Introduction
प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की पहचान करने और यों करने में सक्षम होने के नाते पशु और सेल आधारित प्रयोगों के लिए एक मानक तकनीक है. हालांकि, के बावजूद एक लंबे समय से वर्तमान में लड़की और माउस 1,2 दोनों में immunohistochemistry तक सीमित है विकास के दौरान इस विशिष्ट ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन, जल्दी भ्रूण हृदय वाल्व विकास में रुचि. सबसे मॉडल जीवों (जैसे, लड़की और माउस) के विकास के वाल्व में प्रोटीन अभिव्यक्ति बढ़ाता की कठिनाई का हिस्सा प्राप्त किया जा सकता है कि प्रोटीन की मात्रा को सीमित करता है जो वाल्व, के छोटे आकार के है. इस प्रकार, मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, शोधकर्ताओं आमतौर पर बाद में मात्रात्मक पीसीआर या माइक्रोएरे विश्लेषण 2-5 के लिए शाही सेना निष्कर्षण और प्रवर्धन पर भरोसा करते हैं. हालांकि, आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर 6 पूर्ण correlative नहीं हैं, इसलिए शाही सेना अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित कर किसी भी संकेत में होते हैं कि कई परिवर्तन का एक कठोर खाते प्रदान नहीं कर सकतेघटनाक्रम के दौरान विभिन्न समय पर मार्ग. वर्तमान में उपलब्ध पद्धति में इस सीमा के आधार पर, इस प्रक्रिया के लक्ष्य को मज़बूती में महत्वपूर्ण हैं कि विभिन्न संकेत दे रास्ते में होने वाले परिवर्तनों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विकासशील भ्रूण माउस हृदय वाल्व क्षेत्रों से प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था इस ऊतक की परिपक्वता.
भ्रूण वाल्व पहले से ही आमतौर पर शाही सेना अलगाव और बाद में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 2-5 के लिए चूहों से विच्छेदित कर रहे हैं. हालांकि, इन अध्ययनों बहाव के संकेत को प्रभावित कर सकता है कि बाद translational प्रोटीन संशोधनों का पता लगाने का पता लगाने की अनुमति नहीं देता जो मार्ग सक्रियण, संकेत से बाहर पढ़ने के रूप में जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करने के लिए सीमित कर दिया गया है. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में शाही सेना के अलगाव की तकनीक का उपयोग करना, हम ब्याज के क्षेत्रों विदारक के साथ शुरू हुआ. हमारे हित phosphorylated प्रोटीन का पता लगाने गया था क्योंकि संकेत पैट की सूचक थी किमहाधमनी वाल्व विकास (E13.5-14.5) की एक विशेष अवधि के दौरान hway गतिविधि, हम फॉस्फेट मुक्त Tris बफर में सभी विच्छेदन प्रदर्शन किया और फॉस्फेट और प्रोटीज inhibitors के साथ एक Tris आधारित lysis बफर में वाल्व एकत्र. हमारे विशिष्ट मामले में, केवल महाधमनी वाल्व क्षेत्रों एकत्र किए गए थे, लेकिन फेफड़े के वाल्व क्षेत्र को आसानी से एक ही समय में प्राप्त किया जा सकता है. वाल्व क्षेत्रों तो homogenized और वर्तमान में वयस्क हृदय वाल्व 7 में प्रोटीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक नमूना बफर के साथ संयुक्त थे. छोटा सा नमूना मात्रा में (उदाहरण के लिए, 2 μl) का उपयोग करते हुए और एक ही जीनोटाइप के साथ भ्रूण से वाल्व क्षेत्रों पूलिंग करके, हम भ्रूण दिन 13.5 8 पर phosphorylated और nonphosphorylated प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम थे. वाल्व क्षेत्रों जमे हुए और lysis बफर में संग्रहित किया जा सकता क्योंकि पूलिंग से पहले की जरूरत है, तो भ्रूण genotyped किया जा सकता है.
इस तकनीक को सेल signalin के मूल्यांकन के लिए उपलब्ध हैं कि उपकरणों के सेट broadensग्राम विकास के दौरान रास्ते और विशेष रूप से विकासशील हृदय वाल्व के लिए, immunohistochemistry के लिए एक मात्रात्मक तारीफ प्रदान करता है. इस तकनीक के विकास के हृदय रोग विशेषज्ञों के लिए बल्कि सीमित ऊतक होते हैं कि क्षेत्रों में रुचि रखते हैं, प्रारंभिक चरण भ्रूण के साथ काम करने वाले सभी विकासात्मक जीव को न केवल लाभ के लिए किया जाना चाहिए.
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Protocol
नोट: सभी प्रयोगों चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1 आबकारी महाधमनी वाल्व
- ब्याज की भ्रूण चरण के लिए एक अनुमोदित इच्छामृत्यु तकनीक का उपयोग करना, विकास के वांछित भ्रूण दिन (ई) पर पिल्ले के साथ एक गर्भवती माउस euthanize.
- गर्भवती महिला के पेट बाँझ 70% इथेनॉल का उपयोग करें. दूर आंतरिक अंगों से पेट के निचले हिस्से के ऊपर और की त्वचा और मांसपेशियों लिफ्ट, और गर्भाशय सींग लिए उपयोग की अनुमति के लिए खुला महिला के पेट के निचले भाग गुहा काटना.
- गर्भाशय सींग पुनः प्राप्त करने के लिए, संदंश संदंश के साथ गर्भाशय ग्रीवा और ध्यान से कट दुम पकड़. जगह में सींग रहता है कि किसी भी संयोजी ऊतक काटने, गर्भाशय सींग लिफ्ट, और डिंबवाहिनी साथ गर्भाशय सींग का जंक्शन काटने से हटाने को पूरा करें.
- एक पेट्री डिश युक्त कर्नल में विच्छेदित गर्भाशय सींग रखेंडी 0.1 एम Tris बफर (पीएच 7.6) और जरूरत के रूप में कुल्ला. फिर, खुला लंबाई के लिहाज से भ्रूण थैलियों को बेनकाब करने के लिए गर्भाशय सींग काट दिया.
- भ्रूण को बेनकाब करने के लिए, नाल और भ्रूण के जंक्शन पर एक भ्रूण थैली खोलने में कटौती और भ्रूण को मुक्त करने की नाल वाहिकाओं में कटौती. ठंड 0.1 एम Tris बफर के साथ एक दूसरे पेट्री डिश में विच्छेदित भ्रूण रखें. अगले भ्रूण के लिए तैयार है जब तक बर्फ को शेष undissected भ्रूण के साथ पहली पेट्री डिश लौटें.
- भ्रूण के भीतर छाती दीवार उपयोग में सुधार करने के लिए, भ्रूण सिर काटना. जीनोटाइपिंग आवश्यक है, हटाने और बर्फ पर रखा एक Eppendorf ट्यूब में एक अतिरिक्त ऊतक टुकड़ा बचा.
- अपनी पीठ पर भ्रूण रखें, और एक forelimb के पास, रिब पिंजरे के पक्ष के साथ खड़ी छाती दीवार में कटौती, और क्षैतिज डायाफ्राम ऊपर दिल कल्पना करने के लिए. फिर, दिल को बेनकाब करने के लिए छाती दीवार खुला.
- महान वाहिकाओं साथ उच्च पकड़ संदंश का प्रयोग, संदंश का उपयोग दिल उठा और नीचे वाहिकाओं में कटौती.एन, दिल को मुक्त करने के लिए संदंश ऊपर काटा. फेफड़े के जहाजों काटा हुआ रहते हैं, फेफड़ों दिल से हटाया जा सकता है और जारी रखने से पहले हटा दिया जाना चाहिए.
- कट और वाल्व के स्तर से ऊपर फेफड़े के धमनी हटाने; यहाँ बताया भ्रूण चरणों में, फेफड़े के धमनी वाल्व क्षेत्र से अपने भेदभाव में एड्स, जो थोड़ा अपारदर्शी है. , अभी फेफड़े के वाल्व के नीचे कट trabeculated निलय मायोकार्डियम से बचने और इस क्षेत्र के हित का भी है अगर कदम 1.10 में वर्णित के रूप में इकट्ठा. यहाँ और अगले चरण में, पूर्व lysis बफर में इकट्ठा करने के लिए दूर ब्याज के क्षेत्र से अतिरिक्त Tris बफर आकर्षित करने के लिए केशिका क्रिया का उपयोग करें.
- ध्यान सिर्फ वाल्व के स्तर से ऊपर, महाधमनी वाल्व को महाधमनी बाहर निकालने; फेफड़े के धमनी की तरह, महाधमनी अपनी हटाने में सहायता, इन भ्रूण चरणों में थोड़ा अपारदर्शी बनी हुई है. फिर trabeculated निलय मायोकार्डियम परहेज, बस महाधमनी वाल्व के नीचे कट, और हस्तांतरणबर्फ पर प्रोटीज और फॉस्फेट inhibitors युक्त (सामग्री तालिका में वर्णित) 2 μl lysis बफर के साथ एक Eppendorf ट्यूब संदंश का उपयोग वाल्व.
- वाल्व एक अलग Eppendorf ट्यूब में प्रत्येक वाल्व का संग्रह, सभी भ्रूण से excised किया गया है जब तक दोहराएँ 1.6-1.10 कदम. सभी भ्रूण एक ही जीनोटाइप है, तो सभी वाल्व एक भी Eppendorf ट्यूब में एकत्र किया जा सकता है.
- जीनोटाइपिंग एक साथ पूल करने के लिए वाल्व जो यह निर्धारित करने के लिए किया जा रहा है, तुरंत आगे उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर lysis बफर में नमूने जगह है. नमूने तो (कदम 2.1.1) जीनोटाइपिंग के बाद जमा किया जा सकता है.
2 प्रोटीन निष्कर्षण
- 1 मिनट ट्यूब के नीचे lysis बफर में ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए 13,100 XG पर बर्फ और अपकेंद्रित्र पर एकत्र ऊतकों पिघलना.
- भ्रूण genotyped थे, धीरे इकट्ठा और पूल lysis बफर समान जीनोटाइप के साथ भ्रूण से वाल्व क्षेत्रों युक्त करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें. एक मजबूत ख सुनिश्चित करने के लिएनमूना सिफारिश की है और प्रति, E13.5 भ्रूण से 3-4 वाल्व क्षेत्रों पूलिंग.
- सभी भ्रूण एक ही जीनोटाइप के थे और सभी वाल्व क्षेत्रों चरण 1.10 में एक साथ एकत्र किए गए थे तो 2.2 कदम के रूप में वर्णित, पूरे नमूना lyse.
- परिणामस्वरूप जमा नमूना की मात्रा की जाँच करें और 40 μl की कुल मात्रा को lysis बफर जोड़ने; तो, बाधित और Eppendorf ट्यूब में 5 मिमी स्टेनलेस स्टील मोती का उपयोग कर नमूने homogenize. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 50 हर्ट्ज पर 2-4 मिनट के लिए lyser कार्य करते हैं. संक्षेप में स्पिन ट्यूब, अघुलनशील मलबा पीछे छोड़कर नई ट्यूब (~ 13,100 1 मिनट के लिए XG), और हस्तांतरण के नमूने,.
- तैयार है और इस तरह के Eslami एट अल 9 के रूप में एक प्रोटोकॉल के बाद एसडीएस पृष्ठ और बाद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए स्थानांतरण के लिए अलग नमूने,. एक लोडिंग नियंत्रण प्रोटीन के लिए सोख्ता प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक है.
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Representative Results
इस तैयारी तकनीक का उपयोग करना, हम E13.5 भ्रूण से एक महाधमनी वाल्व क्षेत्रों में phosphorylated Smad 1,5,8 (pSmad) का पता लगाने में सक्षम थे. चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, एक भी वाल्व क्षेत्र से अलग प्रोटीन एक बेहोश pSmad बैंड का पता लगाने के लिए पर्याप्त है. संकेत तीव्रता जमा कर रहे हैं कि वाल्व क्षेत्रों की संख्या के अनुपात में बढ़ जाती है. महत्वपूर्ण बात है, pSmad / β-actin के अनुपात अलग नमूना आकार (चित्रा 1C) भर में लगभग स्थिर बनी हुई है. कारण उपलब्ध प्रोटीन का स्तर कम करने के लिए, एक ही धब्बा छीन नहीं किया जा सकता है और कुल Smad लिए reprobed. हालांकि, एक अलग कुल Smad 1 दिखा धब्बा और β-actin ही अभिव्यक्ति पैटर्न (चित्रा 1 बी) से पता चलता है.
ये वाल्व क्षेत्रों निलय मायोकार्डियम contaminating की लगभग पूरी तरह से रहित हैं. सही वेंट्रिकल के नमूनों के साथ संयोजन में इस तैयारी तकनीक का उपयोग करना, हम ventric पता लगाने में असमर्थ थेमहाधमनी वाल्व क्षेत्रों में ular मायोकार्डियम मार्कर एएनपी, इस मार्कर आसानी से निलय में पता चला था जबकि (चित्रा 2). इसके अलावा, निलय दौरे मार्कर मायोसिन प्रकाश श्रृंखला 2V भी आसानी से निलय नमूने में पता चला लेकिन महाधमनी वाल्व क्षेत्रों में मुश्किल से detectable है. इन परिणामों के विच्छेदन की यथातथ्यता समर्थन करते हैं.
भ्रूण महाधमनी वाल्व क्षेत्रों में चित्रा 1 Smad फास्फारिलीकरण. नमूने 1 से नमूना प्रति 4 वाल्व क्षेत्रों को लेकर जमा भ्रूण माउस महाधमनी वाल्व क्षेत्रों की बढ़ती संख्या के साथ तैयार थे. प्रत्येक नमूना 25-28 μl की कुल मात्रा में पूरे वाल्व क्षेत्र (एस) से अलग सभी प्रोटीन भी शामिल है. तैयार ऊतकों तो phosphorylated Smad1,5,8 (pSmad) (ए के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के अधीन थे), कुल Smad1 (सी), और β-actin (ए, सी). प्रोटीन Lumigen ईसीएल अल्ट्रा और UVM Visionworks सॉफ्टवेयर के साथ imaged का उपयोग पाया गया. pSmad और β-actin के बैंड तीव्रता ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग (बी) में मात्रा निर्धारित के रूप में, सामग्री शुरू की राशि के लिए आनुपातिक है. प्रस्तुत आंकड़ों मतलब है और दो अलग blots का मानक विचलन कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2 महाधमनी वाल्व क्षेत्रों निलय मायोकार्डियम मार्करों व्यक्त नहीं करते. नमूने, या एक साथ 1 से नमूना प्रति 4 वाल्व क्षेत्रों को लेकर जमा भ्रूण माउस महाधमनी वाल्व क्षेत्रों की बढ़ती संख्या के साथ तैयार किए गएसही वेंट्रिकल के नमूना. चित्रा 1 में वर्णित और निलय मायोकार्डियम के लिए मिट नमूने प्रोसेस किया गया एएनपी (ए) और मायोसिन प्रकाश श्रृंखला (विधान परिषद के सदस्य) -2v (बी) मार्करों. एएनपी पूरी तरह से निलय नमूना तक ही सीमित है, और विधान परिषद के सदस्य 2V निलय नमूना के साथ तुलना में बेहद कम स्तर पर व्यक्त की है. β-actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है.
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Discussion
हृदय वाल्व क्षेत्रों जल्दी भ्रूण माउस में प्रोटीन का स्तर यों और लड़की की क्षमता वाल्व विकास के लिए महत्वपूर्ण सेलुलर संकेत घटनाओं को समझने के लिए एक अतिरिक्त उपकरण प्रदान करता है. यहाँ बताया हमारी प्रोटोकॉल मानक प्रोटीन अलगाव प्रक्रियाओं से बहुत अलग नहीं है. हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण कदम को संशोधित करके, हम सफलतापूर्वक अत्यंत छोटा सा नमूना आकार से phosphorylated प्रोटीन प्राप्त किया है. इस परिणाम को प्राप्त करने के लिए निम्न चरणों का विशेष महत्व के हैं. कि गुणवत्ता वाले प्रोटीन प्राप्त होता है यह सुनिश्चित करने के लिए, यह बर्फ पर किया जाए या यदि आवश्यक हो तो,, फॉस्फेट अवरोधकों प्रोटीज की उपस्थिति में, बहुत ठंडा buffers का उपयोग और से, ठंडा नमूने रखने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, छोटा सा नमूना मात्रा प्रक्रिया के लिए डिज़ाइन किया गया है कि एक डिवाइस के साथ homogenization पर्याप्त रूप से कोशिका झिल्ली में खलल न डालें के लिए आवश्यक है. यहां तक कि इन सावधानियों के साथ, प्रोटीन की प्राप्त उपज एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साथ ब्रैडफोर्ड परख के माध्यम से पता लगाने के लिए भी कम हो सकता हैया अभी भी एक प्रोटीन मात्रा का ठहराव किट और बाद के विश्लेषण के लिए उपलब्ध नमूना है. हम एक महाधमनी वाल्व क्षेत्र 7 महाधमनी वाल्व क्षेत्रों पूलिंग और मात्रा का ठहराव के लिए पूरे नमूना का उपयोग करके लगभग 1 ग्राम प्रोटीन की है जिसमें यह निर्धारित करने में सक्षम थे. इस सीमा के बावजूद, पर्याप्त प्रोटीन से पहले मात्रा का ठहराव की कमी आवश्यक एक लोडिंग नियंत्रण में आता है, हालांकि phosphorylated और गैर phosphorylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्राप्त की है. यह हमें भी झिल्ली कई बार अलग करना के बाद यह पता लगाने के लिए अनुमति दी है जो एक उच्च बहुतायत प्रोटीन है, क्योंकि हम विशेष रूप से β-actin के उपयोग; अपनी आणविक वजन ब्याज की हमारे प्रोटीन से मतभेद; और यह सर्वत्र व्यक्त किया है. जमा नमूने के विभिन्न संख्या के साथ एक परीक्षण वेस्टर्न ब्लॉट विकास के अन्य चरणों में या हित के अन्य छोटे ऊतकों के लिए भ्रूण हृदय वाल्व क्षेत्रों के लिए या तो जमा किया जाना चाहिए कि कितने ऊतकों निर्धारित करने की सिफारिश की है. इसके अलावा, हम कम से कम तीन टी पूलिंग करने की अनुशंसाप्रत्येक प्रोटीन नमूना के लिए मुद्दा नमूने विच्छेदित ऊतकों के आकार में और साथ ही प्रत्येक भ्रूण विच्छेदन करने से पहले बर्फ पर बैठे समय की लंबाई में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में. ब्याज की प्रोटीन भी नमूने एकत्र करने के बाद पश्चिमी धब्बा के माध्यम से पता नहीं किया जा सकता है, तो हम नमूना मात्रा को कम करने और सभी संभावित प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपलब्ध है कि यह सुनिश्चित करने के homogenization समय बढ़ाने की अनुशंसा. साथ ही, प्रोटीज इनहिबिटर्स भी अस्थिर या आसानी से अपमानित प्रोटीन के लिए विच्छेदन के दौरान ठंडा Tris बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है. ब्याज की प्रोटीन ऐसे प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन या सब्सट्रेट पहचान पद्धति को एडजस्ट करने के रूप में निम्न स्तर, प्रयोग के पश्चिमी धब्बा भाग के दौरान अतिरिक्त समस्या निवारण, पर व्यक्त किया जाता है, तो दृश्य के साथ मदद मिल सकती है.
सबूत (जैसे, immunohistochemistry या स्वस्थानी संकरण में) ब्याज की एक प्रोटीन हृदय वाल्व और surrou में दोनों व्यक्त किया है कि पता चलता हैमायोकार्डियम nding, महाधमनी या फेफड़े के धमनी मायोकार्डियम, टंगस्टन सुइयों के साथ अलग धीरे छेड़ा भी E12.5 भ्रूण 5 से वाल्व से किया जा सकता है. इस अतिरिक्त कदम महत्वपूर्ण तकनीकी कठिनाई विच्छेदन का समय लंबा और बढ़ जाएगा, क्योंकि हम केवल जरूरत के रूप में यह रोजगार का सुझाव. हमारे मूल अध्ययन में, हम Smad फास्फारिलीकरण केवल वाल्व mesenchyme में बदल गया था कि पता चला है कि एक immunohistochemical विश्लेषण के साथ शुरू हुआ; इस प्रकार, हम वेस्टर्न ब्लॉट के माध्यम से मनाया कोई मतभेद वाल्व mesenchyme 8 में अभिव्यक्ति में परिवर्तन के कारण थे कि आश्वस्त थे. विकासशील बहिर्वाह पथ वाल्व ऐसे एएनपी या विधान परिषद के सदस्य 2v के रूप में एक निलय मायोकार्डियम विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग निलय संदूषण के लिए एक नियंत्रण दाग प्रदर्शन, महान धमनियों और निलय के जंक्शन पर बैठ क्योंकि इसके अलावा, की सिफारिश की है.
वाल्व उनके विकास के दौरान नाटकीय पुनर्गठन से गुजरना है, क्योंकि हम निम्नलिखित चरण विशेष अनुसंधान की पेशकशकुशन / वाल्व और उनके आसपास के ऊतकों के लिए ecommendations. जल्दी कुशन (E9.5-11.5) के लिए, बहिर्वाह पथ और atrioventricular तकिये दोनों आसानी वजह मायोकार्डियम 10 के translucency को कल्पना और विच्छेदित कर रहे हैं; हालांकि, इन भ्रूणों छोटे हैं, और विदारक सुई के बजाय संदंश और microscissors की सिफारिश कर रहे हैं. मध्य चरण भेदभाव (E12.5-14.5) 10, semilunar वाल्व के लिए (यानी, महाधमनी और फेफड़े के धमनी वाल्व) और अधिक आसानी से सुलभ atrioventricular वाल्व से हो सकता है (यानी, मित्राल और त्रिकपर्दी वाल्व). महाधमनी और फुफ्फुसीय धमनी septating और इस समय सीमा 11,12 दौरान घूर्णन कर रहे हैं क्योंकि हालांकि, semilunar वाल्व ध्यान से विच्छेदित किया जाना चाहिए. सावधान ध्यान महाधमनी और फुफ्फुसीय धमनी के आधार के रोटेशन को दी जानी चाहिए, और इन धमनियों के बीच मध्य लगातार पहचान की जानी चाहिए. वाल्व परिपक्वता और संघनन के बाद के चरणों (कमबाद में E15.5 और) 10, मित्राल और त्रिकपर्दी वाल्व निलय अंदर से दूर छेड़ा जा सकता है; हालांकि, semilunar वाल्व और अधिक आसानी से सुलभ होना चाहिए.
पश्चिमी धब्बा विश्लेषण बायोप्सी आकार बड़ा है जहां वयस्क हृदय वाल्व 13, में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर बढ़ाता के लिए एक लंबे समय से चली आ रही तकनीक है. इसके विपरीत, मानार्थ जल्दी भ्रूण विश्लेषण अलग mRNA की छोटी शुरुआती राशि विश्लेषण करने से पहले परिलक्षित किया जा सकता है, जहां प्रतिलेखन पीसीआर, प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने या रिवर्स करने के लिए गैर मात्रात्मक immunohistochemistry या तो पर ध्यान केंद्रित किया है. ये वर्तमान में कार्यरत तकनीक संकेत और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के बारे में कुछ उचित जानकारी उपलब्ध कराने पर मात्रात्मक प्रोटीन के स्तर का आकलन करने की क्षमता की कमी है. इस प्रोटोकॉल के साथ, हम अब मात्रात्मक mRNA अभिव्यक्ति डेटा और immunohistochemical विश्लेषण के साथ संबंध स्थापित करने के लिए मात्रात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति डेटा जोड़ सकते हैं.
इस प्रोटोकॉल तारीफ भ्रूण हृदय वाल्व और इमेजिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति से mRNA के लिए अलग तकनीक की स्थापना की. जैसे, इन तकनीकों के संयोजन प्रोटीन संशोधन-translational पोस्ट करने के लिए mRNA से, ऊपर से अधिक पूरा विश्लेषण के लिए और नीचे विनियमन संकेत दे रास्ते की अनुमति देगा. इसके अलावा, इस तकनीक वर्तमान में उपयोग किया immunohistochemistry तकनीक में वृद्धि होगी जो प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. साथ में, हम इस तकनीक का हृदय वाल्व में रुचि रखते हैं या मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए अन्य विशेष रूप से छोटे ऊतक explants तैयारी किसी भी शोधकर्ता के लिए ब्याज की हो जाएगा कि विश्वास करते हैं.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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