriormente por elevación de glucosa en la orina que indica DT1.
Figura 2. Estrategia de apertura de puerta para ordenar CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + células de ganglios linfáticos y el bazo derivadas de ratones BDC2.5 por FACS. Una suspensión de una sola célula de bazo y los ganglios linfáticos agrupados estaba manchada con marcadas con fluorescencia anti-CD4 (APC), anti -TCR Vβ4 (FITC), y anti-CD62L (PE) mAb. El gráfico de puntos de la izquierda muestra los CD4 + TCR + Vβ4 población celular que se usó para la puerta de las células + CD62L, que se muestra en el gráfico de puntos correcto. Células en cajas representan los porcentajes de las poblaciones de células cerradas.
Figura 3. La transferencia adoptiva de células T CD4 + diabetogénicos. FACS aislado CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + células de BDC2.5 ratones fueron inyectados por vía intravenosa (1,3 x 10 6 células / ratón) en ratones receptores NOD.SCID (n = 5). Ratones were monitoreado por T1D mediante la medición de las concentraciones de glucosa en la orina de los destinatarios. Los ratones con dos lecturas consecutivas de> 250 mg / dl se consideraron diabéticos.
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Discussion
DT1 puede ser inducida en ratones receptores a diferentes eficiencias de la transferencia adoptiva de células de bazo completas o subconjuntos de células T de ratones NOD diabéticos o ratones transgénicos para TCR derivados de clones de células T diabetogénicos. Presentamos aquí un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 en ratones receptores dentro de dos semanas en el 100% de incidencia mediante la transferencia de FACS purificados por CD62L + BDC2.5 células T CD4 + en ratones transgénicos NOD.SCID.
Las ventajas específicas del modelo de transferencia de células T BDC2.5 descritos aquí incluyen el tiempo de inducción muy corto de diabetes tipo 1 en comparación con el mes de la diabetes espontánea y hasta varias semanas para la transferencia de la diabetes por diabetogénicos subconjuntos de células T o clones de células T. Además, debido a su homogeneidad, sólo un pequeño número de células T transgénicas BDC2.5 purificada se requieren para transferir DT1 con alta eficiencia y consistencia. En contraste con algunos otros métodos de transferencia de células T, en la activación in vitro de las células transgénicas BDC2.5 T antes de la TRAnsfer no es necesaria en el protocolo. Otra ventaja de nuestro método de transferencia de células T que es monoespecífico nuevas estrategias terapéuticas para intervenir en el homing de las células de los islotes T específicas de antígeno en el órgano diana puede ser investigado más selectivamente que con otros protocolos de transferencia de que la diabetes con poblaciones de células T heterogéneas.
Una limitación potencial de nuestro método es que no es adecuado para determinar la contribución de ambos CD8 + subconjuntos de células T en la patogénesis DT1 CD4 + y porque las células T, CD4 monoespecíficos diabetogénicos + se utilizan para transferir la diabetes.
En la ausencia de un instrumento FACS, BDC2.5 células T transgénicas pueden ser aislados por la columna-purificación utilizando marcado con PE anti-TCR Vβ4 mAb y anti-PE perlas magnéticas seguido por las células CD4 + CD62L + perlas magnéticas (Miltenyi).
Cabe señalar que FACS-purificada, así como las células T columna-purificado, incluirá una población menor de células T CD4 + ªal no expresar el TCR transgénico debido a la incompleta exclusión alélica de genes TCR endógenos 15. La fracción de células T purificadas también puede incluir CD25 + células Treg CD4 + que pueden suprimir el desarrollo de diabetes tipo 1 en los receptores. Dado que ambas poblaciones de células T se ha informado a aumentar en BDC2.5 ratones con la edad, se recomienda utilizar BDC2.5 ratones que no sea más viejo de 6 semanas 22,23. Las células CD4 + CD25 + Treg, alternativamente, pueden ser excluidos de BDC2.5 células T por FACS de clasificación o separación con células CD4 + CD25 + perlas magnéticas (Miltenyi) en mayores BDC2.5 ratones.
Alternativamente, o además de la vigilancia DT1 por mediciones de glucosa en la orina, los niveles de glucosa en la sangre se pueden determinar con más precisión en los ratones receptores usando un glucómetro de mano.
Los pasos críticos dentro de este protocolo incluyen la edad del donante y BDC2.5 ratones receptores NOD.SCID. Usando jóvenes BDC2.5 ratones (6 semanas) se asegurará de que son libres de diabetes y que la frecuencia de ambos enendógenas células T no transgénicos y células Treg son bajos, como se ha señalado anteriormente. También es importante la utilización de ratones jóvenes NOD.SCID (<12 semanas) como ratones receptores porque esta cepa es propenso a desarrollar timomas que se manifiestan después de 20 semanas de edad de 24 años y puede confundir el desarrollo de diabetes tipo 1 después de la transferencia adoptiva de células T.
Las futuras aplicaciones del método descrito incluyen la investigación en las células CD4 T mecanismos mediados por células de la patogénesis DT1 y nuevas estrategias para intervenir selectivamente en la inducción de la enfermedad, lo que no es posible en los seres humanos.
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Disclosures
Todos los animales fueron alojados en el Colegio de instalación libre de patógenos específicos Medicine (SPF) de conformidad con las directrices del Estado de Penn Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión Estatal de Pensilvania.
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a los Dres. Robert Bonneau y Neil Christensen por sus valiosos comentarios.
Este trabajo fue apoyado por Pennsylvania State University College of Medicine fondos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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