Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Summary

Les cellules souches neurales récoltés dans le cerveau adulte sont de plus en plus utilisés dans des applications allant de la recherche fondamentale du développement du système nerveux à l'exploration des applications cliniques potentielles en médecine régénérative. Cela rend le contrôle rigoureux des conditions d'isolement et de culture utilisés pour cultiver ces cellules essentielles au son des résultats expérimentaux.

Abstract

Des travaux récents montrent que le système nerveux central (SNC), la régénération et la tumorigenèse implique des populations de cellules souches (SC) résidant dans le cerveau adulte. Cependant, les mécanismes de ces cellules normalement quiescentes emploient pour assurer le bon fonctionnement des réseaux de neurones, ainsi que leur rôle dans la récupération de blessures et d'atténuation des processus neurodégénératifs sont peu compris. Ces cellules se trouvent dans les régions appelées «niches» qui offrent un environnement maintien impliquant des signaux modulateurs à la fois le système vasculaire et le système immunitaire. L'isolement, l'entretien et la différenciation des CS CNS dans des conditions de culture définies qui excluent facteurs inconnus, qui les rend accessibles à un traitement par des moyens pharmacologiques ou génétiques, fournissant ainsi un aperçu de leur comportement in vivo. Nous vous proposons ici des informations détaillées sur les méthodes pour générer des cultures de Centres de SNC régions distinctes du cerveau adulte et approches pour évaluer leur dpotentiel de ifferentiation dans les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes et in vitro. Cette technique donne une population cellulaire homogène d'une culture en monocouche qui peut être visualisée à étudier SC individuel et leur descendance. En outre, il peut être appliqué sur différents systèmes de modèles animaux et des échantillons cliniques, utilisé précédemment pour prédire des réactions de régénération dans le système nerveux adulte endommagé.

Introduction

Le dogme central de la neurobiologie, prévue par les observations fondamentales de la cytoarchitecture de cerveau fait par Ramón Y. Cajal il ya plus d'un siècle, a estimé que la neurogenèse est peu probable après l'adolescence étant donné la complexité des réseaux de neurones présents dans le système nerveux central ^1. Malgré les travaux de Altman dans les années 1960, et plus tard Kaplan, ce qui démontre que ^{la 3H-thymidine} pourrait être trouvée dans les neurones matures indiquant que, en fait, les neurones ont été générés dans des zones distinctes du cerveau adulte, le dogme a continué à tenir ^{deux, trois.} La preuve a continué à monter avec la recherche de Nottebohm décrivant les changements saisonniers dans le nombre de neurones présents dans le cerveau des oiseaux chanteurs ^4. Ce n'était pas jusqu'en 1999, quand Gould et al travail. Publié sur la génération de neurones dans l'hippocampe augmente avec l'exécution des tâches d'apprentissage associatif chez le rat, ainsi que les observations de Kornack et Rakic ​​démonstrationTing a continué la neurogenèse chez le macaque adulte que le concept d'un cerveau moins rigide, plus plastique, a été reconnu ^{5, 6.}

La recherche de la source cellulaire de ces neurones générés de novo conduit à la découverte d'une population distincte de cellules souches (CS) qui résident dans les zones du cerveau appelée niches ^7. La zone sous-ventriculaire et la zone granulaire sous de l'hippocampe sont considérés comme les deux principales régions neurogènes ^8,9. Cellules isolées à partir de ces endroits présentent la caractéristique classique de CS dérivés embryonnaires ou fœtales, l'auto-renouvellement et potentiel de différenciation. Dans le cas des cellules souches neurales (NSC), ils peuvent être différenciées en neurones, astrocytes et oligodendrocytes,. En outre, ces SCs tache positive pour les marqueurs du CNS tels que la foetales intermédiaire nestine de protéine de filament ^10. Des travaux plus récents souligne que les conseils sectoriels pourraient ne pas se limiter à ces Two domaines, et sont en fait localisée dans le cerveau comme une population en grande partie de repos de cellules étroitement associés à la vascularisation ^11.

Les observations que les CS sont mobilisés en réponse à une blessure suggère la possibilité d'être en mesure d'utiliser ces cellules à des fins de régénération pour aider à la récupération de maladie neurodégénérative et course ^{12, 13.} Cela n'est pas sans rappeler le rôle que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) jouent dans la cicatrisation des tissus conjonctifs, qui sont présents sous forme de cellules périvasculaires qui ont le potentiel de devenir des ostéoblastes, les chondrocytes, les cellules adipeuses et ^14. Cependant, les CNS ne peuvent être récoltées de la même manière que les cellules souches mésenchymateuses à partir de la moelle osseuse par aspiration de routine et les techniques de centrifugation à gradient de densité et par la suite utilisées dans les thérapies à base de cellules autologues. En conséquence, d'autres sources de cellules, telles que l'utilisation de NNC foetales ou des précurseurs neuronaux issus de embcellules souches ryonic ont été largement explorée dans la maladie de modèles animaux et de blessures avec différents degrés de succès ^15. Technologies de cellules souches pluripotentes induites utilisant des sources de cellules somatiques offrent un autre moyen potentiel pour produire des thérapies à base de cellules thérapeutiquement utiles pour un large éventail d'applications, en surmontant la disponibilité limitée et des préoccupations éthiques concernant l'utilisation des cellules embryonnaires et les tissus fœtaux ^16. Cependant, la traduction clinique de ces résultats s'est avéré être une tâche difficile, comme l'a démontré dans les luttes de traitement de divers troubles neurologiques avec thérapeutiques à base SC approches ^17,18, ainsi que d'un chemin tortueux à l'autorisation réglementaire. Comme une approche alternative, l'introduction de traitements pharmacologiques spécifiques peut moduler le nombre de CSN et de faciliter la récupération dans les modèles de la maladie de Parkinson et les AVC ^19. Quelle que soit la stratégie pourrait être, de comprendre comment manipuler efficacement ces cellulesexige un système in vitro accessible.

Cultures du CNS peuvent être réalisés soit sous forme de cultures globales, aussi appelées neurosphères, ou comme une monocouche ^8,20. Les deux techniques ont été largement utilisés, ce qui permet l'établissement de conditions de culture définies, à savoir l'utilisation de facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) en tant que source de mitogène, qui assurent l'expansion de précurseurs multipotentes. Bien que les cultures de neurosphères peuvent être mieux adaptés à l'étude de la capacité de propagation clonale d'un type de cellule isolée, le système a été montré pour produire une population mixte de cellules lors de la détente ^21. En outre, la structure fermée de neurosphères rend la manipulation pharmacologique des cellules peu pratique, et l'interprétation de l'influence de ces facteurs peuvent avoir pourrait être confondue en raison du microenvironnement établi dans la neurosphère lui-même. Des cultures monocouches, d'autre part, peuvent êtreutilisé dans les écrans à haut débit de banques de petites molécules, en fournissant un outil puissant pour explorer les mécanismes de transduction du signal qui régulent la croissance et la différenciation SC et ouvre la possibilité de découvrir de nouveaux composés qui ciblent spécifiquement cette population de cellules.

En conséquence, la capacité de générer de manière reproductible des cultures de NNC adultes provenant de différentes régions d'intérêt dans le cerveau peut être utilisée dans un large éventail d'applications de recherche, allant d'études sur le développement du système nerveux central (SNC) à explorer de nouvelles approches de la médecine régénérative . Le protocole présenté ici montre comment disséquer et évaluer le potentiel de différenciation de SNC Centres isolés du cerveau de rongeur adulte.

Protocol

Le travail adhère à la Déclaration de Helsinski et l'état des animaux ARVO. Les animaux ont été utilisés pour la collecte des tissus et toutes les méthodes pertinentes ont été suivies selon les instructions de l'animalerie de l'Université de Dresde. Les animaux ont été manipulés et logés selon les lignes directrices fédérales allemandes pour l'utilisation et l'entretien des animaux de laboratoire, et l'étude a été approuvé par le Landesdirektion Dresde. S'il vous plaît consulter la politique vétérinaire de votre établissement (IACUC ou autre conseil) en ce qui concerne la méthodologie de l'euthanasie approprié.

Concentrations de travail de réactifs actions spécifiques et peuvent être trouvés dans les tableaux accompagnant ce protocole réactif.

Une. Culture vaisselle Préparation

1. Manteau de plats avec un volume suffisant de 75 pg / ml de poly-L-ornithine (soit 2 ml / puits d'une plaque à 6 puits) pendant une nuit dans l'incubateur de culture de cellules 2 jours avant la date prévue de dissection.
2. Retirez le lavage final, puis ajouter la fibronectine (dilué 1:250, 4 ug / ml dans PBS) à la plaque et placez les plats dans l'incubateur pendant la nuit.
3. Aspirer la fibronectine, le jour de la dissection et de lavage des plats 2x avec du PBS. Remettre les plaques contenant encore la finale PBS laver à l'incubateur jusqu'à ce que le tissu dissocié est prêt pour la culture. À ce moment, retirer la PBS avant l'étalement du tissu.
4. plaques de magasins recouvertes de poly-L-ornithinein l'incubateur pendant jusqu'à 3 semaines. Des plaques recouvertes de fibronectine peuvent être stockées pendant 1 semaine. revêtement de fibronectine peut être fait en aussi peu que 2 heures si urgent. La fibronectine est sensible à la dénaturation, ne pas agiter la solution ou laissez sécher la vaisselle.

2. Dissection / placage

1. Ce protocole s'applique à l'utilisation de trois rats adultes (3-6 mois d'âge).
2. Chill le cerveau sectionnement bloc sur la glace avant l'euthanasie chez le rat.
3. Placer un tube Falcon de 15 ml contenant 5 ml de milieu N2 avec bFGF ajouté sur de la glace.
4. Euthanasier les rats conformément à la politique vétérinaire de votre institution.
5. Retirer le cerveau du crâne en faisant une incision de la ligne médiane vers le bas de la tête. Utilisez une pince à décoller de l'os permettant au cerveau pour être soigneusement extrait.
6. Placez le cerveau dans une boîte de 10 cm de Pétri contenant glacée PBS. Cela permettra d'éliminer tous les poils résiduelle et le sang. (Figure 1A)
7. Placer le cerveau dans le bloc de sectionnement réfrigérés. (Figure 1B)
8. Insérez une nouvelle lame de rasoir propre dans le bloc comme illustré à la figure 1C.
9. Insérer un second mm caudal rasoir propre pale 3 à la première, comme illustré sur la figure 1D.
10. Soulevez délicatement les lames du bloc, emportant avec eux la section d'intérêt.
11. Faire flotter le section de la lame en l'immergeant dans du PBS. (Figure 1E)
12. tissu de récolte de la zone d'intérêt (dans cet exemple, nous avons utilisé la commissure antérieure, (antérieure) ACA, figure 1F) en utilisant # 5 forceps et recueillir dans un tube conique de 15 ml contenant 1 ml de milieu N2 contenant bFGF.
13. Déplacer le tube dans une hotte de culture de cellules à flux laminaire, en continuant le reste du protocole en conditions stériles.
14. Mécaniquement dissocier le tissu à l'aide d'une pipette de 1 ml attaché à une pipette P1000. Introduire à la pipette de haut en bas plusieurs fois (environ 20 fois à raison de 1 cycle de pipetage par seconde) tout en appuyant sur ​​l'ouverture de la pointe de la pipette contre le fond du tube conique (figures 1G 1-3). Arrêtez trituration quand la solution devient homogène.
15. Laisser reposer la solution pendant 2 minutes pour permettre à tout le tissu non dissociée plus grande à se déposer au fond. (Figure 1G 4)
16. Recueillir le homogeneous surnageant et le placer dans un tube conique contenant 8,5 ml de milieu N2 plus 20 ng ml de bFGF /, 500 ng ml Dll4 /, 500 ng / ml Ang2, et 200 nMJAK inhibiteur.
17. Plate-les dans 3 puits d'une plaque à 6 puits à l'aide de 3 ml de solution cellulaire diluée / puits.
18. Placer la plaque dans un incubateur humidifié de cellules à 37 ° C, 5% de CO _2, 5% d'O _2.

3. Entretien quotidien

1. Remplacez le support sur les boîtes de culture avec N2 milieu contenant bFGF, Ang2, Dll4, et JAK inhibiteur 24 heures après placage.
2. Ajouter un bolus de bFGF, Dll4, Ang2, et l'inhibiteur de JAK le jour suivant.
3. Continuez ce processus alternatif de changements des médias et des ajouts de facteurs pour un total de 10-14 jours.

4. L'induction de la différenciation

1. Retirer bFGF, Dll4, Ang2, et JAK inhibiteur contenant du milieu et de le remplacer par un milieu N2 qui ne contient pas de facteurs supplémentaires.
2. Changez le milieu tous les deux jours.
3. Fixer les cellules après 10 jours et d'effectuer immunocytochimie.

5. Détection immunocytochimique

1. Aspirer le milieu et fixer des plaques de culture de cellules avec 2 ml de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min.
2. Laver 2 fois avec 3 ml de PBS pendant 5 min chacun.
3. Aspirer le PBS, puis bloquer et perméabiliser les cellules par addition de 2 ml de PBS contenant 5% de sérum normal d'âne (NDS) et 0,1% de Triton X-100 pendant 20 min.
4. Préparer le mélange d'anticorps primaire dans du PBS contenant 5% de NDS. Anticorps anti-nestine peut être utilisé pour identifier SC, tandis que Tuj1 (classe III β-tubuline), anticorps GFAP, et CNPase peut être utilisé pour un triple coloration de marqueurs de différenciation.
5. Aspirer la solution de blocage et ajouter 1,5 ml du mélange d'anticorps primaire à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 90 min.
6. Retirez les anticorps primaires et laver 2 fois avec 3 ml de PBS, et 1x avec 3 ml de PBS contenant 5% de NDS pour 5 min chacun.
7. Prepare les anticorps secondaire dans du PBS contenant 5% de NDS.
8. Aspirer le lavage final et ajouter 1,5 ml de solution d'anticorps secondaire dans chaque puits. Incuber dans l'obscurité pendant 40 min à température ambiante.
9. Retirer la solution d'anticorps secondaire et ajouter 2 ml d'une tache DAPI fraîchement préparé (500 ng / ml dans du PBS). Incuber pendant 3 min.
10. Aspirer la solution DAPI puis laver 3 fois avec 3 ml de PBS pendant 5 min chacun. Les cellules peuvent maintenant être visualisées avec un microscope à fluorescence.

Representative Results

L'identification de la région d'intérêt à partir de laquelle la récolte de cellules souches neurales est la première étape critique et définir la quantité de temps qu'il faut pour obtenir une plaque de cellules confluentes. Par exemple, la SVZ est une région neurogène classique et a une proportion relativement plus élevée de cellules souches neurales donc. Cependant, la technique présentée ici peut être utilisé avec d'autres régions pas souvent reconnus comme ayant un potentiel neurogène robuste à l'âge adulte. Pour les fins du présent protocole, nous avons utilisé la commissure antérieure (partie antérieure). Bien que certaines des cellules et des débris se déposera sur le placage, le support sera normalement rester trouble par suite de la quantité de matière cellulaire qui est présente trituration de ce qui suit. Le premier changement de milieu à 24 h va supprimer la majorité de cette. Comme visualisé par microscopie optique, il y aura semble y avoir une grande quantité de matériel cellulaire reste, avec les vaisseaux sanguins, même après le premier changement de milieu. Au cours de l'les prochains jours, les colonies d'une population de cellules proliférantes distinct deviennent visibles sous le microscope (figure 2A). Ce sont les cellules souches neurales qui ont été sélectionnées pour la croissance par l'utilisation d'un milieu N2 contenant bFGF, Ang2, Dll4, et l'inhibiteur de JAK. En outre, une population de cellules en forme de broche de forme plus allongée peut également être présente (figures 2B et   C). Ce ne sont pas des cellules souches neurales (glie radiale probablement basée sur la morphologie et la coloration), ils finiront par être dépassés par la prolifération de neurones population plus rapide sur les cellules souches. Au cours d'une semaine à 14 jours, les cellules deviennent plus dense jusqu'à ce qu'elles atteignent la confluence (Figure 2D). Ces cultures se colorent positif pour un certain nombre de marqueurs de cellules souches, y compris Nestin, Hes3, et Sox2. (Figures 2E-H), créant ainsi une confiance que les populations de cellules qui ont été choisis et élargis sont en effet des cellules souches neurales.Une autre confirmation vient de la capacité de retrait à partir du milieu du FGF, ce qui permet aux cellules de se différencier pendant 10 jours pour produire des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes, (Figure 2I).

Figure 1: Isolement des coupes de cerveau de rat pour les cellules souches neurales adultes récolte. A) cerveau adulte de rat après lavage avec du PBS. B) de cerveau de rat placé dans un acier inoxydable refroidi sectionnement bloc. C) le positionnement approximatif des lames de rasoir initiales à l'intérieur du bloc pour produire des coupes coronales du cerveau. D) placement de deux lames de rasoir supplémentaires dans le bloc de sectionnement. Remarque, plus minces lames à double tranchant ont été utilisés à des fins de démonstration pour permettre plus facile la visualisation des sections dans le bloc. E) sections coronales de cerveau contenant des zones à être récoltés. F) Schéma de l'atlas du cerveau Paxinos soulignant la zone sous-ventriculaire comme une région neurogène classique, et la commissure antérieure dont les cellules ont été récoltées pour ce protocole. G) des images séquentielles du processus de dissociation de tissu à l'aide d'une pipette de 1 ml fixée à une micropipette P1000. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2: Les cellules souches adultes de neurones in vitro. A) la culture de cellules souches neurales adultes après une semaine. B) des exemples de plus grandes cellules broche de morphologie (red flèches) présentent parfois dans les cultures qui ne sont pas des cellules souches neurales. C, D) dans les conditions de culture définies dans ce protocole, les cellules souches neurales développer préférentiellement. EH) Expression de marqueurs de cellules souches neurales après 14 jours in vitro, Sox2 (vert) (E), Hes 3 (rouge) (F), et la nestine (violet) (G). I) Différenciation des cellules souches neurales en neurones, astrocytes et oligodendrocytes,. Après le retrait de mitogène, les cellules ont été autorisés à se différencier pendant 10 jours, puis immunocolorées pour GFAP (vert), Tuj1 (rouge), et CNPase (bleu). Immunomarquage J) Hes3 dans le cerveau de rat adulte. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Un grand nombre des étapes critiques de l'isolement, de l'expansion et la différenciation des cellules souches neuronales du cerveau adulte sont partagées en commun par des techniques de culture tissulaire standard. L'objectif de garder à l'esprit est que les CNS isolés du cerveau adulte devrait maintenir le plus grand nombre de leurs caractéristiques in vivo que possible (Figure 2J). Souvent un équilibre entre la prudence nécessaire et la vitesse appropriée doit être trouvé. Un soin avec l'isolement du cerveau du crâne va faire l'identification de la région d'intérêt sensiblement plus facile. Retrait du tissu le plus rapidement possible après l'euthanasie des animaux, et en maintenant le froid du cerveau pendant la récolte et le lavage maintient plus rigide et aide à la manipulation du tissu quand il est placé dans le moule en acier inoxydable fortement sectionnement. Cela minimise également le risque de déchirure du tissu au cours de la procédure de découpe. Le protocole bénéficie également d'être able pour obtenir les cellules au point de plaquage rapidement, car cela augmente la viabilité des cellules une fois qu'elles sont placées in vitro. Le lavage des tissus appropriée avant la coupe permet également de réduire le risque de contamination dans les cultures. Pendant le processus de dissociation, la trituration avec un embout de pipette de 1 ml doit être énergique, mais faite de manière à ne pas générer de bulles en excès ou moussage de la suspension cellulaire qui a un impact négatif de survie des cellules. Le premier changement de milieu est également indispensable, car il élimine la majorité des cellules et un nonattached débris cellulaires qui résulte du processus de dissociation de tissu qui contient des facteurs qui sont nuisibles à la survie de la population initiale de cellules souches. Pour une meilleure visualisation suivant immunomarquage, les cellules fraîchement isolées peuvent être étalées sur des lamelles couvre-objet de 25 mm de verre placées dans la partie inférieure des plaques à 6 puits. Les concentrations de poly-L-ornithine et de la fibronectine utilisé dans le revêtement devrait être augmenté à 500 pg / ml et 20 μg / ml, respectivement. En variante, de multiples lamelles de petite taille (12 mm) peuvent être placés dans chaque puits. Ceux-ci peuvent ensuite être traitées pour immunomarquage indépendamment dans des puits séparés d'une plaque de 24 puits, révision à la baisse des quantités de réactifs de coloration utilisées pour tenir compte des petits volumes. Les lamelles sont ensuite montées sur des lames en utilisant un milieu de montage aqueux standard.

Définition de la présence de NNC dans le cerveau adulte est d'un intérêt majeur dans le domaine de la neurobiologie. Il existe deux approches générales pour identifier une cellule souche. Dans l'un, un ensemble de marqueurs biologiques basés sur un profil d'expression génique de la population de cellules souches en question peut être utilisé pour les images par immunohistochimie. Bien expérimentalement simple, il ne donne pas de données fonctionnelles, ni définit si les cellules présentent les propriétés fondamentales des cellules souches, la capacité de s'auto-renouveler ou de se différencier en de nombreux types de cellules différents. Dans l'autre approche, les cellules sont isolées dans either une population pure ou hétérogène, la mise en culture, et il renouvellement de soi et des propriétés pluripotentes sont évalués à l'aide de la population de cellules vivantes. Cette approche fournit des données fonctionnelles, et peut être utilisée pour prouver sans équivoque "caractère souche" dans ces conditions expérimentales particulières in vitro. Cependant, la difficulté de maintenir ces cellules en culture a empêché cette deuxième approche fonctionnelle. En fait, l'incapacité à se développer CNS d'autres zones du cerveau a laissé l'impression qu'il n'y a que quelques niches spécialisées où ils résident.

La méthode présentée ici permet la culture de NNC de nombreux domaines du système nerveux central. Cette technique est basée sur notre travail a élucidé une voie de transduction du signal d'une grande importance pour le contrôle du nombre de NNC à la fois in vitro et in vivo. Les facteurs inclus dans ce protocole ont été choisis sur la base des études approfondies de transduction du signal, Démontrant qu'ils favorisent la croissance NSC via un facteur de transcription commun Hes3. Nos études antérieures montrent que cette combinaison particulière a abouti à une augmentation encore plus importante du nombre de CSN par rapport à leur utilisation individuelle. Le choix du support pharmacologique est ajouté à la culture doit être considérée dans le contexte de la biologie de l'étude. Par exemple, alors que les deux Ang2 et Dll4 ont un impact positif sur la croissance NSC, ils ont des effets opposés sur la formation du système vasculaire ^22,23. Grâce à d'autres l'optimisation des conditions de culture, de nouveaux biomarqueurs supplémentaires au-delà Hes3 seront probablement identifiés et élargir le nombre reconnu de NNC dans le cerveau adulte encore plus loin. Ceci est illustré par les observations que les distinctions entre la population de cellules Hes3 + à partir de différentes zones du cerveau peuvent être faites. Par exemple Hes3 + cellules de la moelle épinière, comme ceux de la SVZ et ACA, montrent une augmentation de plusieurs fois dans leur nombre, lorsqu'il est cultivé avec cesfacteurs. En outre, Hes3 + cellules de toutes ces régions peuvent efficacement générer des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes,. Toutefois, l'expression du gène de la morphologie et les types de cellules différenciées ne sont pas identiques. Biomarqueurs supplémentaires qui distinguent entre les différents types de cellules Hes3 + sera un ajout bienvenu sur le terrain. La méthode présentée ici permet pour la génération efficace des cultures NSC peut être utilisé comme un outil pour atteindre cet objectif.

Comme les marqueurs de la nestine NSC et Sox2, le facteur de transcription Hes3 identifie une population de cellules qui sur l'isolement peuvent être propagées in vitro aussi bien que différenciées en les principaux types de cellules qui constituent le système nerveux, les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes et ^11. Cependant, contrairement à ces marqueurs les plus couramment utilisés, Hes3 identifie également CNS repos; par conséquent, de nombreuses cellules Hes3 + ne tiennent pas compte des indicateurs de la mitose ⁽³ H-thymidine ou BrdU) sous c homéostatiqueonditions (et donc ont évité les techniques de détection classiques). L'application du protocole décrit ici est fondamentale dans la découverte de cette population NSC. Le nombre de ces cellules augmente en culture lorsqu'elles sont traitées avec des facteurs produits à partir de l'endothélium vasculaire, y compris le ligand de Notch Delta4, et Angiopoetin2, compatible avec leur localisation périvasculaire in vivo ^24.

Avoir un accès immédiat à ces cellules isolées du cerveau adulte permet d'expérimentation afin d'examiner comment les cellules répondent au niveau de transduction du signal à divers facteurs, et fournit quelques indications prédictives de la façon dont les cellules répondent in vivo. Au-delà de la médecine régénérative, nous avons démontré que les conditions de culture décrites ici ont un intérêt pour la recherche sur le cancer ainsi. Ils représentent mieux l'environnement que les cellules souches du cancer isolé de glioblastome multiforme expérience tout chez le patient, permettant l'étude of voies qui peuvent être manipulés pour s'opposer à leur ³⁰ croissance de signalisation. La large application de cette technique pourrait avoir des implications importantes pour les multiples aspects de la recherche et de la médecine.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit