大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

Summary

成人脳から採取した神経幹細胞は神経系の発達の基礎研究から再生医療の潜在的な臨床応用を探索範囲の用途に利用が増加している。これは実験的な成果を鳴らす重要なこれらの細胞を成長させるために使用される分離と培養条件に厳密な制御を行う。

Abstract

最近の研究は、中枢神経系（CNS）腫瘍形成は、再生および幹細胞の集団（SCの）成体の脳内に存在することを含むことを示している。しかし、これらの正常静止細胞は、神経回路網の適切な機能を確保するだけでなく、神経変性過程の傷害や緩和からの回復におけるそれらの役割に採用するメカニズムはほとんど理解されています。これらの細胞は、血管系および免疫系の両方から調節シグナルを含む維持環境を提供する「ニッチ​​」と呼ばれる地域に存在します。未知の要因を除外する規定された培養条件の下での分離、メンテナンス、およびCNS SCの分化は、従って、それらのin vivoでの行動への洞察を提供し、薬理学的または遺伝的手段による治療にそれらにアクセスできるようになります。ここでは、成人の脳の異なった領域から中枢神経系のSCの文化を生成する方法に関する詳細な情報を提供し、そのDを評価するために近づいたニューロン、アストロサイト、およびin vitroでオリゴデンドロサイトへのifferentiationポテンシャル。この技術は、個々のSCおよびその子孫を研究するために可視化することができる単層培養として均一な細胞集団が得られる。さらに、損傷した成体の神経系において回生応答を予測するために以前に使用されて、異なる動物モデル系および臨床試料の両端に印加することができる。

Introduction

神経生物学のセントラルドグマは、前世紀以上ラモン·Y.カハールによって行われた脳の細胞構築の基本的な観測が定めた、神経新生はCNS ¹で見つかったニューラルネットワークの複雑さを考えると、思春期の後にそうだったと判示した。 1960年代のアルトマンの作品、およびそれ以降のカプランは^、3 H-チミジンは、実際にはニューロンは、成体脳の異なる領域で生成されていたことを示している成熟した神経細胞で見つけることができることを実証しているにもかかわらず、定説は^2、3を保持し続けた。証拠は小鳥の脳⁴に存在するニューロンの数の季節変化を記述するノッテボームの研究をマウントし続けた。これはグールドらはラットの連合学習課題の性能だけでなく、Kornackとラキッチdemonstraの観察と海馬が増大するニューロンの生成に作品を発表1999年までではなかったティンは剛性が低く、より多くのプラスチック、脳の概念は^、5認識された大人のマカク^、6で神経新生を続けた。

これらの新たに生成された神経細胞のための細胞源の探索はニッチ⁷と呼ばれる脳の領域に存在する幹細胞（SCS）の離散的な人口の発見につながる。脳室下帯と海馬のサブ粒状ゾーンは二つの主要な神経性の地域^8,9であると考えられている。これらの場所から単離された細胞は、古典的な胚または胎児に由来するSCの特徴的な、自己再生および分化能を表示します。神経幹細胞（NSC）の場合、それらは、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化させることができる。さらに、これらのSCは、例えば、中間径フィラメントタンパク質ネスチン¹⁰胎児NSCマーカーについて陽性に染色。 SCSはこれらのTに限定されていない可能性があり、より最近の研究のハイライトエリア、WOとは、実際にはしっかりと血管系¹¹に関連する細胞の大部分は静止人口として脳全体にローカライズされています。

のSCが傷害に応答して動員される観察は、神経変性疾患および脳卒中^12,13からの回復を助けるために回生目的のために、これらの細胞を利用することができるという可能性を示唆している。これは、間葉系幹細胞（MSC）は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞¹⁴になる可能性がある血管周囲細胞として見出される結合組織の治癒において果たす役割とは違っていません。しかし、NSCは、ルーチン吸引および密度勾配遠心法によって骨髄からのMSCと同様にして採取することができないし、続いて自己細胞に基づく治療に利用する。結果として、そのようなEMBに由来する胎児ニューロンのNSC又は前駆体の使用などの細胞の他の源ryonic幹細胞が広範囲に成功¹⁵の様々な程度で、動物の病気や怪我モデルで検討されている。体細胞の供給源を利用して人工多能性幹細胞技術は、限られた在庫および胚細胞および胎児組織¹⁶の使用に関する倫理的な問題を克服する、広範囲の用途のために治療的に有用な細胞ベースの治療を製造するための別の潜在的な手段を提供する。しかし、これらの知見の臨床的変換は、SC-ベースの治療アプローチ^17,18と同様に、規制当局の認可を曲がりくねった経路で種々の神経学的状態を治療する闘争に示されているように、困難な作業であることが証明されている。別のアプローチとして、特定の薬理学的治療の導入は、NSC数を調節し、パーキンソン病および脳卒中¹⁹のモデルの回復を促進することができる。戦略は、効果的にこれらの細胞を操作する方法を理解することがありますどのようなアクセス可能なin vitroの系を必要とします。

NSCの培養物はまた、ニューロスフェアとしても知られている凝集体の培養物として、または単層^8,20のいずれかとして行うことができる。両方の技術は、広く、規定された培養条件の確立を可能にする、多能性前駆体の膨張を提供するマイトジェン源として上皮成長因子（EGF）または塩基性線維芽細胞成長因子（bFGFの） すなわち使用が使用されてきた。ニューロスフェア培養物が単離された細胞型のクローン増殖能力を研究するためのより適しているかもしれないが、システム²¹は、膨張時に細胞の混合集団を産生することが示されている。また、ニューロスフェアの密閉構造は、細胞の薬理学的操作が非現実的になり、これらの要因が持つ影響力の解釈は、ニューロスフェア自体の中で確立された微小環境に混乱する可能性があります。単層培養物は、他の一方で、あることができるSCの増殖および分化を調節し、特にこの細胞集団を標的とする新規化合物を発見する機会を開くシグナル伝達機構を探索するための強力なツールを提供する、小分子ライブラリーのハイスループットスクリーニングに用いられる。

その結果、再現可能脳内の関心の異なる領域からの成体NSCの培養物を生成する能力は、中枢神経系（CNS）の発達の研究からの新規な再生医療アプローチを探索するに至るまで、研究用途の広いスペクトルにおいて使用することができる。ここで紹介するプロトコルは、成人の齧歯類脳から単離されたCNS SCの分化能力を分析し、評価する方法を示しています。

Protocol

仕事はHelsinskiの宣言とARVO動物ステートメントに準拠しています。ドレスデン大学の動物施設の指示に従って、動物は組織収集のために使用された、関連するすべてのメソッドに従った。動物は処理され、収容された実験動物の使用とケアのためのドイツ連邦ガイドラインに従って、および研究はLandesdirektionドレスデンで承認されたされた。適切な安楽死の方法論について、あなたの機関の獣医ポリシー（動物実験委員会または他のボード）にご相談ください。

特定の株式や試薬の使用濃度は、このプロトコルに付随する試薬、表に記載されています。

1。培養皿の準備

1. 一晩細胞培養インキュベーター中で75μg/ mlのポリ-L-オルニチン（6ウェルプレートのつまり 2ミリリットル/ウェル）の十分なボリュームのあるコートディッシュ2日前までにスケジュールされた解剖日まで。
2. 最後の洗浄を削除し、プレートにフィブロネクチン（希釈1:250、PBS中の4μg/ mlの）を追加し、一晩培養器に料理を置く。
3. 解剖の日にフィブロネクチンを吸引し、皿をPBSで2回洗浄します。まだ解離した組織は、培養のための準備ができるまで、インキュベーターに洗って、最終的なPBSを含むプレートを返します。その時に、前に組織をメッキに、PBSを除去します。
4. ストア·プレートは、最大3週間、インキュベーターをポリ-L-ornithineinで被覆。フィブロネクチンでコーティングしたプレートは1週間まで保存することができる。緊急の場合は、フィブロネクチンコーティングは、わずか2時間で行うことができる。フィブロネクチンは、変性を受けやすい。ソリューションを撹拌や食器を乾燥させてください。

2。解剖/メッキ

1. このプロトコルは、3成体ラット（生後3〜6ヶ月）の使用に適用されます。
2. 子どもラットを安楽死させる前に、L氷上で脳切片のブロック。
3. 氷上で追加されたbFGFを持つN2培地の5ミリリットルが含まれている15ミリリットルファルコンチューブを配置します。
4. あなたの機関の獣医ポリシーに従ってラットを安楽死させる。
5. 頭の正中切開下にすることで頭蓋骨から脳を取り出します。慎重に抽出されるべき脳を可能に骨を離れて剥離する鉗子を使用してください。
6. 氷冷PBSを含む10 10cmペトリ皿に脳を置きます。これは残留髪と血液を除去します。 （ 図1A）
7. チルド切片ブロックに脳を置きます。 （ 図1B）
8. 図1Cに写真のようにブロックに1新しいクリーンかみそりの刃を挿入します。
9. 図1（d）に示すように、第1、第2のクリーンかみそりの刃3ミリメートルの尾側を挿入します。
10. 彼らと関心のある部分を取って、ブロックからブレードを慎重に持ち上げます。
11. 秒フロートPBSに浸漬することにより、ブレードオフTION。 （ 図1E）
12. 関心領域から収穫組織は＃5ピンセットを使用して（この例では、前交連、（前方）ACA、 図1Fに使用される）およびbFGFを含む1ミリリットルN2培地を含む15ミリリットルコニカルチューブに集める。
13. 無菌条件下で、プロトコルの残りを継続する、層流細胞培養フードにチューブを移動させる。
14. 機械的にP1000ピペッターに装着1ミリリットルピペットチップを用いて組織を解離する。ピペットは、上下に数回（約20倍、毎秒1分注サイクルの割合で）円錐管の底部にピペットチップの開口部を押しながら（1G 1-3図 ）。溶液が均一になったときにチュレーションを停止します。
15. ソリューションは、任意の大きな非解離組織が底に沈殿することができるように2分間静置する。 （ 図1G 4）
16. homogenを集めるeous上清とN2培地の8.5ミリリットルを加えた20 ng / mlのbFGFを、500 ng / mLのDll4の、500 ng / mLのAng2は、200 nMJAK阻害剤を含むコニカルチューブに入れます。
17. /ウェルの希釈した細胞溶液3mlを用いて、6ウェルプレートの3ウェルにそれらをプレート。
18. 37°C、5％CO _{2、5％O 2}の加湿細胞インキュベーター中にプレートを置き。

3。毎日のケア

1. めっき後24時間後に阻害剤のbFGF、Ang2は、Dll4の、およびJAKを含むN2培地で培養皿上でメディアを交換してください。
2. bFGFは、Dll4の、Ang2は、次の日に、JAK阻害剤のボーラスを追加します。
3. メディアの変化と、10〜14日の計因子添加のこの交互のプロセスを継続する。

4。分化誘導

1. 培地を含む阻害剤のbFGF、Dll4の、Ang2は、およびJAKを撤回し、任意の追加要素が含まれていないN2培地に交換してください。
2. 隔日の媒体を変更します。
3. 10日後に細胞を固定し、免疫細胞化学を行う。

5。免疫細胞化学的検出

1. 培地を吸引し、20分間、4％パラホルムアルデヒド2mlの細胞培養プレートを固定する。
2. 5分ごとに、3mlのPBSで洗浄2X。
3. PBSを吸引除去し、次に20分間、5％正常ロバ血清（NDS）および0.1％トリトンX-100を含有するPBS 2 mlを添加することにより細胞を透過し、遮断する。
4. 5％、NDSを含むPBS中の一次抗体ミックスを調製する。のTuJ1（クラスIIIβ-チューブリン）、GFAP、およびCNPアーゼ抗体は分化マーカーの三重染色のために一緒に使用することができ、一方、抗ネスチン抗体は、SCのを識別するために使用することができる。
5. ブロッキング溶液を吸引し、各ウェルに一次抗体混合物の1.5ミリリットルを追加。 90分間室温でインキュベートする。
6. 一次抗体を除去し、3mlのPBSで2回洗浄し、5分ごとに5％のNDSを含むPBS 3mlで1X。
7. た準備5％NDSを含有するPBSで二次抗体を電子。
8. 最終洗浄を吸引し、各ウェルに二次抗体溶液1.5mlを加える。室温で40分間、暗所でインキュベートする。
9. 二次抗体溶液を除去し、新たに調製されたDAPI染色（PBS中500 ng / mL）を2 mlを加える。 3分間インキュベートする。
10. DAPI溶液を吸引し、5分間ずつ3mlのPBSで3回洗浄します。細胞は、今や蛍光顕微鏡で可視化することができる。

Representative Results

神経幹細胞を採取するための関心領域を識別することは重要な第一歩であり、それは細胞のコンフルエントなプレートを取得するのにかかる時間の量を定義する。例えば、SVZは、古典的な神経原性領域であり、従って、神経幹細胞のより高い相対的割合を有している。しかしながら、ここに記載した技術は、多くの場合、成人期にロバスト神経原性ポテンシャルを有すると認識されていない他の領域で使用することができる。このプロトコルの目的のために、我々は、前交連（前部）を使用した。細胞や残骸の一部がメッキの際に解決しますが、中には通常存在する以下のチュレーションで細胞材料の量の結果として濁ったままになります。 24時間で最初の培地交換はこれの大部分を除去します。光学顕微鏡で可視化されるように、でも、最初の培地交換した後、血管に沿って、残りの細胞物質を多量にあるように表示されます。の過程で今後数日間は、明確な増殖細胞集団のコロニーは、顕微鏡（ 図2A）の下に見えるようになります。これらは、bFGF、Ang2は、Dll4の、およびJAK阻害剤を含有するN2培地を用いて増殖について選択された神経幹細胞である。また、複数の細長い紡錘状の細胞集団が存在してもよい（ 図2Bおよび  C）これらは（おそらく放射状グリアの形態学および染色に基づく）神経幹細胞ではない、彼らは最終的にはより急速に増殖する神経幹細胞集団によって追い越されるであろう。彼らは合流点（ 図2D）に達するまで、14日までの週の間に、細胞がより密になります。これらの培養物をネスチン、HES3、およびSox2を含む幹細胞マーカーの数の陽性に染色。 （ 図2E-H）、こうして選択し、増殖された細胞集団は、実際に神経幹細胞であるという確信を提供する。さらなる確認は、細胞がニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト（ 図2I）を生成する10日間分化させること、メディアからの撤退のFGFできることにあります。

図1：成体神経幹細胞を採取するためのラット脳切片の単離。 2追加のかみそりの刃の冠状断面脳、D）の配置を生成するために、ブロック内の最初のかみそりの刃のブロックを区画チルドステンレス鋼中に入れ、PBSで洗浄した後にA）成体ラットの脳。B）ラット脳。C）のおおよその位置合わせセクショニングブロックに。注、シンナー両刃の刃は、Sのより容易な視覚化を可能にするためにデモンストレーションの目的のために使用されたブロックのections。E）に収穫される領域を含む冠状脳切片。F）クラシック神経形成領域、および細胞は、このプロトコルのために採取した元の前交連などの脳室下帯を強調Paxinos脳アトラスから模式図である。G） P1000のピペットに装着1ミリリットルピペットチップを使用して、組織解離過程の連続画像。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2：in vitroでの成体神経幹細胞。より広範なスピンドル形態細胞（ReのA）の成体神経幹細胞培養1週間後。B）の例このプロトコルで規定された培養条件下で神経幹細胞。C、D）ではない培養物中に時折存在するd個の矢印）、神経幹細胞は、優先的に拡張する。EH）を神経幹細胞マーカーの発現をインビトロ 、Sox2の中で 14日後（緑）（E）、HESの3（赤）（F）、及びネスチン（バイオレット）（G）I）ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトへの神経幹細胞の分化。マイトジェン撤退に続いて、細胞をGFAP（緑）、のTuJ1（赤）、およびCNPアーゼ（青）のために免疫染色した後、10日間分化させた、J）HES3免疫染色成体ラットの脳に。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

成功した分離、拡大、及び成体脳由来の神経幹細胞の分化にとって重要なステップの多くは、標準的な組織培養技術に共通に共有される。心に留めて目的は、成人の脳から単離されたNSCは、できるだけそれらのインビボ特性（ 図2J）の多くを維持するべきであるということです。多くの場合、必要​​な注意と適切な速度のバランスが打たれる必要がある。頭蓋骨から脳を単離とケアは、関心領域の識別が大幅に容易になります。動物の安楽死、次の可能な限り迅速に組織を除去し、収穫や洗浄中に脳の寒さを保つことは、それを維持し、より剛性の大幅それは、金型を区画ステンレス鋼に置かれたときに組織の処理に役立ちます。これはまた、切削プロセスの間に組織をリッピング可能性を最小限に抑えることができます。プロトコルは、ABLであることから利益を得るそれらはインビトロで置かれたら、これは細胞生存率を増加させるように、電子、迅速にめっきする点に細胞を取得する。前切片への適切な組織の洗浄には、培養中の汚染の可能性を減らすことができます。解離工程中に1mlのピペットチップで粉砕し、激しくあるべきであるが、過剰な気泡または負に影響を与える細胞生存細胞懸濁液の泡立ちが発生するようではない方法で行う。それは非添付細胞や幹細胞集団の最初の生存に有害な要因が含まれている組織解離過程から得られる細胞の破片の大部分を除去するので、第1の媒体の変化も非常に重要です。免疫染色以下の改善された視覚化のために、新たに単離した細胞を、6ウェルプレートの底部に配置された25mmのガラスカバースリップ上に播種することができる。ポリ-L-オルニチンおよびコーティングにおいて使用されるフ​​ィブロネクチンの濃度は500μg/ mlの20及びμまで増大されるべきであるG / mLであった。代替として、複数の小さなカバースリップ（ すなわち、12 mm）を各ウェルに配置することができる。次いで、これらを考慮に小さい容積を取るために用いられる染色試薬の量を縮小し、24ウェルプレートの別個のウェルにおいて独立して免疫染色のために処理することができる。カバースリップを、次いで、標準的な水性封入剤を用いてスライド上に搭載されている。

成人の脳におけるNSCの存在を定義することは、神経生物学の分野における主要な関心事である。幹細胞を同定するための2つの一般的なアプローチがある。一つには、問題の幹細胞集団の遺伝子発現プロファイルに基づいてバイオマーカーのセットは、免疫組織化学によって画像それらに用いることができる。実験的に単純なものの、それは機能的データを与えず、また細胞は、幹細胞の基本的な特性を有するかどうかを定義し、自己更新又は複数の異なる細胞型に分化する能力。他のアプローチにおいて、細胞は、（e）に分離されている培養中に置かれ、純粋なまたは不均一な集団ither、そこ自己再生および多能プロパティは、生きている細胞集団を用いて評価している。このアプローチは、機能的データを与え、明白にこれらの特定のインビトロの実験条件における「幹細胞性」を証明するために使用することができる。しかし、文化の中でこれらの細胞を維持することの難しさは、この第2の機能的なアプローチを妨げてきた。実際には、脳の他の領域からのNSCを成長させることができないことは、彼らが存在する唯一の少数の専門のニッチがあるような印象を残している。

ここで紹介する方法は、CNSのさまざまな分野からのNSCの培養を可能にします。この技術は、 インビトロおよびインビボの両方でのNSCの数を制御する非常に重要なシグナル伝達経路を解明ご協力に基づいている。このプロトコルに含まれる因子は、広範囲のシグナル伝達の研究に基づいて選択した、それらは共通の転写因子を介して HES3 NSCの成長を促進することを実証する。我々の以前の研究は、それらを個別に使用して比較した場合、この特定の組み合わせは、NSC数の一層の増加をもたらしたことを示している。薬理学的担体を培養物に添加された選択肢が検討されて生物学の文脈で考慮されるべきである。 Ang2はとDll4の両方が、NSCの成長にプラスの影響を持っている間、例えば、それらは血管系の形成^22,23に対する反対の効果を持つ。培養条件の更なる最適化を通じて、HES3超える追加新規バイオマーカーは、おそらく特定され、さらに成人の脳ではNSCの認識番号を展開します。これは、異なる脳領域からHES3 +細胞集団の間で区別がなされ得ることを我々の観察が挙げられる。ときに、これらを用いて培養例えばHES3 +脊髄からの細胞は、SVZおよびACAからのもののように、その数は数倍の増加を示し、要因。さらに、すべてのこれらの領域からHES3 +細胞が効率的にニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトを生成することができる。しかし、分化した細胞型の形態および遺伝子発現は、同一ではない。異なるHES3 +細胞の種類を区別さらなるバイオマーカーは、フィールドに歓迎されます。 NSC培養物の効率的な生成を可能にここに提示される方法は、この目標に向かってツールとして使用することができる。

ネスチンおよびSox2、NSCマーカーと同様に、転写因子HES3、分離の際に、in vitroで増殖させることができるだけでなく、神経系、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト^11を構成する主要な細胞種に分化した細胞集団を同定する。しかし、これらのより一般的に使用されたマーカーとは異なり、HES3も静止NSCを識別し、その結果として、多くのHES3 +細胞は恒常的なCの下で有糸分裂^（3 H-チミジンまたはBrdU）の指標を組み込んでいないonditions（したがって古典的な検出技術を回避している）。ここに記載されているプロトコルのアプリケーションは、このNSCの人口の発見の根本的だった。 生体内 ²⁴ での血管周囲局在化と一貫性のあるノッチリガンドDelta4、およびAngiopoetin2、を含む血管内皮から製造要因で処理した培養におけるこれらの細胞の数が増加する。

成人の脳から単離され、これらの細胞に容易にアクセスを持つことは、実験は、細胞が様々な要因によって、シグナル伝達レベルでどのように反応するか調べることを可能にし、細胞が生体内でどのように応答するかのいくつかの予測指標を提供します。再生医療を超えて見ると、我々はここで説明する培養条件も同様に、がん研究との関連性を持っていることを明らかにした。患者に、研究Oを可能にしながら、彼らは、より良い形性膠芽腫から分離された癌幹細胞は経験を多する環境を表すfはそれらの成長^30に対向するように操作することができるシグナル伝達経路。この技術の広範な適用は研究と医学の複数の側面に大きな影響を与える可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit