Växande neurala stamceller från konventionella och icke-konventionella Regioner av vuxen Gnagare Brain

Summary

Neurala stamceller skördas från den vuxna hjärnan ökande utnyttjas i allt från grundläggande forskning av nervsystemets utveckling att utforska potentiella kliniska tillämpningar inom regenerativ medicin. Detta gör rigorös kontroll i isolerings-och odlingsförhållanden som används för att odla dessa celler kritiska att låta experimentella resultat.

Abstract

Senaste arbete visar att det centrala nervsystemet (CNS) förnyelse och tumörbildning involverar populationer av stamceller (SCS) är bosatta i den vuxna hjärnan. Men mekanismerna dessa normalt vilande celler använder för att säkerställa väl fungerande neurala nätverk, samt deras roll i återhämtning från skada och begränsning av neurodegenerativa processer är lite förstås. Dessa celler är bosatta i områden som anges som "nischer" som ger en stödjande miljö med modulerande signaler från både kärl-och immunsystem. Isoleringen, underhåll och differentiering av CNS kaster under definierade odlingsbetingelser som utesluter okända faktorer, gör dem tillgängliga för behandling av farmakologiska eller genetiska metoder, vilket ger inblick i deras uppträdande in vivo. Här erbjuder vi detaljerad information om de metoder för att generera kulturer av CNS kaster från olika områden i den vuxna hjärnan och metoder för att bedöma deras differentiation potential till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter in vitro. Denna teknik ger en homogen cellpopulation som ett monolager kultur som kan visualiseras för att studera enskilda kaster och deras avkomma. Dessutom kan den tillämpas i olika djurmodellsystem och kliniska prover, som använts tidigare för att förutsäga regenerativa svar på den skadade vuxna nervsystemet.

Introduction

Den centrala dogmen om neurobiologi, som föreskrivs i de grundläggande observationer av hjärnan cytoarchitecture gjorts av Ramón Y. Cajal över hundra år sedan, ansåg att neurogenes var osannolikt efter tonåren med tanke på komplexiteten i neurala nätverk som finns i CNS ^1. Trots det arbete Altman på 1960-talet, och senare Kaplan, visar att ³ H-tymidin kunde hittas i mogna nervceller som indikerar att det faktiskt nervceller genereras i olika områden i den vuxna hjärnan, dogmen fortsatte att hålla ^{2, 3.} Bevis fortsatt att öka med Nottebohm forskning som beskriver de säsongsmässiga förändringar i antalet nervceller som finns i songbird hjärnor ^4. Det var inte förrän 1999, då Gould et al. Publicerade arbetet med generering av nervceller i hippocampus ökar med utförandet av associativa inlärningsuppgifter i råtta, samt observationer av Kornack och Rakic ​​demonstrationsning fortsatt neurogenes i den vuxna makak att begreppet en mindre stel, mer plastisk hjärna, erkändes ^{5, 6.}

Sökandet efter den cellulära källan för dessa de novo genererade nervceller leder till upptäckten av en diskret population av stamceller (SCS) som bor i områden av hjärnan kallas nischer ^7. Den subventrikulära zonen och sub granulat zon av hippocampus anses vara de två huvudsakliga neurogena regioner ^8,9. Celler som isolerats från dessa platser visar den klassiska kännetecken för embryon eller foster härledda kaster, självförnyelse och differentiering potential. I fallet med neurala stamceller (NSCs), de kan differentieras till neuron, astrocyter och oligodendrocyter. Dessutom är dessa SCS färgas positivt för fetala NSC markörer såsom det mellanliggande filamentproteinet nestin ^10. Senare arbete belyser att kaster inte skulle begränsas till dessa two områden, och är i själva verket lokaliserade i hela hjärnan som en stor del vilande population av celler tätt förknippade med kärlsystemet ^11.

Observationerna som kaster mobiliseras som svar på skada föreslår möjligheten att kunna använda dessa celler för regenerativ ändamål till stöd i återhämtningen från neurodegenerativ sjukdom och stroke ^{12, 13.} Detta är inte helt olikt den roll som mesenkymala stamceller (MSC) spelar i läkning av bindväv, som finns som perivaskulära celler som har potential att bli osteoblaster, kondrocyter och fettceller ^14. Däremot kan NSCs inte skördas på samma sätt som MSC från benmärg genom rutin aspiration och densitetsgradientcentrifugering tekniker och därefter utnyttjas i autologa cellbaserade terapier. Som en följd av andra källor av celler, såsom användningen av fetala NSCs eller neuronala prekursorer härledda från embryonic stamceller har stor omfattning undersökts i djursjukdomar och skademodeller med varierande framgång ^15. Inducerade pluripotenta stamcellsteknik som utnyttjar somatisk cellkällor ger en annan potentiell väg för att producera terapeutiskt användbara cellbaserade terapier för ett brett spektrum av applikationer, övervinna den begränsade tillgången och etiska frågor när det gäller användning av embryonala celler och fostervävnader ^16. Emellertid har kliniska översättningen av dessa rön visat sig vara en svår uppgift, vilket visas i den kamp för att behandla olika neurologiska tillstånd med SC-baserade behandlingsmetoder ^17,18, samt en slingrande väg till reglerande godkännande. Som ett alternativt tillvägagångssätt, kan införandet av specifika farmakologiska behandlingar modulera NSC siffror och underlätta återhämtningen i modeller av Parkinsons sjukdom och stroke ^19. Oavsett strategi kan vara, att förstå hur effektivt att manipulera dessa cellerkräver en tillgänglig in vitro-system.

Kulturer av NSCs kan utföras antingen som aggregerade kulturer, även känd som neurosfärer, eller som ett monolager ^8,20. Båda teknikerna har använts i stor utsträckning, vilket möjliggör inrättandet av definierade odlingsbetingelser, det vill säga användning av epidermal tillväxtfaktor (EGF) eller basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) som en mitogen källa, som ger för utbyggnad av multi prekursorer. Medan neurosfärkulturer kan vara bättre lämpade för att studera klonal förökning förmåga av en isolerad celltypen, systemet har visat sig ge en blandad population av celler under expansion ^21. Dessutom den slutna strukturen hos neurosfärer gör farmakologisk manipulation av cellerna opraktisk, och tolkningen av det inflytande dessa faktorer kan ha skulle kunna blandas ihop på grund av den mikromiljö som är etablerad inom neurosfären självt. Monoskiktkulturer, å andra sidan, kan varasysselsatta i hög genomströmning skärmar av små molekyler bibliotek, som ger ett kraftfullt verktyg för att utforska de signalöverföringsmekanismer som reglerar SC tillväxt och differentiering och öppnar möjligheten att upptäcka nya substanser som specifikt riktar denna cellpopulation.

Som en följd, kan förmågan att reproducerbart generera kulturer av vuxna NSCs från olika regioner av intresse i hjärnan användas i ett brett spektrum av forskningsansökningar, allt från utvecklingsstudier i det centrala nervsystemet (CNS) för att utforska nya regenerativ medicin metoder . Protokollet presenteras här visar hur man dissekera och utvärdera differentieringspotential CNS kaster isolerade från den vuxna gnagare hjärnan.

Protocol

Arbetet följer den förklaringen om Helsinski och djur Statement ARVO. Djur användes för vävnads insamling och alla relevanta metoder följdes enligt instruktionerna i djuranläggningen vid universitetet i Dresden. Djuren hanteras och inrymt i enlighet med den tyska federala riktlinjer för användning och skötsel av försöksdjur, och studien godkändes av Landesdirektion Dresden. Rådgör med din institutions veterinärpolitik (IACUC eller annan styrelse) angående lämpliga dödshjälp metodik.

Specifika lager-och arbets koncentrationer av reagens finns i reagens tabeller som åtföljer detta protokoll.

1. Kultur Dish Förberedelse

1. Coat rätter med en tillräcklig volym av 75 mikrogram / ​​ml poly-L-ornitin (dvs. 2 ml / brunn i en 6-brunnar) över natten i cellodling inkubatorn 2 dagar före utsatt dissektion dagen.
2. Ta bort den sista tvätten, lägg sedan till fibronektin (utspätt 1:250, 4 mikrogram / ml i PBS) på plattan och placera rätter i inkubatorn natten.
3. Aspirera fibronektin på dagen för dissektion och diska 2x med PBS. Återgå plattorna fortfarande innehåller den slutliga PBS tvätta till inkubatorn tills dissocierade vävnaden är redo för odling. På den tiden, ta bort PBS före plätering vävnaden.
4. Store plattor belagda med poly-L-ornithinein inkubatorn under upp till 3 veckor. Plattor belagda med fibronektin kan lagras under upp till en vecka. Fibronektin beläggning kan göras på så lite som 2 timmar om brådskande. Fibronektin är mottaglig för denaturering, inte agitera lösningen eller låt disken torka.

2. Dissection / Plätering

1. Detta protokoll gäller för användning av 3 vuxna råttor (3-6 månader gamla).
2. Chill hjärnan sektioneblocket på is före euthanizing råtta.
3. Placera en 15 ml Falcon rör som innehåller 5 ml N2-medium med tillsatt bFGF på is.
4. Euthanize råttorna enligt institutionens veterinärpolitiken.
5. Ta bort hjärnan från skallen genom att göra ett snitt ner mittlinjen av huvudet. Använd pincett för att skala bort benet gör det möjligt att hjärnan ska ut försiktigt.
6. Placera hjärnan i en 10 cm petriskål med iskall PBS. Detta kommer att ta bort alla rester av hår och blod. (Figur 1A)
7. Placera hjärnan in i den kylda snittblocket. (Figur 1B)
8. Sätt i en ny ren rakblad in i blocket enligt bild 1C.
9. Sätt i en andra ren rakblad 3 mm kaudalt till den första såsom visas i figur 1D.
10. Lyft försiktigt bladen från blocket, tar med sig den del av intresse.
11. Flyta sektion av bladet genom nedsänkning i PBS. (Figur 1E)
12. Harvest vävnad från det intressanta området (i det här exemplet använde vi den främre commissure, (främre) ACA, Figur 1F) med # 5 pincett och samla in ett 15 ml koniskt rör innehållande 1 ml N2 medium innehållande bFGF.
13. Flytta röret i ett laminärt flöde cellodling huv, fortsätter resten av protokollet under sterila betingelser.
14. Mekaniskt dissociera vävnaden genom att använda en 1 ml pipettspets fäst till en P1000 pipett. Pipette upp och ned flera gånger (ungefär 20x med en hastighet av en pipetterings cykel per sekund) samtidigt med öppnandet av pipettspetsen mot botten av det koniska röret (fig. 1G 1-3). Stoppa rivning när lösningen blir homogen.
15. Låt lösningen stå under 2 min för att tillåta någon större nondissociated vävnaden sedimentera till botten. (Figur 1G 4)
16. Samla upp homogenexportorienterade supernatanten och placera in i ett koniskt rör innehållande 8,5 ml N2 medium plus 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2, och 200 nMJAK Inhibitor.
17. Plåt dem i tre brunnar i en 6-brunnsplatta med användning av 3 ml av en utspädd celllösning / brunn.
18. Placera plattan i en fuktig cellinkubator vid 37 ° C, 5% _CO2, 5% _O2.

3. Daily Care

1. Byt mediet på kultur rätter med N2 medium innehållande bFGF, Ang2, Dll4, och JAK-hämmare 24 timmar efter plätering.
2. Lägg till en bolus av bFGF, Dll4, Ang2, och JAK-hämmare på nästa dag.
3. Fortsätt denna alternerande process av medie förändringar och faktor tillägg för totalt 10-14 dagar.

4. Induktion av differentiering

1. Dra bFGF, Dll4, Ang2, och JAK-hämmare innehållande medium och ersätta den med N2 medium som inte innehåller några ytterligare faktorer.
2. Ändra mediet varannan dag.
3. Fixera cellerna efter 10 dagar och utför immuncytokemi.

5. Immunocytokemisk Detektion

1. Aspirera medium och fixera cellkulturplattor med 2 ml av 4% paraformaldehyd under 20 min.
2. Tvätta 2x med 3 ml av PBS under 5 min vardera.
3. Aspirera PBS och sedan permeabilisering och blockera cellerna genom tillsats av 2 ml PBS innehållande 5% normal donkey serum (NDS) och 0,1% Triton X-100 i 20 min.
4. Förbered den primära antikroppen blandningen i PBS innehållande 5% NDS. Anti-nestin-antikroppen kan användas för identifiering av SCS, medan TuJ1 (klass III β-tubulin) kan GFAP och CNPase antikroppar användas tillsammans för en trippelfärgning av differentieringsmarkörer.
5. Aspirera den blockerande lösningen och tillsätt 1,5 ml av den primära antikroppsblandningen till varje brunn. Inkubera vid rumstemperatur i 90 min.
6. Ta bort de primära antikropparna och tvätta 2x med 3 ml PBS, och 1x med 3 ml PBS innehållande 5% NDS för 5 min vardera.
7. Förberedere de sekundära antikroppar i PBS innehållande 5% NDS.
8. Aspirera slutlig tvätt och tillsätt 1,5 ml av en sekundär antikroppslösning till varje brunn. Inkubera i mörker under 40 min vid rumstemperatur.
9. Ta bort den sekundära antikroppslösningen och tillsätt 2 ml av en nyberedd DAPI-infärgning (500 ng / ml i PBS). Inkubera under 3 min.
10. Aspirera DAPI-lösning sedan tvätta 3x med 3 ml PBS under 5 min vardera. Cellerna kan nu åskådliggöras med ett fluorescensmikroskop.

Representative Results

Identifiera den intressanta området för att skörda neurala stamceller är den kritiska första steget och kommer att definiera den tid det tar att få ett konfluent platta med celler. Till exempel är SVZ en klassisk neurogen område och därför har en högre relativ proportion av neurala stamceller. Däremot kan den teknik som presenteras här kan användas med andra regioner inte ofta anses ha robust neurogen potential i vuxen ålder. Vid tillämpningen av detta protokoll, använde vi den främre kommissuren (främre delen). Medan en del av de celler och skräp kommer att bosätta sig på bordläggningen, kommer mediet normalt sett vara grumligt på grund av den mängd cellmaterial som är närvarande följande rivning. Den första mellan förändring på 24 timmar kommer att ta bort de flesta av detta. Såsom visualiserades genom Ijusmikroskopi, kommer det att framstå som en stor mängd cellmaterial kvar, tillsammans med blodkärl, även efter den första mediumbyte. Under loppet avde närmaste dagarna, kommer kolonier på en avgränsad växande cellpopulationen blir synliga i mikroskop (Figur 2A). Dessa är de neurala stamceller som har valts ut för tillväxt genom användning av N2-medium innehållande bFGF, Ang2, Dll4, och JAK-hämmare. Dessutom kan en mer långsträckt spindel-liknande cellpopulation också vara närvarande (figurerna 2B och   C). Dessa är inte neurala stamceller (sannolikt radiell glia baserat på morfologi och färgning), kommer de så småningom bli omkörd av snabbare förökar neurala stamceller befolkningen. Under loppet av en vecka till 14 dagar, kommer cellerna blir tätare tills de når sammanflödet (figur 2D). Dessa kulturer färgas positivt för ett antal markörer stamceller, inklusive Nestin, Hes3 och Sox2. (Figur 2E-H), vilket ger förtroende för att de cellpopulationer som har valts och utökade verkligen neurala stamceller.Ytterligare bekräftelse kommer från möjligheten till återkallelse FGF från mediet, vilket tillåter celler att differentiera till 10 dagar för att alstra neuroner, astrocyter och oligodendrocyter (fig 2i).

Figur 1: Isolering av rått-hjärnsektioner för skörd vuxna neurala stamceller. A) Vuxen råtthjärna efter tvättning med PBS. B) Råtta hjärnan placeras i en kyld rostfri sektione blocket. C) Ungefärlig placering av de första rakblad inom blocket att jordbruksproduktercoronalen avsnitt i hjärnan. D) Placering av 2 extra rakblad i snittblocket. Obs, var tunnare tveeggat blad som används i demonstrationssyfte för att möjliggöra enklare visualisering av sections i blocket. E) frontala hjärnan sektioner innehåller områden som ska avverkas. F) Skiss från Paxinos hjärnatlas belyser subventrikulära zonen som en klassisk neurogen region, och den främre commissure från vilka celler skördades för detta protokoll. G) sekventiella bilder av vävnadsdissociering processen med hjälp av en 1 ml pipett spets fäst vid en P1000 mikropipett. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2: vuxna neurala stamceller in vitro. A) Sex neurala stamceller kultur efter en vecka. B) Exempel på en mer brett spindel morfologi celler (återd pilar) då och då förekommer i de kulturer som inte är neurala stamceller. C, D) under odlingsbetingelser som anges i detta protokoll, de neurala stamceller expandera företrädesvis. EH) Redovisning av neurala markörer stamceller efter 14 dagar in vitro, Sox2 (grön) (E), Hes 3 (red) (F), och Nestin (violett) (G). I) Differentiering av neurala stamceller till neuron, astrocyter och oligodendrocyter. Efter mitogen tillbakadragande, fick cellerna differentiera i 10 dagar, sedan immunostained för GFAP (grön), TuJ1 (röd), och CNPase (blå). J) Hes3 immunfärgning i vuxen råtthjärna. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Många av de steg som är viktiga för framgångsrik isolering, expansion och differentiering av neurala stamceller från vuxen hjärna delas gemensamt med standardvävnadsodlingstekniker. Målet att komma ihåg är att NSCs isolerade från den vuxna hjärnan ska behålla så många av deras in vivo egenskaper som möjligt (Figur 2J). Ofta en balans mellan nödvändig försiktighet och lämplig hastighet måste träffas. Care med isolering av hjärnan från skallen kommer att göra en identifiering av regionen av intresse betydligt enklare. Ta bort vävnaden så snabbt som möjligt efter djurens euthanization, och hålla hjärnan kallt under skörd och tvättning håller det styvare och starkt bidrar till hanteringen av vävnaden när den placeras in i den rostfria sektione mögel. Detta minimerar också risken för rippning av vävnaden under snittningsprocessen. Protokollet också nytta av att vara able för att få de celler till den punkt att pläteringen snabbt, eftersom detta ökar cellviabiliteten en gång de är placerade i vitro. Korrekt tvättning vävnaden före snittning bidrar också till att minska risken för kontaminering i de kulturer. Under dissociation processen bör finfördelning med en 1 ml pipettspets vara kraftig, men gjort på ett sätt som inte är att generera överskott bubblor eller skum av cellsuspensionen som negativt påverkar cellöverlevnad. Den första mellan förändring är också viktigt eftersom det tar bort majoriteten av nonattached cellerna och en cellrester som är resultatet av vävnadsdissociering process som innehåller faktorer som är skadliga för den initiala överlevnaden av stamceller befolkningen. För förbättrad visualisering efter immunfärgning, kan de nyligen isolerade cellerna ströks ut på 25 mm täckglas av glas som placerats i botten av 6-brunnsplattor. Halterna av poly-L-ornitin och fibronektin som används i beläggningen bör ökas till 500 mikrogram / ml och 20 μg / ml, respektive. Som ett alternativ kan flera mindre täckglas (dvs 12 mm) placeras i varje brunn. Dessa kan sedan behandlas för immunofärgning självständigt i separata brunnar i en 24-brunnsplatta, nedskalning mängderna av färgningsreagenser som används för att ta hänsyn till de mindre volymer. Täckglasen monteras sedan på objektglas med användning av en standard vattenbaserad monteringsmedel.

Definiera närvaron av NSCs i den vuxna hjärnan är av stort intresse inom området neurobiologi. Det finns två generella metoder för att identifiera en stamcell. I en, kan en uppsättning av biomarkörer baserade på ett genuttryck profil av stamcellspopulation i fråga användas för att avbilda dem genom immunhistokemi. Även experimentellt enkel, det ger inga funktionella uppgifter, eller definierar om cellerna har de grundläggande egenskaperna hos stamceller, förmågan att själv förnya eller differentierar till flera olika celltyper. I den andra metoden, celler isolerade i either en ren eller heterogen befolkning, placeras i kultur, och det självförnyelse och multi egenskaper bedöms med den levande cellpopulation. Detta tillvägagångssätt ger funktionella data, och kan användas för att entydigt bevisa "stemness" i just dessa in vitro experimentella förhållanden. Dock har svårigheten med att upprätthålla dessa celler i kultur hindras detta andra funktionellt synsätt. I själva verket har en oförmåga att växa NSCs från andra områden av hjärnan kvar intrycket att det finns bara ett fåtal specialiserade nischer där de är bosatta.

Den metod som presenteras här möjliggör odling av NSCs från många olika områden av CNS. Denna teknik är baserad på vårt arbete som klar en signaltransduktionsväg av stor betydelse för att styra antalet NSCs både in vitro och in vivo. De faktorer som ingår i detta protokoll valdes ut baserat på omfattande signalöverföringsstudier, Vilket visar att de främjar NSC tillväxt via en gemensam transkriptionsfaktor Hes3. Våra tidigare studier visar att just denna kombination gav en ännu större ökning av NSC siffror jämfört med att använda dem individuellt. Valet av vilken farmakologisk stöd sätts till kulturen bör beaktas i samband med den biologi som studeras. Till exempel, medan både Ang2 och Dll4 har en positiv inverkan på NSC tillväxt, de har motsatta effekter på kärlbildning ^22,23. Genom ytterligare optimering av odlingsbetingelserna kommer ytterligare nya biomarkörer bortom Hes3 sannolikt identifieras och expandera den erkända antalet NSCs i den vuxna hjärnan ytterligare. Detta exemplifieras av våra observationer att skillnader bland den Hes3 + cellpopulationen från olika hjärnområden kan göras. Exempelvis Hes3 +-celler från ryggmärgen, som de från SVZ och ACA, uppvisar en flera faldig ökning av deras antal när de odlas med dessafaktorer. Dessutom kan Hes3 + celler från alla dessa regioner effektivt alstra neuroner, astrocyter och oligodendrocyter. Emellertid är inte identisk morfologi och genuttryck av de differentierade celltyper. Ytterligare biomarkörer som skiljer mellan olika Hes3 + celltyper kommer att bli ett välkommet tillskott till området. Den metod som presenteras här gör det möjligt att effektivt alstringen av NSC kulturer kan användas som ett verktyg för att uppnå detta mål.

Liksom NSC markörer nestin och Sox2, transkriptionsfaktorn Hes3 identifierar en cellpopulation som vid isolering kan förökas in vitro såväl som differentieras till de huvudsakliga celltyper som utgör nervsystemet, neuroner, astrocyter och oligodendrocyter ^11. Men till skillnad från de mer vanligen använda markörer, Hes3 identifierar också vilande NSCs, som en följd, många Hes3 + celler inte innehålla indikatorer för mitos ⁽³ H-tymidin eller BrdU) i homeostatiska c.ILLKOR (och därmed undvikit klassiska detektionstekniker). Tillämpning av protokollet som beskrivs här var fundamental i upptäckten av denna NSC befolkning. Antalet av dessa celler ökar i kultur när de behandlas med faktorer som produceras från det vaskulära endotelet, däribland Notch-ligand Delta4 och Angiopoetin2, i överensstämmelse med deras perivaskulär lokalisering in vivo ^24.

Att ha god tillgång till dessa celler som isolerats från den vuxna hjärnan tillåter experiment för att undersöka hur cellerna reagerar på signalöverföringsnivån till olika faktorer, och ger några prediktiva indikationer på hur cellerna reagerar in vivo. Bortom regenerativ medicin, visade vi att de odlingsbetingelser som beskrivs här har relevans för cancerforskningen också. De representerar bättre för miljön att cancer stamceller isolerade från glioblastoma multiforme upplevelse samtidigt i patienten, vilket möjliggör studier of signalvägar som kan manipuleras för att motsätta sig deras tillväxt ^30. Den breda tillämpningen av denna teknik skulle kunna få betydande konsekvenser för flera aspekter av forskning och medicin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit