Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Summary

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Abstract

Un recente lavoro dimostra che il sistema nervoso centrale (SNC) rigenerazione e tumorigenesi coinvolge popolazioni di cellule staminali (SCS) residenti all'interno del cervello adulto. Tuttavia, i meccanismi di queste cellule normalmente quiescenti impiegano per assicurare il corretto funzionamento delle reti neurali, così come il loro ruolo nel recupero da un infortunio e la mitigazione dei processi neurodegenerativi sono poco capito. Queste cellule risiedono nelle regioni denominate "nicchie" che forniscono un ambiente di sostegno che coinvolgono i segnali modulanti sia dal vascolare e immunitario. L'isolamento, la manutenzione e la differenziazione di CS del sistema nervoso centrale in condizioni di coltura definite che escludono fattori sconosciuti, li rende accessibili al trattamento con mezzi farmacologici o genetici, fornendo così spaccato il loro comportamento in vivo. Qui offriamo informazioni dettagliate sui metodi per la generazione di colture di SC SNC da regioni distinte del cervello adulto e approcci per valutare la loro dpotenziale ifferentiation in neuroni, astrociti, oligodendrociti e in vitro. Questa tecnica produce una popolazione omogenea di cellule come una coltura monostrato che può essere visualizzato per studiare individuale SC e la loro progenie. Inoltre, può essere applicato a diversi sistemi modello animale e campioni clinici, utilizzato in precedenza per prevedere le risposte di rigenerazione nel sistema nervoso adulto danneggiato.

Introduction

Il dogma centrale della neurobiologia, stabilito dalle osservazioni fondamentali del citoarchitettura cervello fatto da Ramón Y. Cajal oltre un secolo fa, ha dichiarato che la neurogenesi è improbabile dopo l'adolescenza data la complessità delle reti neurali presenti nel sistema nervoso centrale ^1. Nonostante il lavoro di Altman nel 1960, e successivamente Kaplan, dimostrando che ³ H-timidina è stato trovato in neuroni maturi che indicano che in realtà neuroni venivano generati in zone distinte del cervello adulto, il dogma continuato a tenere ^{2, 3.} La prova ha continuato a montare con la ricerca di Nottebohm descrivere i cambiamenti stagionali nel numero di neuroni presenti nel cervello Songbird ^4. Non è stato fino al 1999, quando Gould et al. Lavoro pubblicato sulla generazione di neuroni nell'ippocampo aumenta con l'esecuzione di compiti di apprendimento associativo nel ratto, nonché le osservazioni di Kornack e Rakic ​​dimostrazioneting continuato neurogenesi nel macaco adulto che il concetto di una meno rigida, cervello più plastico, è stato riconosciuto ^{5, 6.}

La ricerca della sorgente cellulare di questi neuroni de novo generati portato alla scoperta di una popolazione discreta di cellule staminali (SC) che risiedono in aree del cervello denominato nicchie ^7. La zona subventricular e sub zona granulari dell'ippocampo sono considerate le due principali regioni neurogenici ^8,9. Le cellule isolate da questi luoghi mostrano la classica caratteristica del SCs derivate embrionali o fetali, self-renewal e potenziale di differenziazione. Nel caso di cellule staminali neurali (NSC), possono essere differenziati in neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Inoltre, questi SC macchia positivo per fetali marcatori NSC come il filamento intermedio proteina nestin ^10. Lavori più recenti sottolinea che SC potrebbero non essere limitate a queste two aree, e sono infatti localizzati in tutto il cervello come una popolazione in gran parte quiescente di cellule strettamente associati al sistema vascolare ^11.

Le osservazioni che la SCS sono mobilitati in risposta al danno suggerisce la possibilità di essere in grado di utilizzare queste cellule per scopi rigenerativi per aiutare nel recupero dalla malattia neurodegenerativa e ictus ^{12, 13.} Questo non è dissimile il ruolo che le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono nella guarigione dei tessuti connettivi, che si trovano come cellule perivascolari che hanno il potenziale di diventare osteoblasti, condrociti e cellule adipose ^14. Tuttavia, NSC non possono essere raccolti nello stesso modo come MSC da midollo osseo di aspirazione routine e densità gradiente tecniche di centrifugazione e successivamente utilizzati in terapie cellulari basate autologhe. Di conseguenza, altre fonti di cellule, come l'uso di cellule staminali neurali fetali e precursori neuronali derivate da embLe cellule staminali ryonic sono state ampiamente esplorate in malattie animali e modelli di pregiudizio con vari gradi di successo ^15. Tecnologie di cellule staminali pluripotenti indotte che utilizzano fonti di cellule somatiche offrono un'altra viale potenziale per la produzione di terapie cellulari terapeuticamente utili per una vasta gamma di applicazioni, superando la limitata disponibilità e preoccupazioni etiche riguardanti l'uso di cellule embrionali e tessuti fetali ^16. Tuttavia, la traduzione clinica di questi risultati ha dimostrato di essere un compito difficile, come dimostrato nelle lotte di trattamento di varie condizioni neurologiche con terapeutico basato-SC approcci ^17,18, così come un percorso tortuoso di gioco regolamentare. Come approccio alternativo, l'introduzione di specifici trattamenti farmacologici in grado di modulare i numeri NSC e facilitare il recupero in modelli di malattia di Parkinson e ictus ^19. Qualunque sia la strategia potrebbe essere, capire come manipolare efficacemente queste cellulerichiede un sistema accessibile in vitro.

Culture del NSC possono essere eseguite sia come culture aggregati, noto anche come neurosfere, o come un monostrato ^8,20. Entrambe le tecniche sono stati ampiamente utilizzati, permettendo la creazione di condizioni di coltura definiti, cioè uso di Epidermal Growth Factor (EGF) o fattore fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) come fonte mitogeno, che prevedono l'espansione di precursori multipotenti. Mentre colture di neurosfere può essere più adatto per studiare capacità propagazione clonale di un tipo di cellula isolata, il sistema ha dimostrato di produrre una popolazione mista di cellule durante l'espansione ^21. Inoltre, la struttura chiusa di neurosfere rende manipolazione farmacologica delle cellule impraticabile, e l'interpretazione dell'influenza questi fattori possono avere potrebbe essere confuso a causa del microambiente stabilito nella neurosfere stesso. Colture monostrato, d'altro canto, possono essereimpiegato in schermi ad alta produttività di librerie di piccole molecole, fornendo un potente strumento per esplorare i meccanismi di trasduzione del segnale che regolano la crescita e la differenziazione SC e si apre la possibilità di scoprire nuovi composti che colpiscono specificamente questa popolazione di cellule.

Di conseguenza, la capacità di generare riproducibile colture di NSC adulte provenienti da diverse regioni di interesse nel cervello può essere utilizzato in una vasta gamma di applicazioni di ricerca comprendono studi di sviluppo del sistema nervoso centrale (CNS) per esplorare nuovi approcci di medicina rigenerativa . Il protocollo presentato qui dimostra come sezionare e valutare il potenziale di differenziazione della SC SNC isolate dal cervello di roditori adulti.

Protocol

Il lavoro aderisce alla Dichiarazione di Helsinski e l'animale dichiarazione ARVO. Gli animali sono stati impiegati per la raccolta dei tessuti e tutti i metodi pertinenti sono state seguite secondo le istruzioni del stabulario dell'Università di Dresda. Gli animali sono stati maneggiati e custoditi secondo le linee guida federali tedesche per l'uso e la cura degli animali da laboratorio, e lo studio è stato approvato dal Landesdirektion Dresda. Si prega di consultare la politica veterinaria del proprio istituto (IACUC o l'altro bordo) per quanto riguarda una metodologia appropriata e l'eutanasia.

Azione specifica e le concentrazioni di lavoro dei reagenti possono essere trovati nelle tabelle reagenti che accompagnano questo protocollo.

1. Culture Dish Preparazione

1. Piatti cappotto con un volume sufficiente di 75 ug / ml di poli-L-ornitina (cioè 2 ml / pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) durante la notte in incubatrice coltura cellulare 2 giorni prima della data dissezione programmata.
2. Rimuovere il lavaggio finale, quindi aggiungere la fibronectina (diluito 1:250, 4 mg / ml in PBS) alla piastra e posizionare i piatti in incubatrice durante la notte.
3. Aspirare il fibronectina il giorno della dissezione e lavare i piatti 2x con PBS. Riportare le piastre ancora contenenti la finale PBS lavare per l'incubatore fino a quando il tessuto dissociato è pronto per la coltura. A quel tempo, togliere la PBS prima di placcatura del tessuto.
4. Conservare le piastre rivestite con poli-L-ornithinein l'incubatrice per un massimo di 3 settimane. Piastre rivestite con fibronectina possono essere conservati per un massimo di 1 settimana. Fibronectina rivestimento può essere fatto in meno di 2 ore se urgente. La fibronectina è suscettibile di denaturazione, non agitare la soluzione o lasciare asciugatura delle stoviglie.

2. Dissection / placcatura

1. Questo protocollo si applica all'uso di 3 ratti adulti (3-6 mesi di età).
2. Chill cervello di sezionamento blocco di ghiaccio prima di eutanasia ratto.
3. Posizionare un tubo Falcon da 15 ml che contiene 5 ml di N2 media con aggiunta di bFGF sul ghiaccio.
4. Euthanize i ratti in base alla politica veterinaria dell'istituto.
5. Rimuovere il cervello dal cranio facendo un'incisione lungo la linea mediana della testa. Utilizzare pinze a staccarsi l'osso permettendo al cervello di essere attentamente estratto.
6. Mettere il cervello in un piatto di 10 centimetri di Petri contenente ghiacciata PBS. Questo consente di eliminare ogni residuo di capelli e di sangue. (Figura 1A)
7. Mettere il cervello nel blocco sezionamento refrigerata. (Figura 1B)
8. Inserire una nuova lama di rasoio pulito nel blocco, come illustrato nella figura 1C.
9. Inserire una seconda lama di rasoio pulito 3 millimetri caudale al primo, come illustrato nella Figura 1D.
10. Sollevare delicatamente le lame dal blocco, portando con loro la sezione di interesse.
11. Float l'secZIONE fuori la lama immergendolo in PBS. (Figura 1E)
12. Tessuto raccolto dalla zona di interesse (in questo esempio abbiamo usato commessura anteriore, (anteriore) ACA, Figura 1F) utilizzando # 5 pinze raccogli in una provetta conica da 15 ml contenente 1 ml di mezzo contenente N2 bFGF.
13. Spostare il tubo in una cappa a flusso laminare coltura cellulare, continuando il resto del protocollo in condizioni sterili.
14. Meccanicamente dissociare il tessuto con una punta di pipetta 1 ml collegato a una pipetta P1000. Pipetta su e giù diverse volte (circa 20x ad una velocità di 1 ciclo di pipettaggio al secondo) mentre si preme l'apertura della punta della pipetta contro il fondo della provetta conica (figure 1-3) 1G. Smettere di triturazione quando la soluzione diventa omogenea.
15. Lasciare agire la soluzione per 2 minuti per consentire qualsiasi tessuto nondissociated più grande per depositarsi sul fondo. (Figura 1G 4)
16. Raccogliere il homogendell'EOUS surnatante e posto in una provetta contenente 8,5 ml di mezzi N2 più 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2 e 200 nMJAK inibitore.
17. Li piastra in 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con 3 ml di soluzione diluita di cellule / e.
18. Porre la piastra in un incubatore umidificato a cella 37 ° C, 5% CO _2, 5% O _2.

3. Manutenzione giornaliera

1. Sostituire il supporto sulle piastre di coltura con N2 Piano contenenti bFGF, Ang2, Dll4, e JAK inibitore 24 ore dopo la placcatura.
2. Aggiungere un bolo di bFGF, Dll4, Ang2, e l'inibitore JAK il giorno successivo.
3. Continuare questo processo alternato di cambiamenti dei media e integrazioni fattore per un totale di 10-14 giorni.

4. Induzione di differenziazione

1. Ritirare bFGF, Dll4, Ang2, e JAK inibitore contenente il mezzo e sostituirlo con mezzo N2 che non contiene elementi aggiuntivi.
2. Cambia il mezzo ogni secondo giorno.
3. Fissare le cellule dopo 10 giorni ed effettuare immunocitochimica.

5. Rilevamento immunocitochimico

1. Aspirare il mezzo e il fissaggio delle piastre di coltura cellulare con 2 ml di paraformaldeide al 4% per 20 min.
2. Lavare 2x con 3 ml di PBS per 5 min ciascuno.
3. Aspirare il PBS, poi permeabilize e bloccare le cellule aggiungendo 2 ml di PBS contenente 5% di siero normale asino (NDS) e 0,1% Triton X-100 per 20 min.
4. Preparare la miscela di anticorpo primario in PBS contenente 5% NDS. Anticorpo anti-nestin può essere utilizzato per identificare SC, mentre TUJ1 (classe III β-tubulina), anticorpi GFAP, e CNPase possono essere utilizzati insieme per una colorazione tripla di marcatori di differenziazione.
5. Aspirare la soluzione di saturazione e aggiungere 1,5 ml della miscela anticorpo primario a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 90 min.
6. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare 2x con 3 ml di PBS, e 1x con 3 ml di PBS contenente 5% NDS per 5 minuti ciascuna.
7. Prepae gli anticorpi secondari in PBS contenente 5% NDS.
8. Aspirare il lavaggio finale e aggiungere 1,5 ml di soluzione di anticorpo secondario in ciascun pozzetto. Incubare al buio per 40 minuti a temperatura ambiente.
9. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e aggiungere 2 ml di una macchia DAPI preparata (500 ng / ml in PBS). Incubare per 3 min.
10. Aspirare la soluzione DAPI poi lavare 3x con 3 ml di PBS per 5 minuti ciascuna. Le cellule possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza.

Representative Results

Identificare la regione di interesse che per raccogliere le cellule staminali neurali è il primo punto critico e definirà la quantità di tempo necessario per ottenere un piatto confluenti di cellule. Ad esempio, la SVZ è una zona neurogena classico e ha quindi una relativa proporzione elevata di cellule staminali neurali. Tuttavia, la tecnica qui presentata può essere utilizzato con altre regioni spesso non riconosciuti come aventi un potenziale neurogena robusto nell'età adulta. Ai fini del presente protocollo, abbiamo usato la commessura anteriore (parte anteriore). Mentre alcune delle cellule e detriti si depositerà sulla placcatura, il mezzo normalmente rimane torbido come conseguenza della quantità di materiale cellulare che è presente seguente triturazione. Il primo cambiamento medio a 24 ore rimuoverà la maggior parte di questo. Come visualizzato al microscopio ottico, ci sembrerà costituire una grande quantità di materiale cellulare rimanente, insieme con i vasi sanguigni, anche dopo il primo cambiamento medio. Nel corso diNei prossimi giorni, colonie di una popolazione di cellule proliferanti distinta saranno visibili al microscopio (Figura 2A). Queste sono le cellule staminali neurali che sono state selezionate per la crescita dall'uso di N2 mezzo contenente bFGF, Ang2, Dll4, e inibitore JAK. Inoltre, una popolazione di cellule mandrino-come più allungata può anche essere presente (Figure 2B e   C). Queste non sono le cellule staminali neurali (glia radiale probabilmente basata sulla morfologia e colorazione), che saranno eventualmente superati dalla più rapida popolazione di cellule staminali neurali proliferare. Nel corso di una settimana a 14 giorni, le cellule diventeranno più denso fino a raggiungere confluenza (Figura 2D). Queste culture macchia positivo per un numero di marcatori di cellule staminali, compreso Nestin, Hes3, e Sox2. (Figure 2E-H), fornendo così la sicurezza che le popolazioni di cellule che sono state selezionate e espansi sono infatti neurale cellule staminali.Un'ulteriore conferma deriva dalla capacità di ritiro FGF dal mezzo, permettendo alle cellule di differenziarsi per 10 giorni per generare neuroni, astrociti, oligodendrociti e (Figura 2i).

Figura 1: Isolamento di ratto sezioni di cervello di cellule staminali neurali adulte raccolta. A) ratto adulto cervello dopo il lavaggio con PBS. B) del cervello di ratto posta in acciaio inox refrigerati sezionamento blocco. C) Posizionamento approssimativa delle lamette iniziali all'interno del blocco di produrre sezioni coronali del cervello. D) di collocamento del 2 lame di rasoio supplementari nel blocco sezionamento. Nota, più sottili lame a doppio taglio sono stati utilizzati per scopi dimostrativi per consentire la facile visualizzazione delle sections nel blocco. E) sezioni di cervello coronali contenenti aree per essere raccolto. F) Schema dalle atlante del cervello Paxinos evidenziando la zona subventricolare come una regione classico neurogena, e la commessura anteriore da cui cellule sono state raccolte per questo protocollo. G) immagini sequenziali del processo di dissociazione tessuto con una punta di pipetta 1 ml collegato a un micropipettatore P1000. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2: adulti cellule staminali neurali in vitro. A) coltura di cellule staminali adulte neurali dopo una settimana. B) Esempi di un più larghe cellule mandrino morfologia (red frecce) occasionalmente presenti nelle culture che non sono le cellule staminali neurali. C, D), alle condizioni di coltura definite nel presente protocollo, le cellule staminali neurali preferenzialmente espandono. EH) Espressione di marcatori di cellule staminali neurali in seguito 14 giorni in vitro, Sox2 (verde) (E), Hes 3 (rosso) (F), e Nestin (viola) (G). I) La differenziazione delle cellule staminali neurali in neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Dopo la sospensione mitogeno, le cellule sono stati autorizzati a differenziare per 10 giorni, poi immunostained per GFAP (verde), TUJ1 (rosso), e CNPase (blu). J) Hes3 immunocolorazione nel cervello di ratto adulto. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

Molti dei passaggi critici all'isolamento successo, l'espansione e la differenziazione delle cellule staminali neurali dal cervello adulto sono condivise in comune con le tecniche di coltura di tessuti standard. L'obiettivo da tenere a mente è che le cellule staminali neurali isolate dal cervello adulto dovrebbe mantenere come molti dei loro caratteristiche in vivo come possibile (Figura 2J). Spesso un equilibrio tra la necessaria prudenza e velocità adeguata deve essere colpito. Manutenzione con l'isolamento del cervello dal cranio farà l'identificazione della regione di interesse molto più semplice. Rimozione del tessuto più rapidamente possibile dopo euthanization animale, e mantenendo il freddo cervello durante la raccolta e lavaggio mantiene più rigido e notevolmente assiste nella gestione del tessuto quando è posto in acciaio inox sezionamento stampo. Questo riduce anche la possibilità di strappo del tessuto durante il processo di taglio. Il protocollo beneficia anche di essere able per ottenere le cellule al punto di placcatura rapidamente, in quanto questo aumenta la vitalità cellulare una volta posizionati in vitro. Lavaggio tessuto corretto prima del sezionamento aiuta anche a ridurre il potenziale di contaminazione nelle culture. Durante il processo di dissociazione, triturazione con una pipetta 1 ml deve essere vigoroso, ma fatto in modo da non generare bolle in eccesso o schiuma della sospensione di cellule che impatti negativamente la sopravvivenza delle cellule. La prima modifica medium è anche fondamentale in quanto elimina la maggior parte delle cellule non associata e detriti cellulari che risulta dal processo di dissociazione tessuto che contiene fattori che sono dannosi per la sopravvivenza iniziale della popolazione di cellule staminali. Per una migliore visualizzazione seguente immunoistochimica, le cellule appena isolate possono essere piastrate su coprioggetto 25 mm vetro posto sul fondo delle piastre a 6 pozzetti. Le concentrazioni di poli-L-ornitina e fibronectina usato nel rivestimento dovrebbe essere aumentata a 500 mg / ml e 20 μg / ml, rispettivamente. In alternativa, più coprioggetto minori (cioè 12 mm) può essere collocato in ogni pozzetto. Questi possono poi essere trattati per immunoistochimica indipendente in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti, ridimensionando le quantità di reagenti di colorazione utilizzate per tenere conto dei volumi più piccoli. I coprioggetti vengono poi montate su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso standard.

Definire la presenza di NSC nel cervello adulto è di grande interesse nel campo della neurobiologia. Ci sono due approcci generali per identificare una cellula staminale. In uno, un insieme di biomarker basati su un profilo di espressione genica della popolazione di cellule staminali in questione può essere utilizzato per l'immagine di loro mediante immunoistochimica. Sebbene sperimentalmente semplice, dà nessun dato funzionali, né definisce se le cellule hanno le proprietà fondamentali delle cellule staminali, la capacità di auto rinnovare o differenziarsi in diversi tipi cellulari differenti. In altro approccio, le cellule sono isolate in either una popolazione pura o eterogenei, posto nella cultura, e c'è il rinnovamento di sé e le proprietà multipotenti sono valutate utilizzando la popolazione cellula vivente. Questo approccio fornisce dati funzionali, e può essere usata per dimostrare inequivocabilmente "stemness" in queste particolari condizioni sperimentali in vitro. Tuttavia, la difficoltà di mantenere queste cellule in coltura ha ostacolato questo secondo approccio funzionale. In realtà, l'incapacità di crescere NSC da altre aree del cervello ha lasciato l'impressione che ci sono solo un paio di nicchie specializzate in cui risiedono.

Il metodo qui presentato permette di coltura delle cellule staminali neurali da diverse aree del sistema nervoso centrale. Questa tecnica si basa sul nostro lavoro, che ha illustrato un percorso di trasduzione del segnale di grande importanza per il controllo del numero di NSC sia in vitro che in vivo. I fattori inclusi in questo protocollo sono stati selezionati sulla base di studi approfonditi trasduzione del segnale, Dimostrando che promuovono la crescita NSC tramite un fattore di trascrizione comune Hes3. I nostri studi precedenti dimostrano che questa particolare combinazione ha prodotto un aumento ancora maggiore del numero di NSC rispetto all'utilizzo individualmente. La scelta di quale viene aggiunto il supporto farmacologico per la coltura deve essere considerato nel contesto della biologia studiata. Ad esempio, mentre sia Ang2 e Dll4 hanno un impatto positivo sulla crescita NSC, hanno effetti opposti sulla formazione vascolare ^22,23. Attraverso un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di coltura, ulteriori nuovi biomarker di là Hes3 probabilmente saranno identificati e ampliare ulteriormente il numero riconosciuto di cellule staminali neurali nel cervello adulto. Ciò è esemplificato dalle nostre osservazioni che le distinzioni tra la popolazione di cellule Hes3 + da diverse aree del cervello possono essere fatte. Ad esempio Hes3 + cellule dal midollo spinale, come quelli della SVZ e ACA, mostrano un incremento vari piega del loro numero quando coltivate con questifattori. Inoltre, Hes3 + cellule provenienti da tutte queste regioni possono efficacemente generare neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Tuttavia, l'espressione genica e la morfologia dei tipi di cellule differenziate non è identico. Biomarcatori supplementari che distinguono tra i diversi tipi di cellule Hes3 + sarà una gradita aggiunta al campo. Il metodo qui presentato consentendo la generazione efficiente di culture NSC può essere utilizzata come strumento per raggiungere questo scopo.

Come il NSC marcatori nestin e Sox2, il fattore di trascrizione Hes3 identifica una popolazione cellulare che sull'isolamento possono essere propagate in vitro e differenziato nelle principali tipi di cellule che costituiscono il sistema nervoso, neuroni, astrociti, oligodendrociti e ^11. Tuttavia, a differenza di questi marcatori più comunemente usati, Hes3 identifica anche NSC quiescenti, di conseguenza, molti + cellule Hes3 non comprendono indicatori di mitosi ⁽³ H-timidina o BrdU) sotto omeostatico condizioni (e quindi hanno evitato di tecniche di rilevamento classiche). L'applicazione del protocollo qui descritto è stato fondamentale nella scoperta di questa popolazione NSC. Il numero di queste cellule in coltura aumenta quando trattati con fattori prodotti dall'endotelio vascolare, compreso il ligando Delta4 Notch, e Angiopoetin2, compatibilmente con la loro localizzazione perivascolare in vivo ^24.

Avere accesso immediato a queste cellule isolate dal cervello adulto permette una sperimentazione di verificare come le cellule rispondono al livello del segnale di trasduzione di vari fattori, e fornisce alcune indicazioni predittivi di come le cellule rispondono in vivo. Guardando oltre la medicina rigenerativa, abbiamo dimostrato che le condizioni di coltura qui descritti hanno rilevanza per la ricerca sul cancro pure. Essi rappresentano meglio l'ambiente che le cellule staminali tumorali isolate da glioblastoma multiforme esperienza, mentre nel paziente, consentendo l'O studiof vie di segnalazione che possono essere manipolati opporsi al loro ³⁰ crescita. L'ampia applicazione di questa tecnica potrebbe avere implicazioni significative per molteplici aspetti della ricerca e della medicina.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit