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Neuroscience

वयस्क कृंतक मस्तिष्क के पारंपरिक और nonconventional क्षेत्र से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से बढ़

Published: November 18, 2013 doi: 10.3791/50880
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Medicine, University of Dresden, 2Center for Regerative Therapies Dresden

Summary

वयस्क दिमाग से काटा तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं तंत्रिका तंत्र के विकास के बुनियादी अनुसंधान से पुनर्योजी चिकित्सा में संभावित नैदानिक ​​अनुप्रयोगों की खोज को लेकर अनुप्रयोगों में उपयोग बढ़ रही हैं. इस प्रयोगात्मक परिणामों ध्वनि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इन कोशिकाओं को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया अलगाव और संवर्धन की स्थिति में कठोर नियंत्रण में आता है.

Abstract

हाल ही में काम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उत्थान और tumorigenesis स्टेम कोशिकाओं की आबादी (एससी) वयस्क मस्तिष्क के भीतर निवासी शामिल है कि यह दर्शाता है. हालांकि, तंत्र इन सामान्य रूप से मौन कोशिकाओं उचित तंत्रिका नेटवर्क के कामकाज, साथ ही neurodegenerative प्रक्रियाओं की चोट और शमन से वसूली में उनकी भूमिका सुनिश्चित करने के लिए काम थोड़ा समझ रहे हैं. इन कोशिकाओं नाड़ी और प्रतिरक्षा प्रणाली दोनों से modulatory संकेतों को शामिल सम्भालने वाले वातावरण प्रदान करते हैं कि "आलों" के रूप में भेजा क्षेत्रों में रहते हैं. अज्ञात कारणों को बाहर जो परिभाषित संस्कृति शर्तों के तहत सीएनएस अनुसूचित जातियों के अलगाव, रखरखाव, और भेदभाव, इस प्रकार उनके vivo व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान, औषधीय या आनुवंशिक माध्यम से उपचार के लिए उन्हें सुलभ बना देता है. यहाँ हम वयस्क मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों से सीएनएस अनुसूचित जातियों की संस्कृतियों पैदा करने के लिए तरीकों पर विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं और अपने फैसले का आकलन करने के लिए दृष्टिकोणन्यूरॉन्स astrocytes, और इन विट्रो में oligodendrocytes में ifferentiation संभावित. इस तकनीक को व्यक्तिगत अनुसूचित जातियों और उनकी संतान का अध्ययन करने के लिए कल्पना की जा सकती है कि एक monolayer संस्कृति ही एक सजातीय सेल आबादी पैदावार. इसके अलावा, यह विभिन्न पशु मॉडल प्रणाली और नैदानिक ​​नमूने भर में लागू किया जा सकता क्षतिग्रस्त वयस्क तंत्रिका तंत्र में पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया जा रहा है.

Introduction

एक सदी पहले से अधिक रेमन वाई Cajal द्वारा किए गए मस्तिष्क cytoarchitecture की मौलिक टिप्पणियों द्वारा निर्धारित तंत्रिका जीव विज्ञान के केंद्रीय हठधर्मिता, किशोरावस्था सीएनएस 1 में पाया तंत्रिका नेटवर्क की जटिलता को देखते हुए बाद न्यूरोजेनेसिस संभावना नहीं थी कि आयोजित किया. 1960 के दशक में Altman का काम करते हैं, और बाद में कापलान, 3 एच thymidine वास्तव में न्यूरॉन्स वयस्क मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में उत्पन्न किया जा रहा था यह दर्शाता है कि परिपक्व न्यूरॉन्स में पाया जा सकता है कि प्रदर्शन के बावजूद, हठधर्मिता 2, 3 पकड़ जारी रखा. साक्ष्य Songbird दिमाग 4 में मौजूद न्यूरॉन्स की संख्या में मौसमी बदलाव का वर्णन Nottebohm के अनुसंधान के साथ माउंट करने के लिए जारी रखा. यह 1999, जब तक नहीं था जब चूहे में साहचर्य सीखने कार्यों का प्रदर्शन, साथ ही Kornack और Rakic ​​प्रदर्शन है की टिप्पणियों के साथ हिप्पोकैम्पस बढ़ जाती है में न्यूरॉन्स की पीढ़ी पर गोल्ड एट अल. प्रकाशित कामting एक कम कठोर, अधिक प्लास्टिक मस्तिष्क की अवधारणा, 5 पहचाना गया था कि वयस्क मकाक, 6 में neurogenesis जारी रखा.

इन नए सिरे से उत्पन्न न्यूरॉन्स के लिए सेलुलर स्रोत के लिए खोज 7 niches के रूप में भेजा मस्तिष्क के क्षेत्रों में रहते हैं कि स्टेम कोशिकाओं (एससी) के एक असतत आबादी की खोज को बढ़ावा. subventricular क्षेत्र और हिप्पोकैम्पस के उप बारीक क्षेत्र दो प्रमुख तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों 8,9 माना जाता है. इन स्थानों से अलग कक्षों क्लासिक भ्रूण या भ्रूण व्युत्पन्न अनुसूचित जातियों की विशेषता, आत्म नवीकरण और भेदभाव की क्षमता प्रदर्शित करते हैं. तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के मामले में, वे न्यूरॉन्स astrocytes, और oligodendrocytes में भेदभाव किया जा सकता है. इसके अलावा, इन अजा ऐसे मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन nestin के रूप में 10 भ्रूण एनएससी मार्करों के लिए सकारात्मक दाग. और हाल ही में काम अजा इन टी तक ही सीमित नहीं किया जा सकता है पर प्रकाश डाला गयाक्षेत्रों wo, और वास्तव में कसकर vasculature 11 के साथ जुड़े कोशिकाओं के एक बड़े पैमाने पर मौन जनसंख्या के रूप में मस्तिष्क में स्थानीयकृत हैं.

अनुसूचित जातियों चोट के जवाब में जुटाए हैं कि टिप्पणियों neurodegenerative विकार और स्ट्रोक 12, 13 से वसूली में सहायता करने के लिए पुनर्योजी उद्देश्यों के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने में सक्षम होने की संभावना का सुझाव है. इस अस्थिकोरक, chondrocytes, और वसा कोशिकाओं के 14 बनने की क्षमता है कि परिवाहकीय कोशिकाओं के रूप में पाए जाते हैं जो mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) संयोजी ऊतक की चिकित्सा में खेलने उस भूमिका के विपरीत नहीं है. हालांकि, एनएससी दिनचर्या आकांक्षा और घनत्व ढाल centrifugation तकनीक से अस्थि मज्जा से MSCs के रूप में एक ही तरीके से काटा नहीं जा सकता है और बाद में ऑटोलॉगस सेल आधारित चिकित्सा में उपयोग किया. एक परिणाम के रूप में, इस तरह के EMB से व्युत्पन्न भ्रूण एनएससी या neuronal व्यापारियों के उपयोग के रूप में कोशिकाओं के अन्य स्रोतों,ryonic स्टेम कोशिकाओं बड़े पैमाने पर सफलता 15 की डिग्री के साथ अलग जानवरों की बीमारी और चोट के मॉडल में लगाया गया है. दैहिक सेल के सूत्रों का उपयोग प्रेरित pluripotent स्टेम सेल प्रौद्योगिकी सीमित उपलब्धता और भ्रूण कोशिकाओं और भ्रूण के ऊतकों 16 के उपयोग के संबंध में नैतिक चिंताओं पर काबू पाने के लिए आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए therapeutically उपयोगी सेल आधारित चिकित्सा के उत्पादन के लिए एक अन्य संभावित एवेन्यू प्रदान करते हैं. हालांकि, इन निष्कर्षों के नैदानिक ​​अनुवाद 17,18, साथ ही नियामक मंजूरी के लिए एक कपटपूर्ण पथ दृष्टिकोण अनुसूचित जाति आधारित चिकित्सीय साथ विभिन्न स्नायविक शर्तों के उपचार के संघर्ष में प्रदर्शन के रूप में, एक मुश्किल काम साबित हो गया है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, विशिष्ट औषधीय उपचार की शुरूआत एनएससी संख्या मिलाना और पार्किंसंस रोग और स्ट्रोक 19 के मॉडल में वसूली की सुविधा कर सकते हैं. रणनीति, प्रभावी ढंग से इन कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए समझ कैसे किया जा सकता है जो कुछ भीएक सुलभ इन विट्रो प्रणाली की आवश्यकता है.

एनएससी की संस्कृति भी neurospheres के रूप में जाना कुल संस्कृतियों, के रूप में या एक monolayer 8,20 के रूप में या तो किया जा सकता है. दोनों तकनीकों का व्यापक रूप से multipotent व्यापारियों के विस्तार के लिए प्रदान कि परिभाषित संस्कृति की स्थिति, एक माइटोजन स्रोत के रूप में epidermal वृद्धि कारक (EGF) या बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) यानी उपयोग करते हैं, की स्थापना की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया गया है. Neurosphere संस्कृतियों एक अलग सेल प्रकार का क्लोन प्रजनन क्षमता के अध्ययन के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है, सिस्टम विस्तार 21 के दौरान कोशिकाओं का एक मिश्रित आबादी का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, neurospheres के बंद संरचना कोशिकाओं के औषधीय हेरफेर अव्यावहारिक बना देता है, और इन कारकों हो सकता है प्रभाव की व्याख्या के कारण neurosphere के भीतर ही स्थापित microenvironment को चकित किया जा सकता है. Monolayer संस्कृतियों, दूसरे हाथ पर, हो सकता हैअनुसूचित जाति विकास और भिन्नता को विनियमित करने और विशेष रूप से इस सेल की आबादी लक्ष्य है कि उपन्यास यौगिकों की खोज करने के अवसर को खोलता है कि संकेत पारगमन तंत्र का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने, छोटे अणु पुस्तकालयों के उच्च throughput स्क्रीन में कार्यरत हैं.

एक परिणाम के रूप में, reproducibly मस्तिष्क में ब्याज के विभिन्न क्षेत्रों से वयस्क एनएससी की संस्कृतियों उत्पन्न करने की क्षमता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास के अध्ययन से उपन्यास पुनर्योजी चिकित्सा तरीकों की खोज को लेकर शोध आवेदनों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में इस्तेमाल किया जा सकता है . यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल काटना और वयस्क कृंतक मस्तिष्क से अलग सीएनएस अनुसूचित जाति के भेदभाव की क्षमता का आकलन करने के लिए कैसे करें.

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Protocol

काम Helsinski की घोषणा और ARVO पशु कथन का पालन करता है. ड्रेसडेन विश्वविद्यालय में जानवरों की सुविधा के निर्देश के अनुसार पशु ऊतक संग्रह के लिए इस्तेमाल किया गया है और सभी प्रासंगिक तरीकों का पालन किया गया. पशु संभाला और रखे प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग और देखभाल के लिए जर्मन संघीय दिशानिर्देशों के अनुसार, और अध्ययन Landesdirektion ड्रेसडेन द्वारा अनुमोदित किया गया था रहे थे. उचित इच्छामृत्यु कार्यप्रणाली के बारे में आपकी संस्था के पशु चिकित्सा नीति (IACUC या अन्य बोर्ड) के साथ परामर्श करें.

विशिष्ट शेयर और अभिकर्मकों का काम कर रहे सांद्रता इस प्रोटोकॉल के साथ अभिकर्मक टेबल्स में पाया जा सकता है.

1. संस्कृति डिश तैयार

  1. 75 ग्राम की पर्याप्त मात्रा के साथ कोट व्यंजन / एमएल पाली एल ओर्निथिन (यानी 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली की) रात भर 2 दिन पहले अनुसूचित विच्छेदन की तारीख करने के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में.
  2. अंतिम धोने निकालें, तो थाली के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन (पतला 1:250, पीबीएस में 4 ग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए और रातोंरात इनक्यूबेटर में बर्तन जगह है.
  3. विच्छेदन के दिन फ़ाइब्रोनेक्टिन Aspirate और व्यंजन पीबीएस के साथ 2x धो लो. अभी अलग ऊतक संवर्धन के लिए तैयार है जब तक अंतिम पीबीएस इनक्यूबेटर को धो युक्त प्लेटें लौटें. उस समय, ऊतक चढ़ाना पीबीएस पूर्व हटा दें.
  4. अप करने के लिए 3 सप्ताह के लिए इनक्यूबेटर पाली एल ornithinein साथ लेपित स्टोर प्लेटें. Fibronectin साथ लेपित प्लेट 1 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है. तत्काल अगर fibronectin कोटिंग के रूप में छोटे रूप में 2 घंटे में किया जा सकता है. Fibronectin विकृतीकरण के लिए अतिसंवेदनशील है, समाधान आंदोलन या सूखी बर्तन देना नहीं है.

2. विच्छेदन / चढ़ाना

  1. इस प्रोटोकॉल 3 वयस्क चूहों (उम्र के 3-6 महीने) का उपयोग करने के लिए लागू होता है.
  2. बच्चोंएल पूर्व चूहे euthanizing को बर्फ पर ब्लॉक सेक्शनिंग मस्तिष्क.
  3. बर्फ पर गयी bFGF साथ एन 2 मध्यम के 5 मिलीलीटर होता है कि एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब रखें.
  4. अपनी संस्था के पशु चिकित्सा नीति के अनुसार चूहों euthanize.
  5. सिर के midline नीचे एक चीरा द्वारा खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें. सावधानी से निकाला जा करने के लिए मस्तिष्क के लिए अनुमति हड्डी दूर छील संदंश का प्रयोग करें.
  6. बर्फ के ठंडे पीबीएस युक्त एक 10 सेमी पेट्री डिश में मस्तिष्क रखें. यह किसी भी अवशिष्ट बाल और खून निकाल देंगे. (चित्रा 1 ए)
  7. ठंडा सेक्शनिंग ब्लॉक में मस्तिष्क रखें. (चित्रा 1 बी)
  8. चित्रा 1C में कल्पना के रूप में ब्लॉक में एक नया स्वच्छ धार डालें.
  9. चित्रा -1 में सचित्र के रूप में पहली बार के लिए एक दूसरे को साफ धार 3 मिमी दुम डालें.
  10. उन्हें सावधानी के साथ ब्याज की धारा लेने, ब्लॉक से ब्लेड उठा.
  11. सेकंड फ्लोटपीबीएस में डुबो कर ब्लेड बंद tion. (चित्रा 1E)
  12. रुचि के क्षेत्र से फसल ऊतक # 5 संदंश का उपयोग (इस उदाहरण में हम पूर्वकाल संयोजिका, (पूर्वकाल) एसीए, चित्रा 1F) का इस्तेमाल किया और bFGF युक्त 1 मिलीलीटर एन 2 मध्यम युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा.
  13. बाँझ शर्तों के तहत प्रोटोकॉल के शेष जारी रखने, एक लामिना का प्रवाह सेल संस्कृति हुड में ट्यूब ले जाएँ.
  14. यंत्रवत् एक P1000 pipettor से जुड़ी एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग ऊतक अलग कर देना. ऊपर और नीचे पिपेट कई बार (लगभग 20x प्रति सेकंड 1 pipetting चक्र की दर से) शंक्वाकार ट्यूब (आंकड़े 1G 1-3) से नीचे के खिलाफ विंदुक टिप के उद्घाटन दबाए रखते हुए. समाधान सजातीय हो जाता है जब विचूर्णन बंद करो.
  15. समाधान किसी भी बड़े nondissociated ऊतक नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए 2 मिनट के लिए बैठने की अनुमति. (चित्रा 1G 4)
  16. Homogen लीजिएईओयू सतह पर तैरनेवाला और N2 मीडिया के 8.5 मिलीलीटर प्लस 20 एनजी / एमएल bFGF, 500 एनजी / एमएल Dll4, 500 एनजी / एमएल Ang2, और 200 nMJAK एफडीए युक्त एक शंक्वाकार ट्यूब में जगह है.
  17. 3 पतला सेल समाधान की मिलीग्राम / अच्छी तरह का उपयोग कर एक 6 अच्छी तरह से थाली के 3 कुओं में उन्हें थाली.
  18. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 5% 2 हे एक humidified सेल इनक्यूबेटर में थाली प्लेस.

3. दैनिक देखभाल

  1. चढ़ाना के बाद 24 घंटे अवरोध करनेवाला bFGF, Ang2, Dll4, और जे ए युक्त एन 2 मध्यम साथ संस्कृति बर्तन पर मध्यम बदलें.
  2. BFGF, Dll4, Ang2, और अगले दिन पर जे ए अवरोध करनेवाला का एक सांस में जोड़ें.
  3. मीडिया में परिवर्तन और 10-14 दिनों के कुल के लिए कारक परिवर्धन के इस बारी प्रक्रिया जारी.

4. भेदभाव की प्रेरण

  1. मध्यम युक्त अवरोध करनेवाला bFGF, Dll4, Ang2, और जे ए को वापस लेने और किसी भी अतिरिक्त कारकों को शामिल नहीं करता है कि एन 2 मध्यम के साथ बदलें.
  2. हर दूसरे दिन मध्यम बदलें.
  3. 10 दिनों के बाद कोशिकाओं को ठीक करें और immunocytochemistry प्रदर्शन करते हैं.

5. Immunocytochemical जांच

  1. मध्यम Aspirate और 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के 2 मिलीलीटर के साथ सेल संस्कृति प्लेटों को ठीक.
  2. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ धो 2x.
  3. महाप्राण पीबीएस, तो permeabilize और 20 मिनट के लिए 5% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) और 0.1% ट्राइटन X-100 युक्त पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ब्लॉक.
  4. 5% एनडीएस युक्त पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें. TuJ1 (तृतीय वर्ग β-ट्यूबिलिन), GFAP, और CNPase एंटीबॉडी भेदभाव मार्करों की एक ट्रिपल धुंधला के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि विरोधी nestin एंटीबॉडी, अनुसूचित जातियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. अवरुद्ध समाधान Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण की 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. 90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ 2x धोने, और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 5% एनडीएस युक्त पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ 1x.
  7. Preparई पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी 5% एनडीएस युक्त.
  8. अंतिम धोने Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं.
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और एक नया तैयार DAPI दाग के 2 मिलीलीटर (पीबीएस में 500 एनजी / एमएल) जोड़ने. 3 मिनट के लिए सेते हैं.
  10. DAPI समाधान Aspirate फिर 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ 3x धो लो. कोशिकाओं को अब एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ देखे जा सकते हैं.

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Representative Results

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं फसल जहाँ से ब्याज के क्षेत्र की पहचान करना महत्वपूर्ण पहला कदम है और यह कोशिकाओं का एक मिला हुआ थाली ले लेता है समय की राशि को परिभाषित करेगा. उदाहरण के लिए, SVZ एक क्लासिक तंत्रिकाजन्य क्षेत्र है और इसलिए तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के एक उच्च सापेक्ष अनुपात है. हालांकि, यहां प्रस्तुत तकनीक अक्सर वयस्कता के दौरान एक मजबूत तंत्रिकाजन्य क्षमता वाले के रूप में मान्यता प्राप्त नहीं अन्य क्षेत्रों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, हम पूर्वकाल संयोजिका (पूर्वकाल भाग) का इस्तेमाल किया. कोशिकाओं और मलबे का कुछ चढ़ाना पर आदी हो जाएगा, वहीं मध्यम सामान्य रूप से उपस्थित निम्नलिखित विचूर्णन है कि सेलुलर सामग्री की राशि का एक परिणाम के रूप में परेशान रहेगा. 24 घंटा में पहले मध्यम परिवर्तन इस के बहुमत को दूर करेगा. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना के रूप में, यहां तक ​​कि पहले मध्यम परिवर्तन के बाद, रक्त वाहिकाओं के साथ बाकी सेलुलर सामग्री की एक बड़ी राशि होने के लिए वहाँ दिखाई देगा. के पाठ्यक्रम परअगले कुछ दिनों में एक अलग proliferating सेल आबादी की कालोनियों माइक्रोस्कोप (2A चित्रा) के तहत दिखाई हो जाएगा. ये bFGF, Ang2, Dll4, और जे ए अवरोध करनेवाला युक्त एन 2 मध्यम के उपयोग के द्वारा विकास के लिए चयनित किया गया है कि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं रहे हैं. इसके अलावा, एक अधिक लम्बी धुरी की तरह सेल की आबादी भी (आंकड़े 2 बी और मौजूद हो सकता है   सी). इन (संभावना रेडियल glia आकारिकी और धुंधला पर आधारित) तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं नहीं कर रहे हैं, वे अंततः अधिक तेजी से proliferating तंत्रिका स्टेम सेल की आबादी से आगे निकल कर दिया जाएगा. वे संगम (चित्रा 2 डी) जब तक 14 दिनों के लिए एक सप्ताह के दौरान, कोशिकाओं को और अधिक सघन हो जाएगा. इन संस्कृतियों nestin, Hes3, और Sox2 सहित स्टेम सेल मार्कर के एक नंबर के लिए सकारात्मक दाग. (आंकड़े 2 ई एच), इस प्रकार चयनित और विस्तारित किया गया है कि सेल आबादी वास्तव में तंत्रिका कोशिकाओं को स्टेम हैं कि आत्मविश्वास प्रदान करते हैं.आगे की पुष्टि, मध्यम से वापसी FGF करने की क्षमता से आता कोशिकाओं न्यूरॉन्स astrocytes, और oligodendrocytes (चित्रा 2I) उत्पन्न करने के लिए 10 दिनों के लिए अंतर करने की इजाजत दी.

चित्रा 1
चित्रा 1: फसल काटने वाले वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के लिए चूहे के मस्तिष्क वर्गों के अलगाव. 2 अतिरिक्त रेज़र ब्लेड का राज्याभिषेक वर्गों मस्तिष्क. डी) प्लेसमेंट का उत्पादन करने के लिए ब्लॉक के भीतर प्रारंभिक रेज़र ब्लेड के ब्लॉक सेक्शनिंग एक ठंडा स्टेनलेस स्टील में रखा पीबीएस के साथ धोने के बाद ए) वयस्क चूहे के मस्तिष्क. बी) चूहा मस्तिष्क. सी) लगभग पोजीशनिंग सेक्शनिंग ब्लॉक में. नोट, पतली डबल धार ब्लेड एस की आसान दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया गया. एफ) एक क्लासिक तंत्रिकाजन्य क्षेत्र के रूप में subventricular क्षेत्र पर प्रकाश डाला Paxinos मस्तिष्क एटलस से योजनाबद्ध आरेख, और कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल के लिए काटा गया, जहां से पूर्वकाल संयोजिका काटा जा क्षेत्रों युक्त ब्लॉक में ections. ई) कोरोनल मस्तिष्क वर्गों. जी) एक P1000 micropipettor से जुड़ी एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग ऊतक पृथक्करण की प्रक्रिया के अनुक्रमिक छवियों. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2: इन विट्रो में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं. एक अधिक व्यापक धुरी आकारिकी कोशिकाओं (Re) एक वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति एक सप्ताह के बाद. बी) उदाहरणयह प्रोटोकॉल में परिभाषित कल्चर शर्तों के तहत तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं. सी, डी) नहीं कर रहे हैं कि संस्कृतियों में कभी कभी वर्तमान डी तीर), तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं preferentially विस्तार. एह) तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति विट्रो, Sox2 में 14 दिन बाद (हरा) (ई), वह 3 (लाल) (एफ), और nestin (बैंगनी) (जी). मैं) न्यूरॉन्स astrocytes, और oligodendrocytes में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की भिन्नता. माइटोजन वापसी के बाद, कोशिकाओं GFAP (हरा) के लिए immunostained तो 10 दिनों के लिए अंतर करने के लिए अनुमति दी गई थी, TuJ1 (लाल), और CNPase (नीला) वयस्क चूहे के मस्तिष्क में. जे) Hes3 immunostaining. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

सफल अलगाव, विस्तार, और वयस्क मस्तिष्क से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण कदम से कई मानक टिशू कल्चर तकनीक के साथ आम में साझा कर रहे हैं. मन में सहन करने के लिए उद्देश्य वयस्क मस्तिष्क से अलग एनएससी संभव के रूप में उनके vivo विशेषताओं चित्रा (2j) के रूप में कई को बनाए रखने चाहिए. अक्सर आवश्यक सावधानी और उचित गति के बीच एक संतुलन की जरूरत है. खोपड़ी से मस्तिष्क के अलगाव के साथ ध्यान ब्याज के क्षेत्र की पहचान के लिए काफी आसान हो जाएगा. पशु euthanization निम्नलिखित के रूप में जल्दी संभव के रूप में ऊतकों को हटाने और कटाई और धुलाई के दौरान मस्तिष्क ठंडा रखने रहता है और अधिक कठोर और बहुत इसकी ढालना सेक्शनिंग स्टेनलेस स्टील में रखा गया है जब ऊतक से निपटने में सहायता करता है. यह भी सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान ऊतक के तेजस्वी के लिए संभावित कम करता है. प्रोटोकॉल भी एबीएल होने से लाभवे इन विट्रो में रखा जाता है एक बार इस सेल व्यवहार्यता बढ़ जाती है के रूप में ई, जल्दी चढ़ाना के मुद्दे पर कोशिकाओं पाने के लिए. पूर्व सेक्शनिंग के लिए उचित ऊतक धोने भी संस्कृतियों में संदूषण की क्षमता को कम मदद मिलती है. हदबंदी की प्रक्रिया के दौरान, एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ विचूर्णन जोरदार होना चाहिए, लेकिन सेल निलंबन जो नकारात्मक प्रभावों सेल अस्तित्व से अधिक बुलबुले या frothing उत्पन्न करने के रूप में नहीं एक तरीके से किया. यह nonattached कोशिकाओं का बहुमत है और स्टेम सेल की आबादी का प्रारंभिक अस्तित्व के लिए हानिकारक हैं कि कारकों में शामिल है जो ऊतक पृथक्करण की प्रक्रिया का परिणाम है कि एक सेलुलर मलबे को हटा के रूप में पहली मध्यम परिवर्तन भी महत्वपूर्ण है. Immunostaining के निम्न सुधार दृश्य के लिए, हौसले से अलग कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटें के तल में रखा 25 मिमी कांच coverslips पर चढ़ाया जा सकता है. पाली एल ओर्निथिन और कोटिंग में इस्तेमाल किया fibronectin की सांद्रता 500 माइक्रोग्राम / एमएल और 20 μ करने के लिए वृद्धि की जानी चाहिएजी / एमएल, क्रमशः. एक विकल्प के रूप में, कई छोटे coverslips (यानी 12 मिमी) अच्छी तरह से प्रत्येक में रखा जा सकता है. ये तो खाते में छोटे संस्करणों ले जाया करते थे धुंधला अभिकर्मकों की मात्रा कम करने, एक 24 अच्छी तरह से थाली की अलग कुओं में स्वतंत्र रूप से immunostaining के लिए कार्रवाई की जा सकती. coverslips तो एक मानक जलीय बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड पर बढ़ रहे हैं.

वयस्क दिमाग में एनएससी की उपस्थिति को परिभाषित तंत्रिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में प्रमुख ब्याज की है. एक स्टेम सेल की पहचान करने के लिए दो सामान्य तरीके हैं. एक में, सवाल में स्टेम सेल की आबादी का एक जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर आधारित बायोमार्कर का एक सेट immunohistochemistry द्वारा छवि उन्हें करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रयोगात्मक सरल है, यह कोई कार्यात्मक डेटा देता है, और न ही स्टेम सेल कोशिकाओं के मौलिक गुण है कि क्या परिभाषित करता है, स्वयं को नवीनीकृत या कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता. अन्य दृष्टिकोण में, कोशिकाओं ई में अलग कर रहे हैंither एक शुद्ध या विषम संस्कृति में रखा आबादी,, और वहाँ आत्म नवीकरण और multipotential गुण जीवित कोशिका जनसंख्या का उपयोग मूल्यांकन कर रहे हैं. यह दृष्टिकोण कार्यात्मक डेटा देता है, और स्पष्ट है कि इन विशेष रूप से इन विट्रो प्रयोगात्मक शर्तों में "stemness" साबित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, संस्कृति में इन कोशिकाओं को बनाए रखने के साथ कठिनाई यह दूसरा कार्यात्मक दृष्टिकोण रुकावट है. वास्तव में, मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों से एनएससी बढ़ने की अक्षमता जहां वे रहते हैं कुछ विशेष आलों ही कर रहे हैं कि छाप छोड़ दिया है.

यहाँ प्रस्तुत विधि सीएनएस के कई अलग अलग क्षेत्रों से एनएससी के संवर्धन के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक इन विट्रो और इन विवो दोनों में एनएससी की संख्या को नियंत्रित करने के लिए काफी महत्व की एक संकेत पारगमन मार्ग स्पष्ट है कि हमारे काम पर आधारित है. इस प्रोटोकॉल में शामिल कारकों व्यापक संकेत पारगमन के अध्ययन पर आधारित चयन किया गया था, वे एक आम प्रतिलेखन कारक Hes3 माध्यम एनएससी विकास को बढ़ावा देने कि प्रदर्शन है. हमारे पिछले अध्ययनों उन्हें व्यक्तिगत रूप से उपयोग की तुलना में जब इस विशेष संयोजन एनएससी संख्या में एक भी अधिक वृद्धि झुकेंगे बताते हैं कि. औषधीय समर्थन संस्कृति में जोड़ा जाता है जो की पसंद जीव विज्ञान का अध्ययन किया जा रहा है के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए. Ang2 और Dll4 दोनों एनएससी विकास पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, जबकि उदाहरण के लिए, वे vasculature गठन 22,23 पर प्रभाव का विरोध किया है. संस्कृति शर्तों के आगे अनुकूलन के माध्यम से, Hes3 परे अतिरिक्त उपन्यास बायोमार्कर की संभावना पहचाना जा और आगे भी वयस्क मस्तिष्क में एनएससी की मान्यता प्राप्त संख्या का विस्तार होगा. यह अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से Hes3 + सेल आबादी के बीच भेद किया जा सकता है कि हमारी टिप्पणियों द्वारा उदाहरण है. उदाहरण के लिए SVZ और एसीए से उन लोगों की तरह रीढ़ की हड्डी, से Hes3 + कोशिकाओं, इन के साथ जब सुसंस्कृत उनकी संख्या में कई गुना वृद्धि दिखानेकारकों. इसके अलावा, इन सभी क्षेत्रों से Hes3 + कोशिकाओं कुशलतापूर्वक न्यूरॉन्स astrocytes, और oligodendrocytes उत्पन्न कर सकते हैं. हालांकि, विभेदित सेल प्रकार की आकारिकी और जीन अभिव्यक्ति के समान नहीं है. विभिन्न Hes3 + प्रकार की कोशिकाओं के बीच भेद कि अतिरिक्त बायोमार्कर क्षेत्र के लिए एक स्वागत इसके अतिरिक्त होगा. एनएससी संस्कृतियों के कुशल पीढ़ी के लिए अनुमति यहाँ प्रस्तुत विधि इस लक्ष्य की दिशा में एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

एनएससी मार्करों nestin और Sox2 तरह, प्रतिलेखन कारक Hes3 तंत्रिका तंत्र, न्यूरॉन्स astrocytes, और oligodendrocytes 11 कि गठन प्रिंसिपल प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव के रूप में अलगाव पर के रूप में अच्छी तरह से इन विट्रो में प्रचारित किया जा सकता है कि एक सेल की आबादी को पहचानती है. हालांकि, इन और आमतौर पर इस्तेमाल मार्करों के विपरीत, Hes3 भी मौन एनएससी को दिखाता है, एक परिणाम के रूप में, कई Hes3 + कोशिकाओं homeostatic सी के तहत पिंजरे का बँटवारा के संकेतक (3 एच thymidine या BrdU) को शामिल नहीं करतेonditions (इस प्रकार और क्लासिक पता लगाने की तकनीक से परहेज किया है). यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग इस एनएससी आबादी की खोज में मौलिक था. विवो 24 में उनके परिवाहकीय स्थानीयकरण के साथ संगत पायदान ligand Delta4, और Angiopoetin2, सहित संवहनी endothelium से उत्पादित कारकों के साथ इलाज जब इन कोशिकाओं की संख्या संस्कृति में बढ़ जाती है.

वयस्क मस्तिष्क से अलग इन कोशिकाओं के लिए तैयार उपयोग करने के बाद प्रयोग कोशिकाओं विभिन्न कारकों के संकेत पारगमन स्तर पर कैसी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और कोशिकाओं vivo में कैसे प्रतिक्रिया करेगा के कुछ भविष्य कहनेवाला संकेत प्रदान करता है. पुनर्योजी चिकित्सा परे देख रहे हैं, हम यहाँ वर्णित संस्कृति शर्तों के रूप में अच्छी तरह से कैंसर अनुसंधान के लिए प्रासंगिक है कि प्रदर्शन किया. रोगी में, अध्ययन ओ के लिए अनुमति देता है, जबकि वे बेहतर Glioblastoma से अलग कैंसर स्टेम कोशिकाओं अनुभव मल्टीफार्मी कि पर्यावरण का प्रतिनिधित्वच उनके विकास 30 का विरोध करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है कि रास्ते संकेतन. इस तकनीक का व्यापक आवेदन अनुसंधान और चिकित्सा के कई पहलुओं के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

Helmholtz एसोसिएशन की पहल और नेटवर्क फंड, वरना Kroener-फ्रेसेनियस फाउंडेशन से अनुदान, और ड्यूश Forschungsgemeinschaft से अनुदान के माध्यम से इमेजिंग और इलाज पर्यावरण चयापचय रोगों (- यह काम Helmholtz एलायंस ICEMED द्वारा (भाग) वित्त पोषित किया गया SFB 655: ऊतकों में कोशिकाओं).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well tissue culture dishes BD Biosciences 353934
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P-3655

5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C).

Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin R&D Systems 1030-Fn Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus Corning Life Sciences 430769
DMEM/F-12 Mediatech 10-090-CV See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin Sigma-Aldrich T-2036
Insulin Sigma-Aldrich I-0516
Putrescine Sigma-Aldrich P-5780 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S-5261 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate Buffered Saline Mediatech 21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) R&D Systems 233-FB Working concentration 20 ng/ml 
Delta4 (Dll4) R&D Systems 1389-D4 Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2) R&D Systems 623-AN Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor Calbiochem 420099 Working concentration 200 nM 
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A-2058
15- and 50-ml Conical tubes Corning Life Sciences 430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15719
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma-Aldrich D-9663
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D-8417 5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin Chemicon MAB353

Dilution Factor: 1:400

Species: Mouse IgG1
Hes3 Santa Cruz sc-25393

Dilution Factor: 1:100

Species: Rabbit IgG
Sox2 R&D Systems MAB2018

Dilution Factor: 1:100

Species: Mouse IgG2a
CNPase Chemicon MAB326

Dilution Factor: 1:200

Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1) R&D Systems MAB1195

Dilution Factor: 1:500

Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako North America Z0334

Dilution Factor 1:500

Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568 Invitrogen A-21124

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488 Invitrogen A-21131

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5 Jackson ImmunoResearch 59883

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Rabbit

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 81 वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार भेदभाव सेल संस्कृति वृद्धि कारक
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Poser, S. W., Androutsellis-Theotokis, A. Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain. J. Vis. Exp. (81), e50880, doi:10.3791/50880 (2013).

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