Introduction
Controle de movimento é uma função essencial do sistema nervoso central (SNC). Motricity é a principal saída mensurável da função do SNC ea principal possibilidade para que os indivíduos interagem com o mundo externo. Compreender os princípios da função motora e os mecanismos que estão na base da aprendizagem de uma tarefa motora é atualmente um dos grandes desafios da neurociência. As alterações morfológicas, fisiológicas e moleculares foram encontrados na aquisição de uma tarefa motora nova. Por exemplo, a forma eo número de sinapses mudar em resposta ao treinamento motor hábil 1-5, e foram observadas alterações funcionais da maquinaria sináptica após aprendizagem motora. As respostas sinápticas foram maiores nas ligações da região-representando membro anterior do córtex motor treinados em comparação com o hemisfério não treinado do mesmo animal ou para respostas dos animais não treinados 6,7. Observações electrofisiológicas também sugerem que a potenciação de longo prazo (LTP) e longodepressão -termo (LTD) como mecanismos de ter lugar durante o aprendizado de uma nova habilidade motora, e que a faixa de operação sináptica, que é definida entre as fronteiras limitantes de LTP e saturação LTD, é modificado 8. Além disso, demonstrou-se que os marcadores de actividade e da plasticidade que promovem a moléculas tais como c-fos, GAP-43, ou BDNF, mas também moléculas que inibem a plasticidade, tais como papéis reguladores Nogo-A exibição de plasticidade neuronal relacionada com a aprendizagem 9-16.
Estes avanços no sentido de uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à aprendizagem motora só poderia ser alcançado com o uso de paradigmas comportamentais que permitem o controle preciso da aquisição de uma nova habilidade motora, por exemplo, hábil membro anterior de longo alcance. Apenas uma tarefa comportamental bem estruturado permite monitorar e capturar as alterações correlativas que ocorrem ao tomar conhecimento e execução da respectiva tarefa. Aqui nós demonstrar visualmente uma versão modificada do membro anterior qualificadossingle-pellet atingindo tarefa em ratos adaptados de Buitrago et al. 17 O paradigma apresentado permite a análise da aquisição movimento dentro de uma sessão diária de treinamento (dentro de sessões), representando o componente de aprendizagem rápida e aquisição primária, bem como a aprendizagem motora hábil ao longo de várias sessões (entre as sessões) que representa a componente de aprendizagem lenta e manutenção da tarefa aprendida 18. É importante ressaltar que este paradigma comportamental aumenta o grau de dificuldade e complexidade da tarefa de habilidade motora devido a duas características: primeiro, os ratos são treinados para virar seu eixo após cada alcance e, portanto, para realinhar seu corpo antes da próxima alcance pellet e renovar a orientação do corpo, impedindo execução do movimento constante a partir do mesmo ângulo. Em segundo lugar, os sedimentos são recuperados a partir de um poste vertical colocado em frente da gaiola. Devido ao pequeno diâmetro do post, pelotas pode facilmente ser expulso exigindo um aperto preciso para a recuperação bem sucedida e pREVENÇÃO simples puxar da pelota para o animal.
Tal teste comportamental complexo permite uma percepção mais profunda sobre os mecanismos subjacentes à aprendizagem motora. Comparado com os ratinhos, os ratos são superiores no desempenho de tarefas comportamentais complexas e portanto mais adequado para paradigmas complexos, tal como apresentado no presente estudo. Considerando as crescentes possibilidades genéticas disponível para ratos 19,20, a combinação de métodos de ensaio comportamental precisos e bem controlados com manipulações genéticas, imagiologia e técnicas fisiológicas representa uma caixa de ferramentas poderosas para compreender melhor a base neurobiológica da aprendizagem motora e memória.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações do Serviço Veterinário do cantão Zurique, Suíça.
1. Handling Animal e Habituação
- Manejo dos animais
Nota: 5 dias antes do início da experiência, efectuar o passo 1.1.1 diária.- Para experimentos comportamentais, acostumar os animais para o experimentador. Já diária manipulação sessões com duração de 10-15 minutos por animal. Limpe a caixa após a sessão de cada animal.
- Inicialmente, coloque a mão do experimentador em uma gaiola permitindo que o animal para explorar e cheirar a tornar-se familiarizado com o experimentador.
- Em seguida, levante com cuidado o animal com a mão do experimentador de forma segura, segurando o corpo do rato entre as patas traseiras front e que permitam uma maior familiarização.
- Pesar cada animal diariamente para obter um peso corporal de base antes de privação de alimento.
- Aparelho de Habituação e Familiarização Food
- Pesar cada animal diariamente para obter um peso corporal de base antes de privação de alimento.
- Iniciar a comida privando ratos 3 dias antes do início da pré-formação com uma dieta padrão de laboratório. Submeter ratos 0,05 g de alimento por 1 g de peso corporal por dia (por exemplo, um rato pesando 200 g, começar com 10 g de alimento). Certifique-se de peso corporal a não diminuir mais de 10% por dia de peso corporal por dia através da monitorização.
- Se vários animais são mantidos em uma gaiola, ratos dominantes podem comer mais do que as menos dominantes. No caso de o peso corporal de um animal diminui, alimentar o animal em separado, em vez de alimentação em grupo. Dê ad libitum água.
- Para familiarizar o rato com o aparelho de agarrar, coloque o animal na caixa de treinamento (Figura 1). Já pelotas de açúcar colocados na caixa de formação na proximidade da abertura de fenda para familiarizar o animal com os peletes de alimento. Execute esta stEP 10-15 min por dia durante 3 dias.
2. Pré-treinamento e habilidade Aprendizagem Motora
- Pré-treinamento
- Um dia depois de familiarização, coloque o animal na caixa de treino e coloque a pastilha de perto para a abertura de fenda para que ele possa ser alcançado pela língua do animal. Excluir animais que recuperam pellets com sua pata dianteira durante a pré-formação
Nota: Nesta fase, a recuperação da pelota com a língua é crucial e geralmente o método de escolha do animal. Pelotas deve ser em nenhum caso apreendido com o membro anterior até o primeiro dia de aprendizado de habilidades motoras para permitir um acompanhamento adequado da tarefa atingindo aprendido. Recuperação Pellet com o membro anterior durante a pré-formação é um critério de exclusão e é na maioria dos casos não observados. - Ensina o rato ou a correr para a parte de trás da jaula e voltar para a abertura de fenda ou voltar e virar em torno do seu próprio eixo, a fim de receber a próxima pelete com comidaa lingua. Permitir que o tempo para o animal para explorar a gaiola, executar a parte de trás e voltar para a abertura de fenda. Se o animal não executar corretamente a tarefa, use uma pinça para tocar suavemente na parte de trás final da gaiola e chamar a atenção do animal. Uma vez que o animal é na parte traseira, bater suavemente em frente da gaiola para guiar o animal para a abertura de fenda.
Nota: Uma vez que o animal atinge um valor padrão definido (por exemplo, 50 recuperações de pelotização de sucesso com a língua em menos de 15 min), o animal se qualifica para o estágio de aprendizagem de habilidades motoras. No dia 1 e 2 de pré-treinamento, os alunos já pode ser distinguido do não-aprendentes. Não-aprendentes podem ser excluídos do estudo nesta etapa. Isto diminui a probabilidade de ter um elevado número de não-formandos durante o passo de aprendizagem motora (2.2). - Durante a pré-treinamento, comida privar ratos em uma dieta padrão de laboratório. Dê ad libitum água. Monitor de peso corporal por dia durante todo o estudo. FazNão use o mesmo espaço para treinar ratos machos e fêmeas. Garantir um ambiente calmo e livre de ruído para o animal.
- Um dia depois de familiarização, coloque o animal na caixa de treino e coloque a pastilha de perto para a abertura de fenda para que ele possa ser alcançado pela língua do animal. Excluir animais que recuperam pellets com sua pata dianteira durante a pré-formação
- Determinação de Preferência da pata e habilidade Aprendizagem Motora
- Durante a primeira sessão de aprendizagem de habilidades motoras, substitua a lâmina na frente da janela com um post. Coloque o açúcar pellet cerca de 1,5 cm de distância da janela sobre o post para que o animal não pode alcançar a pelota com a língua, mas apenas recuperá-lo por um membro anterior preciso alcançar e agarrar movimento.
- Para impor a recuperação pellet pelo membro anterior, use uma pinça para trazer suavemente o sedimento perto da boca do animal e retirar o sedimento enquanto o animal tenta consumo com a língua. Realizar esta tarefa repetidamente até que o animal se estende a pata dianteira e agarra uma pelota.
- Coloque o posto central para a abertura da janela. Para determinar a preferência pata, observar cuidadosamente as 10 primeiros ensaios no dia formação 1. Mais de 70% da reaching tentativas (ou seja, 7 out of 10) tem que ser executado com o mesmo membro anterior. Se isso não for alcançado, continue com outra rodada de 10 tentativas até que o limite de 70% seja alcançado.
- Após a determinação preferência pata, mudar o posto para o membro anterior preferida e alinhar central para a borda da abertura da janela. Alinhamento da pata preferidos significa o contrário de pós é deslocado para o respectivo pata para permitir um ângulo óptimo para alcançar (Figura 1B, C).
- Classificar um julgamento, definido como um novo pellet apresentado ao animal, tão bem sucedido (alcançar, agarrar, recuperar e comer o sedimento), queda (chegar, segure e perder sedimento durante a recuperação) ou não (pellet bater no poste). Anote todas as provas em sua folha e analisar os dados após o experimento.
- Realizar uma sessão diária que consiste de um número definido de ensaios (por exemplo, 150) ou um tempo máximo (por exemplo, 1 hora) para cada animal.
- Investigar precisão e ajuste finodo movimento por meio de análise primeira tentativa. A primeira tentativa é definida por agarrando do sedimento em um único movimento monolítico sem interrupção, hesitação ou repetição de componentes de movimento individuais. Observar cuidadosamente cada aperto pelo rato.
- Se o rato hesita ou se retrai durante um alcance ou tentativas de várias tentativas de compreender corretamente o pellet, observe o respectivo julgamento como sucesso, mas não primeira tentativa. Se o animal agarra com sucesso o sedimento em um único alcance monolítico, anote o respectivo julgamento como primeira tentativa bem sucedida em uma coluna separada em sua folha.
- Durante o aprendizado de habilidades motoras, comida privar ratos em uma dieta padrão de laboratório. Dê ad libitum água. Monitor de peso corporal por dia durante todo o estudo.
- Durante a primeira sessão de aprendizagem de habilidades motoras, substitua a lâmina na frente da janela com um post. Coloque o açúcar pellet cerca de 1,5 cm de distância da janela sobre o post para que o animal não pode alcançar a pelota com a língua, mas apenas recuperá-lo por um membro anterior preciso alcançar e agarrar movimento.
- Para experimentos comportamentais, acostumar os animais para o experimentador. Já diária manipulação sessões com duração de 10-15 minutos por animal. Limpe a caixa após a sessão de cada animal.
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Representative Results
Aquisição de habilidades motoras sucesso só é alcançado através da prática consistente. Apesar cuidadosa consideração de todos os aspectos, alguns ratos não saiba a tarefa (Figura 2). Estes "não-aprendentes ou falta de motivação, resultando em poucas ou inexistentes as tentativas de recuperação de pellet a partir do início da experiência ou geralmente perdem o interesse em alcançar para as pelotas que levam à continuamente tentativas fracassadas. Por outro lado, alguns animais apresentam comportamento agressivo e mais motivados, resultando em overhasty e correu agarrar tentativas que levam a falhas. Um terceiro grupo de alunos mal sucedidos são aqueles animais que começam com altas taxas de sucesso e não fazem melhoria significativa levando a estagnar ou mesmo diminuído curvas de aprendizado.
Bem sucedida de aprendizagem de habilidades motoras consiste em duas fases: uma componente de aprendizagem rápida representando aquisição primária normalmente observada no primeiro dia de treinamento motor (dentro de sessões;
Para analisar o desempenho durante cada (análise intra-sessão) por dia de sessão, divida o número total de ensaios em 25 caixas experimentais (por exemplo, seis escaninhos para 150 testes). Após a experiência, calcular a percentagem de peletes captadas com sucesso para cada caixa, dividindo o número de sucessos no respectivo compartimento pelo número total de ensaios sobre o respectivo dia.
Deve-se considerar que a aquisição de habilidades motoras podem variar entre animais individuais. Ratos diferentes precisam de diferentes números de dias para atingir o nível planalto. Assim, curvas de aprendizagem individuais são usuaisly não tão suave como a curva média de aprendizagem.
Outra expressão de aprendizagem motora bem sucedida é a análise da aprendizagem motora fina sintonizado. Para avaliar este aspecto, nós medimos a quantidade de peletes captadas na primeira tentativa durante um movimento monolítico sem hesitação ou perturbação, em comparação com todos os peletes medidos com sucesso (Figura 5).
Os exemplos na Figura 2-5 mostra as curvas de aprendizagem de 150 captadas peletes / dia ao longo de 6 dias. Dia 1 refere-se ao primeiro dia da aprendizagem de motor.
Figura 1: Projeto da caixa de treinamento rato (A) A caixa de treinamento com as respectivas dimensões.. Para evitar a recuperação de peletes que foram perdidas dentro da caixa, no chão da câmara de formação é feita de hastes de metal , Através do qual perdeu pelotas cair. (B) Vista próxima da abertura de fenda e o post. Note-se a posição do pino central, alinhado com a abertura de fenda. (C) Exemplo de um rato que agarra com sucesso uma pelete através da abertura de fenda. Observe a posição pós deslocado e o ângulo resultante em direção membro anterior preferida do animal (neste caso, à direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Exemplo de um animal que não exibia aquisição bem sucedida da habilidade motora ao longo de 6 dias estagna A taxa de sucesso de cerca de 20%, sem melhoria na formação contínua.
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Figura 3: análise intra-dia do mesmo exemplo, como mostrado na Figura 4. A taxa de sucesso é dividido em 6 caixas de peletes 25 que ilustram a melhoria na aprendizagem do motor ao longo de uma sessão única diária. Note-se a taxa de sucesso inicial durante os primeiros 25 ensaios dos primeiros 2 dias, em comparação com a taxa média de sucesso dos respectivos dias na Figura 4, bem como a melhoria geral no dia 1 e 2 em comparação com a Figura 4.
Figura 4:. Exemplo de um animal com uma típica curva de aprendizagem, bem sucedida ao longo de 6 dias, a percentagem de peletes captadas com sucesso (taxa de sucesso) aumenta durante os primeiros 3 dias e atinge um patamar durante os restantes dias.
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Discussion
O paradigma mostrado neste estudo é adaptado de Buitrago et al 18 e difere do sedimento clássica único atingindo paradigma 17 principalmente em dois aspectos.:
Em primeiro lugar, estudar melhoria dentro de sessões permite a análise da tarefa aprendida dentro de um único dia, o que pode fornecer um nível diferente de informação, tais como investigação da componente de aprendizagem rápido em comparação com a componente de aprendizagem lento representada pelos valores médios diários (ver Figuras 3 e 4). Em segundo lugar, o paradigma comportamental aqui apresentado, aumenta o grau de dificuldade e complexidade da tarefa de habilidades motoras. O animal é forçado a realinhar sua orientação corpo e alcançar antes de cada pellet de recuperação. Isto impede execução do movimento repetitivo simples a partir do mesmo ângulo e orientação espacial requer profunda. Além disso, os aglomerados são recuperados a partir de um poste vertical fina que é colocado em frente do the gaiola e coincide com o diâmetro da pastilha exigindo assim um aperto preciso de recuperação bem-sucedida e prevenção simples tracção do sedimento para o animal.
Um passo importante é ensinar o animal para executar a parte de trás da jaula e voltar para a abertura de fenda durante o pré-treino. Indução do rato para a localização desejada utilizando um fórceps e batendo suavemente na parede posterior da gaiola do animal auxilia de compreender a tarefa. O experimentador deve utilizar esta ferramenta com cuidado como overtapping produz muito barulho e irrita o animal. Uma vez que o rato voltou para a frente da gaiola, colocar várias pelotas de açúcar na abertura de fenda para o animal para se acostumar com o sabor, cheiro e localização do sedimento. Outro passo fundamental é a recuperação da pelota com o membro anterior no primeiro dia de aprendizado motor. O animal continua frequentemente tentativas para recuperar o sedimento com a língua como aprendi durante o pré-treinamento. Utilizando um fórceps para trazer suavemente the sedimento perto da boca e retração do sedimento do animal, enquanto o consumo animal tentar com a língua reforça o rato para esticar o membro anterior para a recuperação de pellet bem sucedido. O objetivo é permitir que o animal para compreender o sedimento dos fórceps usando o membro anterior e recuperar o sedimento açúcar até a sua foz. Uma vez que este tenha sido alcançado, os peletes podem ser colocados no poste e preferências determinação da pata pode ser avaliada. Essas duas etapas são as partes mais importantes de todo o experimento e exigem uma abordagem cuidadosa para o animal, bem como a paciência do experimentador.
É importante notar que não existem diferenças na aprendizagem entre animais individuais e entre os sexos (machos aprender mais lento do que as fêmeas) e 18 estirpes (de acordo com a nossa observação, ratos Sprague-Dawley utilizado neste estudo e Long-Evans ratos mostram aprendizagem superior em comparação com por exemplo, ratos Lewis). Assim, a fim de satisfazer o desafio requeremmentos da tarefa, as taxas de sucesso podem exigir modificações do paradigma em função do sexo e tensão. Para manter a baixa variância, não se misturam linhagens e sexo em uma série experimental.
Bem estruturado e paradigmas comportamentais controláveis são de importância crucial para os estudos que investigam correlatos celulares mecanismos de comportamento patológico e fisiológica subjacentes. As tarefas comportamentais mais complexas que os ratos sejam capazes de aprender representam uma importante vantagem de ratos ao longo de ratinhos. Os avanços contínuos nas tecnologias para manipulações genéticas em ratos permitirá em um futuro muito próximo para realizar experimentos em ratos que eram até agora só é possível em camundongos 19-21. Em combinação com novas técnicas de imagem e técnicas que permitem a manipulação orientada de circuitos neuronais, paradigmas comportamentais em ratos pode abrir novos caminhos em direção à compreensão dos princípios fisiológicos e patológicos de funções do sistema nervoso.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações do National Science Foundation suíço (Grant 31003A-149.315-1 para MES e Grant IZK0Z3-150809 a AZ), a AZ Fundação Heidi Demetriades, para MES, o Conselho Europeu de Investigação ('Nogorise') eo Christopher e Dana Reeve Foundation (CDRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Training box | Self Made | ||
| Pedestal | Self Made | ||
| Sugar pellets | TSE Systems Intl. Group | 45 mg dustless precision pellets | |
| Sprague Dawley rats | 5-6 week old males | ||
| Laptop computer | Hewlett Packard | ||
| Stop Watch | |||
| Forceps | Fine Science Tools (FST) | ||
| Excel | Microsoft | ||
| Prism | GraphPad | ||
| Weighing scale | |||
| Counter |
References
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