細胞追跡のためのin vivoでの¹⁹ F MRI における

Summary

私たちは、ex vivoで標識された細胞とマウスモデルで、MRIを用いたin vivo細胞追跡のための一般的なプロトコルを記述します。細胞標識、画像取得処理および定量のための標準的なプロトコルが含まれる。

Abstract

インビボにおいて^、19 F MRIは、電離放射線を使用することなく、定量的な細胞追跡を可能にする。それは、ヒトに適用することができる非侵襲的技術である。ここでは、細胞標識、撮像、画像処理のための一般的なプロトコルを記載している。ここで我々は、マウス免疫細胞を追跡するための代表的なマウスモデルに焦点を当てるが、技術は、様々な細胞型および動物モデルにも適用可能である。これらはすべてのモデルに関連するように細胞標識のための最も重要な問題は、記述されている。詳細は、MRIシステムおよび個々の設定によって異なりますが、同様に、主要な撮像パラメータは、一覧表示されます。最後に、我々は、定量化のための画像処理プロトコルを含む。このための変奏曲、プロトコルの他の部分は、ディスカッション·セクションで評価されます。ここで説明する詳細な手順に基づいて、ユーザは、それぞれの特定の細胞型、細胞標識、動物モデル、及び画像機構のためのプロトコルを適合させる必要がある。尚、Protocolはまた、長い臨床の制約が満たされるように、ヒトの使用に適合させることができる。

Introduction

生体内細胞追跡中の細胞治療法¹の最適化とモニタリングのために不可欠である。 、その非侵襲的性質のために、イメージングは、 生体内で細胞をモニターするための優れた機会を提供しています。磁気共鳴イメージング（MRI）は、電離放射線とは無関係であり、優れた結像解像度および真性軟組織のコントラストを可能にする。 MRIベースの細胞追跡はすでに、黒色腫患者²における樹状細胞に従うことが臨床的に使用されている。従来の臨床MRIは、組織におけるモバイル水中に存在する^、1 H核上で行われる。それは^{、13 C、19} F及び²³ Na等の他の活性核種、MRI上を行うことも可能である。それは¹ Hの後に最高の感度を提供していますしかし、唯一の¹⁹ F MRIは、 生体内の細胞の追跡に正常に適用されています組織におけるMRI検出可能な内因性の¹⁹ Fが存在しないことは、高い信号の選択が可能に外因性¹⁹ F造影剤の検出および画像データから直接フッ素濃度の定量化を可能にする。 ¹⁹ F MRIの詳細については^、3-5を参照してください。 ¹⁹ F MRIとの重要な問題は、いくつかのラベルは、マルチモーダル剤⁶傾向で、開発されてきたが、適切な¹⁹ F標識細胞を開発し、最適化する必要性である。

我々はここで説明するプロトコルは、生体内の定量的¹⁹ F MRIベースの細胞追跡^10,11説明した第1の記事など、当社グループの^7-9による研究に基づいています。 ¹⁹ F MRIを用いて細胞追跡の一般的手順を図1に要約されている。我々は、カスタムメイドのパーフルオロカーボン造影剤^8を用いて、樹状細胞（DC）の標識化および画像化のための一般的なプロトコルを記載している。撮像プロトコルは、異なる細胞タイプ、ラベル、動物モデルに一般的に適用可能である。ザ·ここで説明する細胞型および動物モデルは、単なる一例として解釈されるべきであり、従って、我々は、細胞の単離および表示に関する詳細を提供するのではなく、撮影プロトコルに焦点を当てていない。修飾は、各ラベル、細胞型、動物モデル、及び画像機構のために必要となり、これらは文献に見出すことができ、または研究者によって最適化される必要があり得る。いくつかの一般的な変更は、議論に含まれています。

Protocol

注意：動物に関わるすべての実験および手順は、関連する倫​​理指針に従って実施し、標準的な動物のケアと人間的な要求事項に適合している必要があります。

1。細胞標識（同時インキュベーションと標準プロトコル）

1. （2ミリリットル培地中）4 mg/10 ⁶細胞の濃度で未成熟DCへの¹⁹ Fラベル^8を追加します。混合する優しく旋回。
2. DCを成熟、収穫前に3日間のラベルを持つ細胞をインキュベートします。
3. DCを収集し、PBSで洗浄、少なくとも3倍で過剰のラベルを削除します。細胞を数える。
4. 注射またはさらなる試験のために少量のPBSで再懸濁する。

注：このプロトコルは、これらの具体的なDCとラベルに関連する。手順は、他の刊行物⁸に最適化され、ここに含まれていたこのプロトコルの焦点は、撮像上にあるため、画像に試料を調製するための唯一のステップである。 Hリファレンス、特定の細胞型の単離、文化や標識のためのプロトコルは、いずれの文献に見られるか、研究者によって最適化する必要があります。文献で ​​使用されてきた他のすべての¹⁹ F標識の概要は他の箇所⁶に提示されている。

2。 ¹⁹ F NMRを用いて^、19 F /細胞の決定

1. NMR管中で標識された細胞の既知の数（通常は以上0.5×10 ^6、または十分な信号が得番号）を配置します。
2. 5％のトリフルオロ酢酸（TFA）の10を添加する。 TFAの共振周波数はラベルと重複する予定は適していない場合には、好ましくは単一の¹⁹ F共鳴して、代わりの水溶性化合物を使用しています。
3. NMR分光計でサンプルを置き^、19 Fスペクトルを得る。帯域幅は、TFA（参考）とエージェントの両方のために十分であることを確認してください。

注：TRは、Fのために十分な長さでなければなりませんULL参照の緩和とサンプルが回転（チューブの中で最長のT ₁の成分の約5倍のT ₁緩和時間を、通常のTR〜5-8秒）。いくつかの分光器は、周波数ロック信号用にD ₂ Oを必要とする。標準の¹⁹ Fスペクトルは十分です。標識の細胞取り込みが悪い場合や、細胞数が低い場合広範平均以上が細胞数が必要となる。修正が部分的な励起を考慮して作られていない限り、スペクトルは、参照、関連するラベルのピークの間の中心にする必要があります。

4. 基準及びサンプル（このサンプルのメインピーク）のピーク下の相対面積を計算し、サンプル中の¹⁹ Fの/細胞の平均数を計算します。

注意：プロセス全体を繰り返し、統計的有意性に到達するのに十分広く、平均化されなければならない。これはまた、MRIスキャナに直接分光法を用いて行うことができる。 However、この手順は多数のセルではなくセル間のばらつきのための唯一の平均¹⁹ F負荷を明らかにすることに注意してください。細胞取り込みの均一性をチェックすると^、19 F剤における蛍光成分の存在を必要とするので、その細胞取り込みを顕微鏡を用いて、またはフローサイトメトリー分析することができる。

3。細胞注入 - 実験計画に関する考慮事項

による細胞追跡のための¹⁹ F MRIの比較的乏しい感度、細胞が大量に局在化するであろう動物モデルは、 インビボ画像化に成功するために必要である。典型的な感度の値は、10 ¹¹ -10 ¹³フッ素原子の範囲内のセルの負荷で、1,000〜100,000 cells/voxel/1の時間からスキャン時間^6の範囲である。

これは麻酔薬の選択に影響などの撮像セッションの数と頻度は、慎重に、計画されなければならない。イソフルランはsuitablないかもしれないことに注意してください¹⁹ F MRIの電子イソフルランの¹⁹ F共鳴周波数が使用されるラベル化合物のそれに近い場合。撮像セッションは有意な蓄積を防止するのに十分に短い場合にイソフルランは依然として適切であり得る。いくつかの代替的な麻酔薬は、文献^10,11に使用されている、例えば、撮像プロトコルに含まれている。麻酔薬は、異なるマウス系統および疾患モデル用に最適化する必要があるかもしれません。

4。外部¹⁹ Fリファレンス·デザイン

1. 定量の¹²のために¹⁹ Fシグナルの既 ​​知量を含む外部参照を使用します。被検者から期待されるものとほぼ同等であることが、基準の信号強度を選択します。

注：参照化合物は、緩和パラメータと一致するように、セルのラベルと同じであれば一般的には、最も単純である。空間的局在せず、分光配列または配列が使用される場合、交流ompound異なる化学シフトを有することが必要であり得る。

2. 関心領域（ROI）に依存して、必要に応じて参照の配置、大きさや形状を変更します。注意：一般的には、参考のために均一な断面を有する管を使用するのが最も簡単です。

5。イメージングとマウスの準備

1. 10 mg / mlのケタミンの保存溶液および2 mg / mlのキシラジンを得るために、生理食塩水で市販されているケタミンとキシラジン1時10 V / Vに希釈する。
2. マウスが画像化される前に、ボアが暖かくなります確保するためのスキャナ（通常は温風）に暖房システムの電源をオンにします。
3. 100 mg / kgのケタミンを注射し、10 mg / kgのキシラジンの腹腔内麻酔を開始すること。注：これらの用量はCD1（ICR）とNU-FOXN1の^NU 8週齢の雄マウスのためにテストされています。他の株は、別の実験で最適化する必要があり、わずかに異なる投与量を、必要な場合があります。この用量は、のために麻酔したマウスを維持します45分の試合。注意：動物が足のピンチにも反応を示さない場合は、麻酔の深さは、通常は十分である。
4. 麻酔したら、動物クレードルに動物を配置し、MRIの中に運動を防止するために、固定化。必要に応じて、次の動物への外部参照を配置します。リファレンスとROI（注入された細胞の予想される場所）の両方がコイルの中心にする必要があります。動物は、スキャン中に、生理学的モニタリングのために、温度、呼吸のコントロールに接続する必要があります。
5. 長いイメージングセッション中に乾燥を防ぐために無菌眼軟膏をマウスの目をカバーしています。
6. 撮影時間が40分を超えた場合、動物が目を覚ますことが前に、追加のケタミン/キシラジンの注入のために追加のカテーテルを準備します。ケタミンおよびキシラジンの作業溶液と位置2の別々の皮下のカテーテル。マウスを最初の40分後にケタミンの追加の2.5mgの20分毎に与えるために、このカテーテルを使用する。必要であれば、さらに100分間最初の注射の後、カテーテルを介して追加の0.5mgのキシラジンの注射によって麻酔を延長させる。すべての場合において、実験時間は、おそらく、端末麻酔下で除いて、3時間を超えてはならない。
7. マウスは、最初の注射の直後に加温し、37℃の体温に維持されることを確認する。このプロトコルでは、<80％の血液酸素は大気の空気呼吸下で検出した。下降血液酸素化の副作用を防止するために、100％酸素（0.3 L /分）を使用する。体温、呼吸、全実験を通して動物の完全な回復まで制御する必要があります。ケタミン/キシラジンの下で自発呼吸率は（200-250/min）非常に高いことに注意してください。呼吸パターンではなく、呼吸数のばらつきは、より高い用量が麻酔の適切な状態を維持するために必要であることを示すことができる。マウスがAFTE 20〜30分以内に自然呼び起こしますR麻酔薬の最終投与。

注：細胞追跡のためには、複数回同じ動物像する必要がある。その場合、撮像セッションは、同研究所のシステムおよび動物使用のガイドラインから、麻酔のクリアランスのために必要な時間を考慮してスケジュールする必要があります。

6。イメージング

¹ Hの調整とイメージング

1. スキャナ内の位置動物ROIが異なるスライスの向き（ローカライザー）と低解像度の解剖学的スキャンを使用してアイソセンターにあるように。
2. 例えばコイルの内側にボリューム全体のグローバルシム^1H、上の正規のシミングプロトコルを使用してください。
3. ベンダーが提供する調整スキャンを使用して、エルミート90°RFパルス1ミリ秒間dB単位で測定された送信電力、すなわち基準パルスゲイン（RG）を、調整します。

注：この調整の意志RFコイルの種類によって異なり^、19 F周波数の信号が直接調整のために、通常は低すぎるので^、19 F MRIのために必須である。その結果、RGの推定値は¹ H信号の測定からなされなければならない。表面コイルを有するRF送信のために^、1 HのRGが均質B ₁プロファイル体積コイルには、関心対象の一部を介してコイルに平行な平面に調整されるべきであり、調整の正確な設定はあまり重要である。

4. ¹ Hおよび¹⁹ F RF送信の両方が同じ（単一または二重同調）RFコイルを用いて行われる場合にのみ^、19 F基準パルスの利得調整は、次のプロトコルが動作する。このような撮像設定では^、1 H上のコイルプロファイル（B ₁の送信フィールド）は、固定RGが適用された¹⁹ Fコイルプロファイルに比例すべきである、 すなわち 、B _1,1、H = C * B _{1,19 F} 小道具とortionality定数C
   1. そのコイルプロファイルは、特定のセットアップのための比例しているを確認するには^、1 Hおよび¹⁹ Fフリップ角マップを取得し、高度（1:1 V水に¹⁹ F、 例えば 、TFAを濃縮し、チューブに、（B ₁の補正で、次のセクションを参照してください） / v）の同一のフィールド·オブ·ビュー（FOVが）、予め（ 図3）を用いて。
   2. 同じRGを使用して、両方のマップはグローバルな要因でを除いて同一であることを確認してください
   3. ¹ H RGが決定されると、この番号をメモ。
5. 実施し、従来の¹ H MRIは¹⁹ f画像のための解剖学的基準としてスキャンします。細胞マーカーの¹⁹ F周波数にチューニングし、システムをし^、19 F、MRスキャンを実施しています。理想的には¹⁹ F MRIスキャンは^、1 H MRIと同じ視野とスライス選択をしている、が、通常より低い解像度を持つでしょう。動物はすぐに想像力として復活することができますNGが完了しました。画像処理は、オフラインで行うことができる。
6. 関係デシベル_19F =デシベル_1Hを通して¹⁹ F RGを決定-20 * _10（C）を記録します。別々の試験管内の実験で¹⁹のFエージェント周波数を推定。

注意： 生体内では 、正確な周波数が異なるシミング条件による実験毎に多少異なる場合があります。化学シフトアーチファクトの正確な周波数を防止するために、可能な場合は、したがって^、19 F MRSにより、各実験において決定されるべきである。非常に低い¹⁹ Fシグナルの典型的なスキャンは、グローバル（パルス取得）分光法（TR = 200ミリ、NEX = 3000、TA = 10分、BW = 50 kHz）のだろう。 NEX、このようにTAは、飛躍的に高い¹⁹ F信号に対して低減することができる。 ¹⁹ F剤周波数をフーリエ変換し、位相補正後のスペクトルから決定される。 NEXは励起の数を指し、TAは取得時間で、BWはある帯域幅。

注：標準撮像パラメータ11.7T/16 CM専用の動物のスキャナ^9は、次^のとおりです。TR /実効エコー時間（TEの_EFF）= 2200 msec/42.8ミリ秒で、ターボスピンエコー（TSE）シーケンスを使用して、解剖学的¹ H画像スキャン、励起あたり8エコー、NEX = 2、10の連続した、厚さ1mmのスライス、FOV = 1.92 X 1.92センチメートル^2、128×128の行列、 すなわち 150×150×1000μmの^3、TA = 1分、BW = 50の解像kHzと線形位相エンコードスキーム^。19 F画像は、同じ配列と一致する幾何学を用いて取得されたが、下の面内解像度と低帯域幅で（NEX = 256、48×48の行列、 すなわち 400×400×1,000の解像度以下^3、TA = 57分、BW = 10 kHzの）。

7. B ₁補正
   信号が依存するため、不均一なB ₁プロファイル、 例えば、表面コイルを有するRFコイルを用いて^、19 Fデータの定量化を妨げること¹⁹ F濃度についてだけでなく、コイルからの距離がオンになっていないだけ。遡及的に正しい¹⁹ Fデータにするために¹ Hチャネル上のB ₁のマップを取得します。これは^、1 Hおよび¹⁹ Fコイルプロファイルは比例係数Cを除いて、同一であることを必要とし、十分な¹ Hバックグラウンド信号は^、19 Fの領域に設けられている¹⁹ Fスピンエコーシーケンスは₁プロファイル^13の1 Hおよび¹⁹ Fの両方に比例Bは単同調のTx / Rx表面コイルのチューニングを使用して、提示された補正のための例プロトコル。
   1. 2フリップ角法¹⁴で¹時間のフリップ角マップを取得する。すぐ下90°の推定フリップ角を用いた勾配エコースキャンと非常に長いTR（> 3回¹ HT _1）を取得する。コイルに近接しています。 RGの第2勾配エコースキャンを獲得=デシベル_1H -6、 すなわち二回フリップ最初のスキャンの角度。
   2. ¹ Hフリップ角を算出する、α、ボクセル第一及び第二の勾配エコースキャンのシグナル強度（SI）を介して、（x、y、z）における：α（x、y、z）は=アルコス（SI _GE、1（ X、Y、Z）/ 2SI _{GE、2（x、y、z）}の^{）14。 19} Fフリップ角は、比例、B ₁プロファイルに（係数1 / Cを除く）と同じです。互恵^15、信号受信時のスピンエコーシーケンス（励起フリップ角α、フリップ角2αリフォーカス）からの¹⁹ Fシグナル強度の減衰のファラデーの原理に従って_受信 （x、y、z）を〜αの（x、y ATTである、z）を。不完全な励起の減衰が_送信 （x、y、z）を^3〜罪（α（x、y、z）の^）16 ATTである。全体の減衰は、ATT = attRx * attTx =α*罪^3（α）/ 90°と書かれています。それは完璧な90°/ 180°励起/再収束フリップ角の場合には1に正規化であることに注意してください。 B _1が補正19 F画像信号強度SI _{19F、19F corrは} SI _{は、corrは} （x、y、z）をSI = _{19F（x、y、z）}は/ attを（x、y、z）を介して計算される。
   3. 、異なる実験からの信号強度を比較する視野で定義された¹⁹ F濃度が基準管を配置し、参照した平均信号SI _{19F、CORRを}正規化するためである。

注：他の¹ HB ₁ /フリップ角のマッピング方法を用いることができ、別の¹⁹ Fパルスシーケンスが_送信、19Fのattの修正を必要とする。 B1訂正方式のいずれかの種類は、細胞定量手順で追加のエラーをご紹介します。正確な細胞定量が大前提である場合、B1均質なプロファイルを有するRFコイルは、プロトコルのこの部分を回避するために使用することができる。

7。画像処理

1. ¹ Hおよび¹⁹ Fオーバーレイ画像を作る
   1. 画像データをエクスポートスキャナからの最終的な¹ Hおよび¹⁹ Fの大きさの画像の。
   2. このようなImageJの（フリーウェア、NIH）などの画像処理プログラムでファイルを開きます。
   3. すべての画像に同じ調整を維持する必要に応じて（トリミング、明るさ、コントラスト）などの画像調整を実施しています。 ¹⁹ Fイメージは、通常、対応する¹ H画像に合わせて、より高い解像度にアップスケールする必要があります。
   4. 偽色で¹⁹のFイメージをレンダリング（画像j内の「イメージ」メニューの下に、別のルックアップテーブルを選択します）してから、信号を局所化するために、対応する¹ H画像にオーバーレイする。
2. ¹⁹のF定量
   1. 関連細胞の可視参照して^、19 F画像（強度画像）を選択します。
   2. このような画像Jのようなプログラムでは、関連細胞、被写体（ノイズ）の外側の基準と領域の上のROIを描きます。
   3. ANALYZEコマンドを使用します。次いで測定（または単にCtrlキー+ M）は、これらの領域内の平均ピクセル強度を計算すること、およびそれらの領域。 S（細胞）細胞上にROI内の平均ピクセル強度を参照してみましょう。体積（=面積×スライス厚）で全信号を計算する乗算する。
   4. 式SNRを使用して、たとえば、SNRを計算する=σ（通常はバックグラウンドの空気中の）任意の化学シフトアーチファクトのないサンプル外のROIにおけるピクセル強度の標準偏差で0.65のx S（細胞）/σ、 ^17。 SNRが5未満であると、ノイズによる信号の補正が必要であり得る他の場所^{11 10}記載のように実施することができる。
   5. そうでない場合には、基準における¹⁹ Fの濃度によって（体積を計算するために）スライス厚によってスライス内の参照領域を乗じて基準にわたってROIにおける信号の責任¹⁹ Fの総量を計算公知であり、均質であると仮定される。
   6. 細胞中の¹⁹ Fの量を計算するための基準を完全に信号によって分割されたセル上のROI内の全信号によって、その値を掛けます。
   7. セクション2で算出した¹⁹ F /セルの値によってその数を割ることによって、細胞の数を計算します。

Representative Results

ここでは、流入領域リンパ節へのホーミング¹⁹ F-標識された細胞の移動を伴うプロトコルのための典型的な結果を示している図2は、基準TFAを用いて10 ⁶の標識細胞の¹⁹ F NMRスペクトルを示す。プロトコル（ 図3）に記載のように撮像セットアップを行った。 in vivoイメージングのために、我々は、マウスの脚の間に配置されたセルに使用したのと同じラベルの密閉されたシリンダーで構成されるリファレンスを使用していました。代表的な処理された画像が図4に示されている。セクション7.2に記載のプロトコルを適用することによって、我々はおよその細胞数を計算した。 1.2×10 ⁶生の¹⁹ Fの大きさの画像に基づいて。

図1。 ¹⁹ F MRIベースの細胞追跡のための重要なステップ。 、in vivoデータを確証する（ステップ5）を行うことができる。図は、許可⁶で再現。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図2。代表的な¹⁹ F NMRスペクトル。スペクトルが得られた¹⁹ Fシグナルを示すこの場合の参照の既知量、TFA、および「サンプル」の標識細胞の既知の数に起因する。これは、MR画像データから生体内定量化のために必要である細胞あたりのフッ素の量を計算するために使用することができる。

図3。水中でのTFAでチューブのフリップ角マップは^、1 Hおよび¹⁹ Fチャネルで取得した。比例定数はセットアップには1.03±0.08と計算された。 FA：フリップ角。

図4。流入領域リンパ節へのホーミング樹状細胞のin vivo ¹ H / ¹⁹ Fイメージ。図は、目に見える¹⁹ F信号を、マウスの代表画像を示し、偽色は、参照（R）および標識された細胞である。マウスの唯一の足がここに画像化した。この例では、注入された標識された細胞は、流入領域リンパ節に移行する。撮像パラメータは、本文中に要約されている。図は、例示のみの目的である。

Discussion

ここで概説したプロトコルは、 生体内 ¹⁹ F MRIの細胞追跡のための一般的な手順を説明します。記載の共インキュベーション法にもかかわらず^、19 F剤で細胞を標識するためのいくつかの異なるプロトコルが存在する。しかしながら、共インキュベーションは、最も頻繁に使用され、さらにトランスフェクション剤⁶の添加などによって最適化することができる。実際の細胞標識プロトコルは、細胞型に依存するであろう。キーのみラベリングステップは、ここプロトコールに記載されている。一般に、標識は、数時間から数日の範囲の選択された時間のために調製し、細胞に添加する。最後に、細胞画像データから定量化が^3に実施される場合は特に、ラベルの任意の過剰を除去するために慎重に洗浄されなければならない。 ¹⁹ F剤は蛍光タグを含む場合、標識の存在は、外部（否かに結合した）細胞を、顕微鏡を用いて検出することができる。標識後、細胞を研究することが必要である非標識細胞（トリパンブルー排除アッセイによる）に関連した実行可能性と機能性、。このようなDCの場合にはT細胞を活性化する能力、細胞固有の機能試験もまた、行われなければならない。いくつかの非¹⁹ F MRIラベルは細胞遊走¹⁸に影響を与えるように最終的に、そのようなテストは、特に高い細胞負荷での¹⁹ Fラベルのために含まれるべきである。

動物モデルのためのプロトコルは、ユーザーのニーズに依存している。しかし、実験を計画する際に¹⁹ F MRIの厳密な感度限界を覚えておくことが重要です。公開された感度値は、10 ¹¹ -10 ^{13 19} Fの範囲内のセルの負荷と、1,000-00,000 cells/voxel/1人事時間⁶までの範囲関心領域における感度と予想ラベル濃度も撮像パラメータに影響を与える。例えば^、19 F画像に使用されるスライス厚がADJすることができる ustedは^、1 H画像と一致するか、または（例えば、全体のリンパ節または単一のスライス内の関心領域のような）より厚い領域をカバーする。典型的には^、19 Fイメージングは、高解像度は、通常、リンパ節などの構造を区別する必要がないので、特に、信号検出を最大にするために低解像度で行われる。信号が十分であれば、薄いスライスの大きい番号を取得し、これらから算出される関心ボリューム上の全信号ことができる。しかし、最適なパラメータを個別アプリケーションごとに導出する必要があります。

私たちは、イソフルランのようなフッ素化吸入ガスを避けケタミン/キシラジンで注射麻酔プロトコルを記述します。他のプロトコルは、文献^10,11に使用されている。しかしながら、全ての場合において、これらのプロトコルはマウス系統、年齢、性別、健康および撮像セッションの長さ及び周波数のために調整する必要がある。

ontent ">いくつかの¹⁹ F MRIイメージングシーケンス^6を参照してレビューのために、細胞追跡のために使用されている。我々の撮像プロトコルは、容易に他の撮像シーケンスを含むように修飾することができるが、ここで説明する定量方法を考慮し、任意の部分容積を取らない効果は、ROIの選択の矛盾、 インビボでの標識の緩和パラメータの変化、または細胞の¹⁹ Fの負荷の変化。これらの問題は、他の場所³に記載されている。要するに、エラーが長手細胞追跡のための許容限度内であることが見出されている^10。これらの初期の作品と比較すると、我々は、さらにB1磁場をマッピングすることで、表面のRFコイルを使用するための画像補正手法を提案する。具体的なRFコイルの設定によっては、それがされている、B1マッピング技術の限界、注意することが重要である例えば、ここにB1を発表し、二重角法の¹ H MRI ¹⁶の文脈でよく研究マップはわずか^90°-180°14の下にフリップ角のペアのための最も正確であり、大きな誤差は他の地域でも導入することができる。それでも、in vitroでの適切な検証の後に、このような遡及的修正は、細胞の定量を向上させることができます。一般的に、我々は、少なくとも最初は、より確立された技術を使用してデータの確証をお勧めします。これは、典型的には大きな誤差を除外助けるために、他のインビボイメージング技術、 例えば光学イメージングと組み合わせて行われる。ほとんどの場合、組織学的評価は、正確に¹⁹ Fラベルの位置を評価し、撮像データとの相関を可能にする必要がある。これは^、19 F剤、蛍光染料の添加を必要とし得る。

¹⁹ F MRIは、まだ臨床細胞追跡に適用されていないが、最終的に、それは人間の使用のためにこのプロトコルを変更することも可能である。必要な主な修飾は、OPTIMの多くを実施することであろうブリダイゼーション予めできるだけセットアップ（被験者がスキャナにある時間の長さを最小にするために）、および臨床比吸収率（SAR）の制限内に維持するために撮像パラメータを調整する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec