L'analisi dell'espressione proteica nelle giovani valvole embrionali di topo è stata ostacolata dal limitato tessuto disponibile. Questo manoscritto fornisce un protocollo per la preparazione di proteine da regioni valvolari embrionali di topo in via di sviluppo per l'analisi del western blot.
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Articolo metodologico
Proteine Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'analisi Western blot è una tecnica comunemente impiegata per rilevare e quantificare i livelli proteici. Tuttavia, per piccoli campioni di tessuto, questo metodo di analisi potrebbe non essere sufficientemente sensibile per rilevare una proteina di interesse. Per superare queste difficoltà, abbiamo esaminato i protocolli per ottenere proteine da valvole cardiache umane adulte e abbiamo modificato questi protocolli per le controparti di topo embrionali precoci in via di sviluppo. In breve, le regioni della valvola aortica embrionale di topo, compresa la valvola aortica e la parete aortica circostante, vengono raccolte nel volume minimo possibile di un tampone di lisi a base di Tris con inibitori della proteasi. Se necessario in base alla strategia di allevamento, gli embrioni vengono genotipizzati prima di raggruppare quattro regioni della valvola aortica embrionale per l'omogeneizzazione. Dopo l'omogeneizzazione, viene utilizzato un tampone campione basato su SDS per denaturare il campione per l'esecuzione su un gel SDS-PAGE e la successiva analisi western blot. Sebbene la concentrazione proteica rimanga troppo bassa per essere quantificata utilizzando saggi spettrofotometrici di quantificazione delle proteine e avere un campione rimanente per le analisi successive, questa tecnica può essere utilizzata per rilevare e semi-quantificare con successo le proteine fosforilate tramite Western blot da campioni raggruppati di quattro regioni embrionali della valvola aortica di topo al giorno 13,5, ciascuna delle quali produce circa 1 μg di proteine. Questa tecnica sarà utile per studiare l'attivazione della via di segnalazione cellulare e i livelli di espressione proteica durante lo sviluppo precoce della valvola embrionale di topo.
Introduzione
Essere in grado di identificare e quantificare i livelli di espressione della proteina è una tecnica standard per ragioni sanitarie e di esperimenti basati su celle. Tuttavia, nonostante una lunga interesse per lo sviluppo della valvola cardiaca embrionale precoce, valutando l'espressione della proteina in questo tessuto specifico durante lo sviluppo è attualmente limitato a immunoistochimica sia il pulcino e il mouse 1,2. Parte della difficoltà di quantificare l'espressione della proteina nelle valvole di sviluppo della maggior parte degli organismi modello (ad esempio, ceci e topo) è la piccola dimensione delle valvole, che limita la qua....
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Protocollo
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università del North Carolina a Chapel Hill.
1 Excise della valvola aortica
- Utilizzando una tecnica di eutanasia approvato per la fase embrionale di interesse, eutanasia di un mouse incinta con cuccioli al giorno embrionale desiderata (E) dello sviluppo.
- Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare l'addome della femmina incinta. Sollevare la pelle ei muscoli del basso addome alto e lontano dagli organi interni, e sezionare cavità inferiore addominale open femminile per consentire l'accesso al corn....
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Risultati
Utilizzando questa tecnica di preparazione, siamo stati in grado di rilevare fosforilata Smad 1,5,8 (pSmad) nelle singole regioni della valvola aortica da E13.5 embrioni. Come mostrato nella Figura 1A, la proteina isolata da anche una sola regione valvola è sufficiente per rilevare una banda pSmad debole. Intensità del segnale aumenta in proporzione al numero di regioni valvole che vengono pool. È importante sottolineare che il / rapporto β-actina pSmad rimane pressoché costante tra le divers.......
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Discussione
La capacità di quantificare i livelli di proteine nei primi mesi del topo embrionale e pulcino regioni della valvola cardiaca fornisce un ulteriore strumento per la comprensione degli eventi di segnalazione cellulari critici per lo sviluppo della valvola. Il nostro protocollo qui descritto non differisce molto da procedure di isolamento delle proteine standard. Tuttavia, modificando alcuni passaggi chiave, abbiamo ottenuto con successo proteine fosforilate da estremamente campioni di piccole dimensioni. Per ottene.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Andrea Portbury e Davin Townley-Tilson per la lettura critica del manoscritto e il NIH (sovvenzione # R01HL061656) per il sostegno finanziario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| gravido a tempo | Da sezionare allo stadio embrionale di interesse | ||
| Microscopio stereoscopico | Nikon | SMZ645 | |
| 0,1 M Tris, pH 7,6 | |||
| Microforbici | Strumenti per la scienza fine | 15003-08 | |
| Pinze fini, #5 | Strumenti per la scienza fine | 11251-30 | |
| Ago da dissezione titolari | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Aghi da dissezione Ted | Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipetta, 20 &; l, con punte | |||
| Tampone | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Aggiungere 1 compressa a 10 ml di tampone di lisi |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Perline in acciaio inossidabile | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuga |
Riferimenti
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al.
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Ristampe e permessi
