Voksende neurale stamceller fra konventionelle og ikke-konventionelle regioner Adult gnaverhjerne

Summary

Neurale stamceller høstet fra den voksne hjerne er stigende udnyttes i ansøgninger fra den grundlæggende forskning af nervesystemet udvikling til at udforske potentielle kliniske applikationer i regenerativ medicin. Dette gør streng kontrol i isolerings-og anvendte dyrkningsbetingelser at dyrke disse celler kritisk at lyde eksperimentelle resultater.

Abstract

Nyligt arbejde viser, at det centrale nervesystem (CNS) regenerering og tumorigenesis indebærer populationer af stamceller (SCS) er hjemmehørende i den voksne hjerne. Men mekanismerne disse normalt hvilende celler anvender til at sikre et velfungerende neurale netværk, samt deres rolle i nyttiggørelse fra skade og afbødning af neurodegenerative processer er lidt forstået. Disse celler er bosat i områder, der er nævnt som "nicher", som giver et bærende miljø involverer modulatoriske signaler fra både vaskulære og immunforsvar. Isoleringen, vedligeholdelse og differentiering af CNS SCs under definerede dyrkningsbetingelser, der udelukker ukendte faktorer, der gør dem tilgængelige for behandling med farmakologiske eller genetiske midler, hvilket giver indsigt i deres in vivo adfærd. Her tilbyder vi detaljerede oplysninger om de metoder til at generere kulturer af CNS SCs fra forskellige regioner af den voksne hjerne og tilgange til at vurdere deres differentiation potentiale i neuroner, astrocytter og oligodendrocytter in vitro. Denne teknik giver en homogen cellepopulation som et monolag kultur, der kan visualiseres for at studere individuelle SCS og deres afkom. Desuden kan den anvendes på forskellige dyremodelsystemer og kliniske prøver, der tidligere har brugt til at forudsige regenerative respons i den beskadigede voksne nervesystem.

Introduction

Den centrale dogme om neurobiologi, fastsættes af de grundlæggende observationer af hjernen cytoarchitecture lavet af Ramón Y. Cajal over et århundrede siden, fastslog, at neurogenese var usandsynligt efter ungdomsårene i betragtning af kompleksiteten af de neurale netværk, der findes i CNS ^1.. På trods af arbejdet i Altman i 1960'erne, og senere Kaplan, som viser, at ³ H-thymidin kunne findes i modne neuroner, der angiver, at der faktisk neuroner blev genereret på forskellige områder af den voksne hjerne, dogmet fortsatte med at holde ^{2, 3.} Beviser fortsat voksede med Nottebohm forskning beskriver de sæsonbestemte ændringer i antallet af neuroner til stede i Songbird hjerner ^4. Det var ikke før 1999, hvor Gould et al. Publiceret arbejde på generation af neuroner i hippocampus stiger med udførelsen af associative indlæringsopgaver i rotter, samt observationer af Kornack og Rakic ​​demonstrationTing fortsatte neurogenese i den voksne makak, at begrebet en mindre stiv, mere plastisk hjerne, blev anerkendt ^{5, 6.}

Jagten på den cellulære kilde til disse de novo genereret neuroner fører til opdagelsen af en diskret population af stamceller (SCS), der er bosat i områder af hjernen kaldet nicher ^7. Den subventricular zone og sub granulære zone af hippocampus anses for at være de to vigtigste neurogene områder ^8,9. Celler isoleret fra disse placeringer vise den klassiske karakteristisk for embryonale eller føtale afledte SCS selvfornyelse og differentiering potentiale. I tilfælde af neurale stamceller (NSC), kan de differentieres til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Desuden er disse SCS farvet positive for føtale NSC markører, såsom den mellemliggende filamentprotein nestin ^10. Nyere arbejde understreger, at SCS ikke kan være begrænset til disse two områder og er faktisk lokaliseret i hele hjernen som en stort set hvilende population af celler tæt forbundet med vaskulaturen ^11.

Observationerne, der SCs mobiliseres i reaktion på skade antyder muligheden for at være i stand til at udnytte disse celler for regenerativ formål at støtte i nyttiggørelse fra neurodegenerative lidelse og slagtilfælde ^{12, 13.} Dette er ikke i modsætning til den rolle, som mesenchymale stamceller (MSC'er) spiller i heling af bindevæv, som findes som perivaskulære celler, der har potentiale til at blive osteoblaster, chondrocyter og fedtceller ^14. Dog kan NSC ikke kan høstes på samme måde som MSC fra knoglemarv ved rutinemæssig aspiration og densitetsgradientcentrifugering teknikker og efterfølgende udnyttes i autologe cellebaserede behandlinger. Som en konsekvens, andre kilder til celler, såsom anvendelsen af ​​føtale NSC eller neuronale prækursorer afledt fra EMBryonic stamceller er blevet grundigt udforsket i dyresygdomme og skade modeller med varierende grader af succes ^15. Induceret pluripotente stamceller teknologier anvender somatiske cellekilder tilbyde en anden potentiel avenue for at producere terapeutisk nyttige cellebaserede behandlingsformer for en bred vifte af applikationer, overvinde den begrænsede tilgængelighed og etiske bekymringer vedrørende brugen af embryonale celler og fostervæv ^16. Imidlertid har klinisk oversættelse af disse fund vist sig at være en vanskelig opgave, som demonstreret i kampene i behandling af forskellige neurologiske tilstande med SC-baserede terapeutiske tilgange ^17,18, samt en snoet vej til myndighedernes godkendelse. Som en alternativ tilgang, kan indførelse af specifikke farmakologiske behandlinger modulere NSC-numre og lette inddrivelsen i modeller af Parkinsons sygdom og slagtilfælde ^19. Uanset strategi kunne være, at forstå, hvordan man effektivt manipulere disse cellerkræver et tilgængeligt in vitro-system.

Kulturer af NSC kan udføres enten som samlede kulturer, også kendt som neurosfærer, eller som et monolag ^8,20. Begge teknikker er blevet udbredt, giver mulighed for etablering af definerede dyrkningsbetingelser, dvs brug af epidermal vækstfaktor (EGF) eller basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) som en mitogen kilde, der leverer til udvidelse af multipotente forstadier. Mens neurosfæreceller kulturer kan være bedre egnet til at studere klonal formering evne af en isoleret celletype, er systemet blevet påvist, at en blandet population af celler under ekspansion ^21. Desuden lukkede struktur neurosfærer vanskeliggør farmakologisk manipulation af cellerne upraktisk, og fortolkning af den indflydelse, disse faktorer kan have kunne forvirres grund mikromiljø etableret i neurosfæren selv. Monolagskulturer, på den anden side, kan væreansat i high throughput skærme af småmolekylebiblioteker, hvilket giver et kraftfuldt værktøj til at udforske signaltransduktionsegenskaberne mekanismer, der regulerer SC vækst og differentiering og åbner mulighed for at opdage nye forbindelser, der specifikt retter denne celle population.

Som følge heraf, kan evnen til på reproducerbar generere kulturer af voksne NSC fra forskellige regioner af interesse i hjernen kan anvendes i et bredt spektrum af forsknings-applikationer, der spænder fra udviklingsmæssige undersøgelser af centralnervesystemet (CNS) til at udforske hidtil ukendte regenerativ medicin tilgange . Protokollen præsenteres her viser, hvordan at dissekere og vurdere differentiering potentiale CNS SCS isoleret fra den voksne gnaver hjernen.

Protocol

Arbejdet klæber til erklæringen fra Helsinski og ARVO Animal erklæring. Dyrene blev brugt til væv indsamling og alle relevante metoder blev fulgt i henhold til vejledningen af ​​dyret facilitet på University of Dresden. Dyrene blev håndteret og husede i henhold til de tyske retningslinjer for brug og pleje af forsøgsdyr, og undersøgelsen blev godkendt af Landesdirektion Dresden. Kontakt din institutionens veterinær politik (IACUC eller andet board) med hensyn til passende dødshjælp metodologi.

Specifik bestand og koncentrationer af reagenser kan findes i reagenset tabeller ledsager denne protokol.

1.. Kultur Dish Forberedelse

1. Frakke retter med en tilstrækkelig volumen på 75 pg / ml poly-L-ornithin (dvs. 2 ml / brønd af en 6-brønds plade) natten over i cellekultur inkubator 2 dage inden den planlagte dissektion dato.
2. Fjern den sidste vask, tilsæt derefter fibronektin (fortyndet 1:250, 4 mg / ml i PBS) til pladen og placere retterne i inkubatoren natten over.
3. Aspirer fibronectin på dagen for dissektion og vaske 2x med PBS. Retur pladerne stadig indeholder den endelige vask med PBS til inkubatoren indtil dissocierede væv er klar til dyrkning. På det tidspunkt fjerne PBS før plettering vævet.
4. Store plader coatet med poly-L-ornithinein inkubatoren i op til 3 uger. Plader overtrukket med fibronectin kan opbevares i op til 1 uge. Fibronectincoating kan gøres på så lidt som 2 timer, hvis presserende. Fibronektin er modtagelige for denaturering, ikke agitere løsningen eller lad tallerkener tørre.

2. Dissektion / Plating

1. Denne protokol gælder for brugen af ​​3 voksne rotter (3-6 måneder).
2. Chill hjernen sektionering blok på is før euthanizing rotten.
3. Placer en 15 ml Falcon rør, der indeholder 5 ml N2 medium tilsat bFGF på is.
4. Aflive rotterne i henhold til din institutions veterinær politik.
5. Fjern hjerne fra kraniet ved at lave et snit ned midterlinjen af ​​hovedet. Brug pincet til at skrælle væk knoglen giver mulighed for hjernen at blive omhyggeligt udvindes.
6. Anbring hjernen i en 10 cm petriskål indeholdende iskold PBS. Dette vil fjerne enhver resterende hår og blod. (Figur 1A)
7. Placer hjerne ind i den kølede sektionering blok. (Figur 1B)
8. Sæt den ene ny ren barberblad ind i blokken, som afbilledet i figur 1C.
9. Indsæt en anden ren barberblad 3 mm caudalt til den første som vist i figur 1D.
10. Løft forsigtigt knivene fra blokken, der tager med dem den del af interesse.
11. Flyde section fra bladet ved at nedsænke det i PBS. (Figur 1E)
12. Høst væv fra området af interesse (i dette eksempel brugte vi den forreste commissure, (anterior) ACA, figur 1F) ved hjælp af # 5 pincet og samle ind i en 15 ml konisk rør indeholdende 1 ml N2 medium indeholdende bFGF.
13. Flyt tuben i en laminar strømning cellekultur hætte, fortsætter den resterende del af protokollen under sterile betingelser.
14. Mekanisk dissociere væv ved hjælp af en 1 ml pipettespids fastgjort til en P1000 pipette. Pipettér op og ned flere gange (ca. 20x med en hastighed på 1 pipettering cyklus per sekund), mens du trykker åbningen af pipettespidsen mod bunden af den koniske rør (figur 1G 1-3). Stop trituration når opløsningen bliver homogen.
15. Lad opløsningen sidde i 2 minutter for at tillade nogen større nondissociated væv at bosætte sig på bunden. (Figur 1G 4)
16. Saml homogenEOUS supernatant og anbringes i en konisk rør indeholdende 8,5 ml N2 medier plus 20 ng / ml bFGF 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2 og 200 nMJAK Inhibitor.
17. Plate dem i 3 brønde i en 6-brønds plade ved hjælp af 3 ml fortyndet celle løsning / godt.
18. Pladen anbringes i en befugtet celle inkubator ved 37 ° C, 5% CO ₂ 5% O _2.

3. Daily Care

1. Udskift mediet på dyrkningsskålene med N2 Medium indeholdende bFGF Ang2, Dll4 og JAK hæmmer 24 timer efter plating.
2. Tilføj en bolus af bFGF, Dll4, Ang2 og JAK-hæmmer på den næste dag.
3. Fortsæt denne vekslende proces medieændringer og faktor tilføjelser for i alt 10-14 dage.

4.. Induktion af differentiering

1. Udbetal bFGF Dll4, Ang2 og JAK-hæmmer holdigt medium og erstatte det med N2 medium, der ikke indeholder nogen yderligere faktorer.
2. Skift medium hver anden dag.
3. Fikseres cellerne efter 10 dage og udføre immunocytokemi.

5.. Immuncytokemisk Detection

1. Aspirer medium og lave celle dyrkningsplader med 2 ml 4% paraformaldehyd i 20 min.
2. Vask 2x med 3 ml PBS i 5 min hver.
3. Aspirer PBS, derefter permeabilisere og blokere cellerne ved tilsætning af 2 ml PBS indeholdende 5% normal donkey serum (NDS) og 0,1% Triton X-100 i 20 min.
4. Forbered det primære antistof mix i PBS indeholdende 5% NDS. Anti-nestin antistof kan anvendes til at identificere SCS, mens TUJ1 (klasse III β-tubulin) kan GFAP og CNPase antistoffer anvendes sammen til en tredobbelt farvning af differentieringsmarkører.
5. Aspirer blokerende opløsning, og der tilsættes 1,5 ml af det primære antistof-blandingen til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 90 minutter.
6. Fjern de primære antistoffer og vaskes 2 gange med 3 ml PBS og 1x med 3 ml PBS indeholdende 5% NDS i 5 minutter hver.
7. Prepare de sekundære antistoffer i PBS indeholdende 5% NDS.
8. Aspirer den sidste vask, og der tilsættes 1,5 ml sekundært antistof til hver brønd. Der inkuberes i mørke i 40 minutter ved stuetemperatur.
9. Fjern det sekundære antistof, og der tilsættes 2 ml af en frisk fremstillet DAPI-farvet (500 ng / ml i PBS). Inkuber i 3 min.
10. Aspirer DAPI opløsning derefter vaskes 3x med 3 ml PBS i 5 minutter hver. Cellerne kan nu visualiseret med et fluorescensmikroskop.

Representative Results

Identifikation af området af interesse, hvorfra man kan høste neurale stamceller er det kritiske første skridt og vil definere mængden af ​​tid, det tager at få en sammenflydende plade af celler. For eksempel SVZ er en klassisk neurogen område, og derfor har en højere relativ andel af neurale stamceller. Dog kan den teknik, der præsenteres her bruges med andre regioner ikke ofte anerkendt som en robust neurogen potentiale i voksenalderen. Ved anvendelsen af ​​denne protokol, brugte vi den forreste commissure (forreste del). Mens nogle af de celler og rester vil udligne ved plettering, vil mediet normalt forbliver uklar som følge af mængden af ​​cellemateriale, der er til stede følgende triturering. Det første middel ændring på 24 timer vil fjerne hovedparten af ​​dette. Visualiseret ved lysmikroskopi, vil der synes at være en stor mængde af cellulært materiale tilbage, sammen med blodkar, selv efter det første medium forandring. I løbet afde næste par dage, vil kolonier af en særskilt prolifererende cellepopulation bliver synlige under mikroskop (figur 2A). Disse er de neurale stamceller der er blevet udvalgt for vækst ved anvendelse af N2-medium indeholdende bFGF, Ang2, Dll4 og JAK-inhibitor. Desuden kan et mere langstrakt spindel-lignende cellepopulation også være til stede (figur 2B og   C). Disse er ikke neurale stamceller (sandsynligvis radial glia baseret på morfologi og farvning), vil de i sidste ende blive overhalet af en hurtigere prolifererende neurale stamceller befolkning. I løbet af en uge til 14 dage, vil cellerne bliver mere tæt, indtil de når konfluens (figur 2D). Disse kulturer farvet positive for en række stamceller markører, herunder Nestin, Hes3 og Sox2. (Figur 2E-H), hvilket giver tillid til, at cellepopulationer, der er blevet udvalgt og udvidet er faktisk neurale stamceller.Yderligere bekræftelse kommer fra evnen til tilbagetrækning FGF fra mediet, hvilket tillader cellerne at differentiere i 10 dage for at generere neuroner, astrocytter og oligodendrocytter (figur 2i).

Figur 1: Isolering af rottehjerne sektioner for høst voksne neurale stamceller. A) Voksen rottehjerne efter vask med PBS. B) Rottehjerne placeret i et afkølet rustfrit stål sektionering blok. C) Omtrentlig placering af de første barberblade i blokken til at producere kronafsnit hjernen. D) Placering af 2 ekstra barberblade ind i sektionering blok. Bemærk, blev tyndere tveægget knive bruges til demonstrations-formål at give mulighed for lettere visualisering af srefleksioner i blokken. E) Koronale hjernen afsnit med områder, der skal høstes. F) Skematisk diagram fra Paxinos hjerneatlas fremhæver subventricular zone som en klassisk neurogen region, og den forreste commissure hvorfra cellerne blev høstet for denne protokol. G) Sekventielle billeder af vævet dissociation proces med en 1 ml pipette spids knyttet til en P1000 mikropipette. Klik her for at se større billede .

Figur 2: Voksen neurale stamceller in vitro. A) Voksen neural stamcelle kultur efter en uge. B) Eksempler på en mere bred spindel morfologi celler (red pile) lejlighedsvis til stede i de kulturer, der ikke er neurale stamceller. C, D) under dyrkningsbetingelser, der er defineret i denne protokol, de neurale stamceller fortrinsvis ekspandere. EH) Udtryk af neurale stamceller markører efter 14 dage i vitro Sox2 (grøn) (E), Hes 3 (rød) (F) og Nestin (violet) (G). I) Differentiering af neurale stamceller i neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Efter tilbagetrækning mitogen blev cellerne lov til at differentiere i 10 dage, derefter immunfarvet for GFAP (grøn), TUJ1 (rød), og CNPase (blå). J) Hes3 immunfarvning i voksen rotte hjerne. Klik her for at se større billede .

Discussion

Mange af de trin, der er afgørende for vellykket isolation, ekspansion og differentiering af neurale stamceller fra den voksne hjerne deles i fællesskab med standard vævskulturteknikker. Målet om at huske på, er, at NSC isoleret fra den voksne hjerne skal bevare så mange af deres in vivo egenskaber som muligt (figur 2J). Ofte en balance mellem nødvendig forsigtighed og passende hastighed skal blive ramt. Care med isolering af hjernen fra kraniet vil gøre identifikationen af ​​regionen af ​​interesse betydeligt lettere. Fjernelse af væv så hurtigt som muligt efter dyr euthanization, og holde hjernen koldt under høst og vask holder det mere stift og i høj grad hjælper med håndtering af væv, når den er placeret i rustfrit stål sektionering mug. Dette minimerer også potentialet til at rippe af vævet under skæreprocessen. Protokollen nyder også godt af at være able for at få cellerne til det punkt plating hurtigt, da dette øger cellernes levedygtighed, når de er placeret i vitro. Korrekt væv vask før sektionering hjælper også mindske risikoen for forurening i kulturerne. Under dissociation processen bør trituration med en 1 ml pipette spids være energisk, men udført på en måde, som ikke at generere overskydende bobler eller skumdannelse af cellesuspensionen som forringer celle overlevelse. Det første middel ændring er også afgørende, da det fjerner de fleste af de nonattached celler og et cellulært debris, at resultaterne fra det væv, dissociation proces, der indeholder faktorer, der er til skade for den oprindelige overlevelse stamceller befolkning. For en forbedret visualisering efter immunofarvning kan frisk isolerede celler udpladet på 25 mm dækglas placeret i bunden af ​​plader med 6 brønde. Koncentrationerne af poly-L-ornithin og fibronektin i overfladebehandling bør øges til 500 mg / ml og 20 μg / ml. Som et alternativ kan flere mindre dækglas (dvs. 12 mm) anbringes i hver brønd. Disse kan derefter behandles til immunfarvning uafhængigt i separate brønde i en plade med 24 brønde, skalering ned mængder farvningsreagenser anvendes til at tage hensyn til de mindre mængder. Dækglassene derefter monteret på objektglas med en standard vandig montering medium.

Definition af tilstedeværelsen af ​​NSC i den voksne hjerne er af stor interesse inden for neurobiologi. Der er to generelle metoder til at identificere en stamcelle. I den ene, kan et sæt af biomarkører baseret på et genekspression profil af stamceller pågældende population bruges til billedet dem ved immunhistokemi. Selv eksperimentelt enkel, giver det ingen funktionelle data, eller til at fastlægge, om cellerne har de grundlæggende egenskaber af stamceller, evnen til at forny sig selv eller differentiere til flere forskellige celletyper. I den anden metode, er cellerne isoleres i either en ren eller heterogen population, placeret i kultur, og der self fornyelse og multipotentielle egenskaber er vurderet ved hjælp af levende celle population. Denne tilgang giver funktionelle data, og kan bruges til utvetydigt bevise "stemness" i disse særlige in vitro eksperimentelle betingelser. Imidlertid har problemer med at opretholde disse celler i kultur hindres denne anden funktionel tilgang. Faktisk har den manglende evne til at vokse NSC fra andre områder af hjernen forlod det indtryk, at der kun er nogle få specialiserede nicher, hvor de bor.

Metoden præsenteres her giver mulighed for dyrkning af NSC fra mange forskellige områder af CNS. Denne teknik er baseret på vores arbejde, belyst en signaltransduktionsvej af stor betydning for at styre antallet af NSC både in vitro og in vivo. De faktorer, der indgår i denne protokol blev udvalgt baseret på omfattende signaltransduktionsmekanismer undersøgelser, Viser, at de fremmer NSC vækst via en fælles transskription faktor Hes3. Vores tidligere undersøgelser viser, at denne kombination gav en endnu større stigning i NSC numre forhold til at bruge dem individuelt. Valget af, der tilsættes farmakologisk støtte til kultur bør betragtes i sammenhæng med biologi blive undersøgt. For eksempel, mens både Ang2 og Dll4 har en positiv indvirkning på NSC vækst, de har modsatrettede virkninger på vaskulaturen dannelse ^22,23. Gennem yderligere optimering af de dyrkningsbetingelser, vil andre nye biomarkører uden Hes3 sandsynligvis blive identificeret og udvide den anerkendte antal NSC i den voksne hjerne yderligere. Dette er eksemplificeret ved vores observationer, at sondringer blandt Hes3 + cellepopulationen fra forskellige områder i hjernen kan foretages. For eksempel Hes3 + celler fra rygmarven, som dem fra SVZ og ACA, viser en flere gange stigning i deres nummer, når dyrket med dissefaktorer. Desuden kan Hes3 +-celler fra alle disse områder effektivt at generere neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Men morfologi og genekspression af de differentierede celletyper ikke er identisk. Yderligere biomarkører, som skelner mellem de forskellige Hes3 + celletyper vil være en velkommen tilføjelse til området. Den præsenteres her giver mulighed for effektiv produktion af NSC kulturer metode kan bruges som et redskab mod dette mål.

Ligesom NSC markører nestin og Sox2, transkriptionsfaktoren Hes3 identificerer en cellepopulation, at ved isolering kan opformeres in vitro såvel som differentieret i de vigtigste celletyper, der udgør nervesystemet, neuroner, astrocytter og oligodendrocytter ^11. Men i modsætning til disse mere almindeligt anvendte markører, Hes3 identificerer også hvilende NSC, som en konsekvens, at mange Hes3 + celler ikke inkorporere indikatorer for mitosen ⁽³ H-thymidin eller BrdU) under homeostatic cETINGELSER (og dermed have undgået klassiske detektionsteknikker). Anvendelse af protokollen beskrevet her var grundlæggende i opdagelsen af ​​denne NSC befolkning. Antallet af disse celler stiger i kultur, når de behandles med faktorer, der produceres fra det vaskulære endotel, herunder Notch ligand Delta4 og Angiopoetin2, i overensstemmelse med deres perivaskulære lokalisering in vivo ^24.

At have let adgang til disse celler isoleret fra den voksne hjerne giver mulighed for eksperimenter for at undersøge, hvordan cellerne reagerer på signaltransduktion niveau af forskellige faktorer, og giver nogle prædiktive indikationer af, hvordan cellerne vil reagere in vivo. Ser man ud over regenerativ medicin, vi viste, at dyrkningsbetingelser er beskrevet her have relevans for kræftforskning så godt. De repræsenterer det miljø, som kræft stamceller isoleret fra glioblastoma multiforme oplevelse bedre mens patienten, der giver mulighed for studiet of signalveje, der kan manipuleres til at modsætte sig deres vækst ^30.. Den brede anvendelse af denne teknik kan have betydelige konsekvenser for flere aspekter af forskning og medicin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit