Summary
हम आइलेट विशिष्ट प्रतिजन, प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण से दो सप्ताह के भीतर चूहों में टाइप 1 मधुमेह (T1D) उत्पन्न करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करते हैं.
Abstract
nonobese मधुमेह (इशारा) माउस अनायास उम्र के 12 सप्ताह के बाद autoimmune मधुमेह विकसित और मानव टाइप 1 मधुमेह (T1D) के सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन पशु मॉडल है. विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों में सेल हस्तांतरण पढ़ाई टी कोशिकाओं के इस मॉडल में T1D रोगजनन में निर्णायक हैं कि स्थापना की है. हम तेजी से शुद्ध के दत्तक हस्तांतरण द्वारा T1D प्रेरित करने के साथ साथ एक सरल विधि का वर्णन है, प्राथमिक सीडी 4 + NOD.SCID प्राप्तकर्ता चूहों में आइलेट विशेष टी सेल रिसेप्टर (TCR) BDC2.5 के लिए ट्रांसजेनिक पूर्व मधुमेह इशारा चूहों से टी कोशिकाओं. इस तकनीक का प्रमुख लाभ एक ही दिन के भीतर, प्राप्तकर्ताओं की विकिरण की आवश्यकता नहीं है, और T1D के एक उच्च घटना के टी सेल स्थानांतरण के बाद 2 सप्ताह के भीतर हासिल है मधुमेहजनक टी कोशिकाओं के अलगाव और दत्तक हस्तांतरण पूरा किया जा सकता है कि कर रहे हैं. इस प्रकार, T1D में रोगजनन और उपचारात्मक उपायों की पढ़ाई heterogenous टी सेल आबादी या क्लोन पर निर्भर है कि तरीकों के साथ तुलना में एक तेज दर से आगे बढ़ सकते हैंमधुमेह इशारा चूहों से ली गई.
Introduction
इशारा माउस अनायास autoimmune मधुमेह विकसित करता है और व्यापक रूप से मानव T1D 1,2 के लिए एक पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. इशारा चूहों में T1D के रोगजनन टी और बी कोशिकाओं द्वारा पीछा वृक्ष के समान कोशिकाओं और मैक्रोफेज द्वारा Langerhans की अग्नाशय islets, की, उम्र के 3-4 सप्ताह में शुरू, घुसपैठ की विशेषता है. गैर विनाशकारी पेरी insulitis के इस चरण में 3 साल की उम्र के 4-6 महीनों से प्रकट मधुमेह, जिसके परिणामस्वरूप में इंसुलिन के उत्पादन अग्नाशय β कोशिकाओं की एक धीमी, प्रगतिशील विनाश की ओर जाता है. 4,5 splenocytes, सीडी 4 + मधुमेह इशारा चूहों से 6,7 या सीडी 8 + 8,9 टी कोशिकाओं का स्थानांतरण आइलेट प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं T1D रोगजनन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, यह दर्शाता है immunocompromised इशारा चूहों में मधुमेह मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है. प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है, मधुमेह इन अध्ययनों में कई हफ्तों से अधिक, धीरे प्राप्तकर्ता चूहों में विकसित किया है. इसी प्रकार, विभिन्न टी सेल क्लोन, समय लेने वाली और महंगा द्वारा निकाली गईमधुमेहजनक टी कोशिकाओं के संवर्धन, कई हफ्तों प्राप्तकर्ता चूहों 7,10 में स्थानांतरण के बाद मधुमेह मध्यस्थता करने के लिए सूचित किया गया है. सीडी 4 या सीडी 8 प्रतिबंधित मधुमेहजनक टी सेल क्लोन, कई प्रयोगशालाओं से व्युत्पन्न TCRs व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता के साथ बाद में इस तरह के चूहों से प्लीहा टी कोशिकाओं 11-13 प्राप्तकर्ताओं को मधुमेह स्थानांतरण करने में सक्षम थे कि पता चला है. विशेष रूप से, BDC2.5 इशारा चूहों Chromogranin ए, अग्नाशय बीटा कोशिकाओं 14-16 में एक प्रोटीन के लिए विशिष्ट है जो BDC2.5 TCR, के लिए ट्रांसजेनिक हैं. इन विट्रो सक्रिय या क्षमता 11,17-19 अलग नवजात या immunodeficient इशारा चूहों को मधुमेह का तबादला खुलकर मधुमेह या prediabetic BDC2.5 चूहों से संयुक्त राष्ट्र के सक्रिय पूरे या fractionated तिल्ली कोशिकाओं का स्थानांतरण.
हम शुद्ध ट्रांसजेनिक सीडी 4 का उपयोग एक साधारण विधि + उच्च दक्षता और consiste पर प्राप्तकर्ता चूहों में T1D प्रेरित करने के लिए पूर्व मधुमेह BDC2.5 चूहों से टी कोशिकाओं का वर्णनncy. भोली, आइलेट प्रतिजन विशेष सीडी 4 + टी कोशिकाओं की संख्या में सीडी 4 के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) ट्रांसजेनिक TCR Vβ4 श्रृंखला व्यक्त + CD62L + टी कोशिकाओं द्वारा इन चूहों से अलग कर रहे हैं. शुद्ध ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं को फिर कार्यात्मक टी और बी कोशिकाओं की कमी है और insulitis और मधुमेह से मुक्त 20 हैं जो NOD.SCID चूहों में सक्रियण के बिना स्थानांतरित कर रहे हैं. प्राप्तकर्ता चूहों टी सेल स्थानांतरण के बाद दो सप्ताह के भीतर तेजी से विकसित होता है, जो T1D, यह दर्शाता है मूत्र ग्लूकोज का ऊंचा सांद्रता के लिए निगरानी कर रहे हैं.
Heterogenous specificities के मधुमेहजनक टी कोशिकाओं स्थानांतरण, हमारे प्रोटोकॉल FACS हल सीडी 4 + लगभग विशेष मधुमेहजनक BDC2.5 TCR व्यक्त कि टी कोशिकाओं का उपयोग करता है कि अन्य विधियों के विपरीत. उनकी एकरूपता के कारण, हस्तांतरित टी कोशिकाओं (~ 1x10 6 कोशिकाओं / माउस) की ही छोटी संख्या 100% घटना में 2 सप्ताह के भीतर तेजी से T1D विकास के लिए आवश्यक हैं. हमारे प्रोटोकॉल का एक अन्य लाभ यह है कि irradiatio हैप्राप्तकर्ता चूहों के n यह कुछ अन्य तरीकों के लिए है के रूप में आवश्यक नहीं है. इस पद्धति का एक संभावित सीमा है कि यह दोनों CD4 और CD8 टी सेल सबसेट या विशेष रूप से मधुमेह में CD8 टी कोशिकाओं के योगदान की जांच की अनुमति नहीं देता है.
वर्णित प्रोटोकॉल लक्ष्य अंग को आइलेट प्रतिजन विशेष गु कोशिकाओं के घर वापस आना में हस्तक्षेप करने के लिए भोले, monospecific सीडी 4 + टी कोशिकाओं, साथ ही चिकित्सीय रणनीतियों द्वारा मध्यस्थता तेजी T1D विकास, अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. प्लीहा और BDC2.5 चूहे के लिम्फ नोड्स से टी कोशिकाओं के अलगाव
- मधुमेहजनक सीडी 4 + टी कोशिकाओं के दाताओं के रूप में 6 सप्ताह पुरानी पूर्व मधुमेह महिला BDC2.5 चूहों का प्रयोग करें. मूत्र ग्लूकोज माप (देखें नीचे) द्वारा निर्धारित चूहे मधुमेह से मुक्त होना चाहिए.
- सीओ 2 asphyxiation का उपयोग कर प्रत्येक माउस euthanize और बाँझ शर्तों के तहत तिल्ली, कक्षा और बाहु लिम्फ नोड्स हटा दें. तिल्ली निकालने के लिए, 70% इथेनॉल के साथ फर सोख, तो कटौती और त्वचा वापस लेना. तिल्ली माउस के बाईं ओर एक गहरे लाल रंग के अंग के रूप में देखा जा सकेगा. छोटे कैंची का उपयोग पेरिटोनियम में एक 1 इंच चीरा और धीरे छोटी चिमटी की एक जोड़ी के साथ केंद्र में तिल्ली समझ. ध्यान से संयोजी ऊतक और संलग्न वसा जितना संभव ट्रिम और तिल्ली हटा दें.
- बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर Dulbecco's-संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में spleens और लिम्फ नोड्स लीजिए.
- वें का उपयोग करके किसी एकल कक्ष निलंबन तैयारधीरे 70 माइक्रोन सेल strainers (झरनी प्रति एक प्लीहा और झरनी प्रति 4-6 लिम्फ नोड्स) ही 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में के माध्यम से lymphoid अंगों प्रेस करने के लिए एक बाँझ 10 मिलीलीटर सिरिंज सवार की ई अंत.
प्रक्रिया के दौरान, झरनी से कोशिकाओं की वसूली को अधिकतम करने के लिए 1 मिलीलीटर DMEM कई बार साथ प्रत्येक झरनी कुल्ला.
- आरटी पर 7 मिनट के लिए 300-400 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से एकत्र कोशिकाओं स्थानांतरण.
- लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागने, 5 मिलीलीटर अमोनियम क्लोराइड, पोटेशियम (एसीके) बफर (7.2 पीएच) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित, और 5 मिनट के लिए आरटी पर एसीके सेल निलंबन सेते हैं.
- एसीके सेल निलंबन को DMEM के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ऊपर के रूप में ट्यूब अपकेंद्रित्र. 10 मिलीलीटर DMEM में एक बार सेल गोली धो लें.
2. मधुमेहजनक सीडी 4 की प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी + BDC2.5 चूहे से टी कोशिकाओं
- 5 मिलीलीटर FACS के दशक में पुनः निलंबित कोशिकाओंबफर taining और trypan नीले डाई बहिष्कार से व्यवहार्य कोशिकाओं (एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप और एक hemocytometer का उपयोग) की संख्या गिनती.
- FACS बफर का प्रयोग, 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं / एमएल सेल निलंबन मात्रा समायोजित करें. ~ 1 निकालें एक्स 10 धुंधला नियंत्रण प्रति 6 कोशिकाओं (1 कोई दाग, 3 एकल दाग). गैर सक्रिय ट्रांसजेनिक सीडी 4 + विरोधी सीडी 4 के साथ टी कोशिकाओं (एपीसी), विरोधी TCR Vβ4 (FITC) और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में विरोधी CD62L (पीई) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) के लिए नमूना दाग. अंधेरे में 4 में 20-30 मिनट के लिए निर्माता ने सुझाव दिया मैब सांद्रता ° सी का उपयोग सेल धुंधला प्रदर्शन करना.
- > 3X धुंधला प्रतिक्रिया मात्रा में FACS बफर के साथ नमूना और एकल दाग नियंत्रण धो लें. (1-2 x 10 7 कोशिकाओं / नमूना छँटाई के लिए मिलीग्राम और 300 μl एकल दाग नियंत्रण के लिए) और बर्फ पर दुकान अगले जब तक 300-400 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और FACS बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कदम.
- एक 35 माइक्रोन सेल के माध्यम से सेल नमूना दर्राझरनी टोपी ट्यूब सेल clumps को हटाने के लिए. सीडी 4 के लिए नमूने के आधार पर क्रमबद्ध + TCR Vβ4 + CD62L + एक प्रशिक्षित ऑपरेटर के साथ एक सेल सॉर्टर पर कोशिकाओं. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 3 मिलीलीटर DMEM में हल कोशिकाओं लीजिए. 2 एक्स 10 4 कुल घटनाओं / सेकंड के एक प्रकार के दर पर 1.5 एक्स 10 8 कोशिकाओं (3 दाता चूहों से प्राप्त कोशिकाओं की अनुमानित संख्या) सॉर्ट करने के लिए, सेटअप सहित 2.5-3 घंटा, अनुमति दें. अपेक्षा ~ 2.5 एक्स 10 6 गैर सक्रिय ट्रांसजेनिक सीडी 4 + सेल छँटाई के बाद माउस प्रति टी कोशिकाओं.
- प्रकार के अंत में हल कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या रिकार्ड और 300-400 x जी पर 7 मिनट के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फिर निलंबित कोशिकाओं (2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) में बाँझ फॉस्फेट बफर दत्तक टी सेल हस्तांतरण के लिए खारा (पीबीएस) (2 मिलीग्राम + / सीए 2 + मुक्त).
3. BDC2.5 चूहे से मधुमेहजनक सीडी 4 की दत्तक स्थानांतरण + टी कोशिकाओं
- फिर से निलंबित FACS के शुद्ध सीडी 4 धीरे, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 18-1 आधा गेज सुई का प्रयोग +1 मिलीलीटर सिरिंज टी कोशिकाओं और लोड. इंजेक्शन के लिए तैयार करने में, 18-1 की जगह साढ़े गेज सुई एक 27 के साथ आधा गेज सुई.
- वे व्यवहार संवारने एक्ज़िबिट जब तक एक हीटिंग दीपक को 6-8 सप्ताह पुराने महिला NOD.SCID प्राप्तकर्ता चूहों का खुलासा.
- एक restrainer में प्राप्तकर्ता चूहों को नियंत्रित और इंजेक्शन स्थल कीटाणुरहित करने के लिए 70% (v / v) इथेनॉल के साथ उनकी पूँछ पोंछे.
- पार्श्व पूंछ नसों में से किसी में 1-2 एक्स 10 6 FACS हल कोशिकाओं / माउस (ऊपर में 500 μl पीबीएस) इंजेक्षन.
सवार मजबूर मत करो. सुई नस में उचित रूप से स्थित है, तो इंजेक्शन लगभग कोई प्रतिरोध के साथ जगह ले जाएगा.
4. Hyperglycemia के लिए प्राप्तकर्ता चूहे निगरानी और T1D
- टी सेल स्थानांतरण के बाद पांच दिन की शुरुआत, NOD.SCID प्राप्तकर्ता चूहों निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक स्ट्रिप्स (बायर Diastix) का उपयोग कर बुलंद मूत्र ग्लूकोज के लिए दैनिक निगरानी कर रहे हैं. लगातार दो urin साथ चूहेई ग्लूकोज रीडिंग> 250 मिलीग्राम / डेसीलीटर मधुमेह माना जाता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हमारे परिणाम बताते हैं ऐसी अग्नाशय के लिम्फ नोड्स के रूप में माध्यमिक lymphoid अंगों को घर के लिए टी कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है जो CD62L, व्यक्त ट्रांसजेनिक BDC2.5 कोशिकाओं के अलगाव दिखा. हमारा निष्कर्ष आगे तेजी से हस्तांतरण और कुशलता NOD.SCID प्राप्तकर्ता चूहों को T1D इस monospecific टी सेल की आबादी की प्रबल क्षमता प्रदर्शित करता है.
मधुमेहजनक सीडी 4 + BDC2.5 चूहों से टी कोशिकाओं के अलगाव चित्रा 2 में दिखाया गया है. जमा प्लीहा और लिम्फ नोड्स से लगभग 5 x 10 7 कोशिकाओं सेल छँटाई पहले दाता माउस प्रति प्राप्त किया गया. प्रवाह cytometric तरह के बाद, ~ 2.5 एक्स 10 6 अनुभवहीन ट्रांसजेनिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं (सीडी 4 + TCR Vβ4 + CD62L) संकेत gating रणनीति का उपयोग करके प्रत्येक BDC2.5 दाता माउस से प्राप्त किया गया.
सीडी 4 की कम संख्या की उम्मीद, दत्तक हस्तांतरण के रूप में + TCR Vβ4 + CD62L + कोशिकाओं (~ 1 6 कोशिकाओं / माउस एक्स 10) BDC2.5 दाता चूहों से सभी NOD.SCID पुनः में T1D प्रेरित सुबह 11 से cipients (100% घटना), के रूप में मूत्र ग्लूकोज का ऊंचा स्तर (चित्रा 3) के द्वारा निर्धारित की. इसकी तुलना में, विषम CD3 के हस्तांतरण + BDC2.5 टी कोशिकाओं 3 सप्ताह 21 से 80% NOD.SCID प्राप्तकर्ताओं में T1D प्रेरित करने के लिए 3-5 गुना अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता है.
इन आंकड़ों से अधिक तेजी से और कुशलता से T1D प्रेरित NOD.SCID चूहों में FACS-शुद्ध BDC2.5 ट्रांसजेनिक सीडी 4 + CD62L + टी कोशिकाओं की कम संख्या की कि दत्तक हस्तांतरण प्रदर्शित करता है.
चित्रा 1. प्रयोगात्मक घटनाओं के अनुक्रम. प्लीहा और लिम्फ नोड्स BDC2.5 चूहों से एकत्र किए गए थे. अनुभवहीन ट्रांसजेनिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं (सीडी 4 + TCR Vβ4 + CD62L) FACS द्वारा अलग किए गए. टी कोशिकाओं पीबीएस में फिर से निलंबित कर दिया और बाद में T1D का संकेत ऊंचा मूत्र ग्लूकोज के लिए निगरानी की गई जो NOD.SCID प्राप्तकर्ताओं में नसों में इंजेक्शन थे.
चित्रा 2. प्रकार CD4 के लिए gating रणनीति + TCR Vβ4 + CD62L + FACS द्वारा BDC2.5 चूहों से प्लीहा और लिम्फ नोड व्युत्पन्न कोशिकाओं. जमा spleens और लिम्फ नोड्स की एक एकल कक्ष निलंबन, fluorescently लेबल विरोधी सीडी 4 (एपीसी) के साथ दाग था विरोधी -TCR Vβ4 (FITC), और विरोधी CD62L (पीई) मैब. बाईं तरफ डॉट साजिश सीडी 4 से पता चलता है + TCR Vβ4 फाटक सही डॉट साजिश में दिखाया CD62L + कोशिकाओं, के लिए इस्तेमाल किया गया था कि + कोशिकाओं की आबादी. बॉक्सिंग की कोशिकाओं gated सेल आबादी के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 3. मधुमेहजनक सीडी 4 + टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण. FACS पृथक सीडी 4 + TCR Vβ4 + CD62L + BDC2.5 चूहों से कोशिकाओं नसों NOD.SCID प्राप्तकर्ता चूहों (एन = 5) में (1.3 x 10 6 कोशिकाओं / माउस) इंजेक्शन थे. चूहे werई प्राप्तकर्ताओं में मूत्र ग्लूकोज सांद्रता को मापने के द्वारा T1D के लिए नजर रखी. > 250 मिलीग्राम / डेसीलीटर से लगातार दो रीडिंग के साथ चूहे मधुमेह पर विचार किया गया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T1D मधुमेह इशारा चूहों या मधुमेहजनक टी सेल क्लोन से व्युत्पन्न TCRs के लिए ट्रांसजेनिक चूहों से पूरे तिल्ली कोशिकाओं या टी सेल सबसेट के दत्तक हस्तांतरण द्वारा क्षमता अलग प्राप्तकर्ता चूहों में प्रेरित किया जा सकता है. हम साथ साथ NOD.SCID चूहों में FACS-शुद्ध CD62L + BDC2.5 ट्रांसजेनिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं को स्थानांतरित करके 100% घटनाओं में दो सप्ताह के भीतर प्राप्तकर्ता चूहों में T1D प्रेरित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की रिपोर्ट.
BDC2.5 टी सेल हस्तांतरण मॉडल की विशिष्ट लाभ सहज मधुमेह के लिए महीने के लिए और ऊपर मधुमेहजनक टी सेल सबसेट या टी सेल क्लोन द्वारा मधुमेह के हस्तांतरण के लिए कई सप्ताह की तुलना में T1D की बहुत ही कम प्रेरण समय शामिल यहाँ वर्णित है. इसके अलावा, उनकी एकरूपता के कारण, BDC2.5 ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं को शुद्ध ही कम संख्या में उच्च दक्षता और स्थिरता के साथ T1D स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक हैं. पूर्व टीआरए के लिए ट्रांसजेनिक BDC2.5 टी कोशिकाओं की इन विट्रो सक्रियण में कुछ अन्य टी सेल हस्तांतरण के तरीकों के विपरीतnsfer हमारे प्रोटोकॉल में आवश्यक नहीं है. हमारे monospecific टी सेल हस्तांतरण विधि का एक अन्य लाभ यह है कि लक्ष्य अंग को आइलेट प्रतिजन विशेष टी सेल के घर वापस आना में हस्तक्षेप करने के लिए कि उपन्यास चिकित्सकीय रणनीति है अधिक चुनिंदा अन्य प्रोटोकॉल के साथ तुलना की जांच की जा सकती है कि heterogenous टी सेल आबादी के साथ स्थानांतरण मधुमेह.
हमारी पद्धति का एक संभावित सीमा यह monospecific, मधुमेहजनक सीडी 4 + टी कोशिकाओं मधुमेह स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि दोनों सीडी 4 + और T1D रोगजनन में सीडी 8 + टी सेल सबसेट के योगदान का निर्धारण करने के लिए अनुकूल नहीं है.
एक FACS साधन के अभाव में, BDC2.5 ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं CD4 के द्वारा पीछा पीई लेबल विरोधी TCR Vβ4 मैब और विरोधी पीई चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर स्तंभ शुद्धि से अलग किया जा सकता है + CD62L + चुंबकीय मोती (Miltenyi).
यह FACS-शुद्ध है, साथ ही टी कोशिकाओं स्तंभ शुद्ध ध्यान दिया जाना चाहिए, सीडी 4 की एक छोटी सी आबादी शामिल होंगे + टी कोशिकाओं वेंपर अंतर्जात TCR जीन की अधूरी allelic बहिष्कार 15 के कारण ट्रांसजेनिक TCR व्यक्त नहीं करते. शुद्ध टी सेल अंश भी प्राप्तकर्ताओं में T1D विकास को दबा सकते हैं कि सीडी 4 + CD25 + Treg कोशिकाओं शामिल हो सकते हैं. दोनों टी सेल आबादी उम्र के साथ BDC2.5 चूहों में वृद्धि करने के लिए सूचित किया गया है के बाद से, हम 6 सप्ताह 22,23 से अधिक पुराने नहीं हैं कि BDC2.5 चूहों का उपयोग करना चाहिये. सीडी 4 + CD25 + Treg कोशिकाओं को वैकल्पिक रूप से सीडी 4 के साथ FACS छँटाई या जुदाई से BDC2.5 टी कोशिकाओं से बाहर रखा जा सकता है + CD25 पुराने BDC2.5 चूहों में + चुंबकीय मोती (Miltenyi).
वैकल्पिक रूप से, या मूत्र ग्लूकोज माप द्वारा T1D निगरानी के अलावा, रक्त शर्करा का स्तर एक हाथ में ग्लूकोमीटर का उपयोग कर प्राप्तकर्ता चूहों में अधिक सटीकता से निर्धारित किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम BDC2.5 दाता और NOD.SCID प्राप्तकर्ता चूहों की उम्र में शामिल हैं. युवा BDC2.5 चूहों (6 सप्ताह) का उपयोग करना है कि वे मधुमेह से मुक्त हैं, यह सुनिश्चित करें कि और कहा कि करेंगे एन दोनों की आवृत्तिdogenous गैर ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं और Treg कोशिकाओं को कम कर रहे हैं, जैसा कि ऊपर बताया. यह इस तनाव उम्र 24 से 20 सप्ताह के बाद स्वयं को प्रकट और दत्तक टी सेल स्थानांतरण निम्नलिखित T1D विकास उलझाना सकता है कि thymomas विकसित करने की संभावना है क्योंकि प्राप्तकर्ता चूहों के रूप में युवा (<12 सप्ताह) NOD.SCID चूहों का उपयोग करने के लिए भी महत्वपूर्ण है.
वर्णित विधि का भविष्य अनुप्रयोगों सीडी 4 में जांच में शामिल टी T1D रोगजनन और मानव में संभव नहीं है, जो रोग प्रेरण, में चुनिंदा हस्तक्षेप करने के लिए उपन्यास रणनीतियों की सेल की मध्यस्थता तंत्र.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
सभी चूहों पेन स्टेट संस्थागत पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार और उपयोग समिति में चिकित्सा विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) सुविधा की पेन स्टेट कॉलेज में रखे थे.
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम डीआरएस धन्यवाद. सहायक टिप्पणियों के लिए रॉबर्ट BONNEAU और नील क्रिस्टेंसेन.
इस काम के चिकित्सा धन के पेनसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
