Introduction
Rörelsekontroll är en central funktion i det centrala nervsystemet (CNS). Motricity är den viktigaste mätbara resultat av CNS-funktion och huvud möjligheten för den enskilde att interagera med omvärlden. Förstå principerna för motorisk funktion och de mekanismer som ligger till grund för inlärning av en motor uppgift är idag en av de stora utmaningarna i neurovetenskap. Morfologiska, fysiologiska och molekylära förändringar konstaterades vid förvärv av en ny motor uppgift. Till exempel, formen och antalet synapser förändras som svar på kompetent motorisk träning 1-5, och funktionella förändringar av synaptiska maskiner observerades efter motorisk inlärning. Synaptic svar var högre i anslutningarna forelimb representerande regionen av utbildad motoriska cortex jämfört med otränade halvklotet av samma djur eller svar från otränade djur 6,7. Elektro observationer tyder också på att långtidspotentiering (LTP) och lång-TERM depression (LTD) som mekanismer ske under inlärningen av en ny motor färdighet, och att utbudet av synaptiska operation, som definieras mellan de begränsande gränser LTP och LTD mättnad, modifieras 8. Vidare har det visats att aktivitetsmarkörer och plasticitet som främjar molekyler såsom c-fos, GAP-43, eller BDNF men även plasticitet hämmande molekyler såsom Nogo-A display reglerande roller för inlärning relaterade neuronal plasticitet 9-16.
Dessa framsteg mot en bättre förståelse för mekanismerna bakom motorisk inlärning kan endast uppnås med hjälp av beteende paradigm som tillåter noggrann kontroll av förvärv av en ny motor färdighet, t.ex. skickliga forelimb gående. Endast en välstrukturerad beteende uppgift gör det möjligt att övervaka och fånga korrelat förändringar som sker vid inlärning och utförande av respektive uppgift. Här visuellt visar vi en modifierad version av den skicklige forelimbenda pellet når uppgift hos råttor anpassade från Buitrago et al. 17 presenterade paradigm möjliggör analys av rörelse förvärv inom en daglig träningspass (inom period) som representerar den snabba lärande komponent och primärt förvärv samt skicklig motorisk inlärning under flera sessioner (mellan-session) som representerar den långsamma lärande komponenten och underhåll av de lärda uppgiften 18. Viktigt ökar detta beteende paradigm svårighetsgraden och komplexiteten i motorisk uppgift på grund av två funktioner: För det första är råttorna utbildade för att vända sin axel efter varje grepp och därmed justera sin kropp innan nästa pellets räckvidd och förnya kroppens orientering, förhindra avrättningen ständig rörelse från samma vinkel. För det andra är pelletar hämtas från en vertikal stolpe placerad framför buren. På grund av den lilla diametern av inlägget, kan pellets lätt avspark kräver en exakt grepp för en lyckad hämtning och preventing enkel dragning av pelleten mot djuret.
En sådan komplex beteendetestning möjliggör djupare insikter i de mekanismer som ligger till grund för motorisk inlärning. Jämfört med möss, råttor är överlägsna i sin prestanda av komplexa beteende uppgifter och därmed bättre lämpad för komplexa paradigm som presenteras i denna studie. Med tanke på de ökande genetiska möjligheter som finns för råttor 19,20, representerar en kombination av exakta och välkontrollerade beteende testmetoder med genetiska manipulationer, imaging och fysiologiska tekniker en kraftfull verktygslåda för att bättre förstå den neurobiologiska grunden för motorisk inlärning och minne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna i veterinärfrågor i kantonen Zürich, Schweiz.
1. Djur Hantering och Tillvänjning
- Djur Hantering
Obs: 5 dagar före starten av experimentet, utför steg 1.1.1 dagligen.- För beteendeexperiment, vänja djuren till försöksledaren. Har dagligen hanterar sessioner som varar 10-15 minuter per djur. Rengör rutan efter varje djur session.
- Inledningsvis placera försöks hand i en bur som tillåter djuret att utforska och lukta att bli förtrogna med försöksledaren.
- Därefter försiktigt lyfta djuret med försöks hand på ett säkert sätt genom att ta tag i råttans kropp mellan fram- och baktassarna möjliggör ytterligare förtrogenhet.
- Väg varje djur dagligen för att erhålla en baslinje kroppsvikt innan livsmedelsbrist.
- Apparater Tillvänjning och livsmedels förtrogenhet
- Väg varje djur dagligen för att erhålla en baslinje kroppsvikt innan livsmedelsbrist.
- Börja mat berövar råttor 3 dagar före början av förberedande utbildning på en standardlaboratoriediet. Ge råttor 0,05 g mat per 1 g kroppsvikt per dag (t.ex. en råtta som väger 200 g, börja med 10 g mat). Se kroppsvikt för att inte minska mer än 10% per dag genom att övervaka kroppsvikt dagligen.
- Om flera djur hålls i en bur, kan dominerande råttor äta mer än mindre dominanta och kära. I fall kroppsvikt hos ett djur minskar, mata djur separat i stället för grupp utfodring. Ge vatten ad libitum.
- Att bekanta råttan med gripapparat, placera djuret i träningslåda (Figur 1). Har socker pellets placeras i utbildningen rutan i närhet till slitsöppningen att bekanta djuret med matpellets. Utför denna step 10-15 minuter dagligen under 3 dagar.
2. Pre-utbildning och motorisk inlärning
- Pre-utbildning
- En dag efter förtrogenhet, placera djuret i träningsrutan och placera pelleten noggrant för att slitsöppningen så att den kan nås av djurets tunga. Uteslut djur som hämtar pellets med sina framben under pre-utbildning
Obs: I det här skedet är avgörande och oftast djurets metod för val pellets hämtning med tungan. Pellets bör inte i något fall förstått med forelimb förrän den första dagen av motorisk inlärning för att möjliggöra adekvat övervakning av den lärde nå uppgiften. Pellets hämtning med forelimb under förberedande utbildning är ett undantag kriterium och är i de flesta fall inte observerats. - Lär råttan att antingen köra på baksidan av buren och återgå till slitsöppningen eller ett steg tillbaka och vända runt sin egen axel för att få nästa mat pellets medtungan. Ge tid för djuret att utforska buren, kör bakåt och återvända till slitsöppningen. Om djuret inte korrekt utföra uppgiften, använd en pincett för att knacka försiktigt i slutet baksidan av buren och fånga djurets uppmärksamhet. När djuret är på baksidan, knacka försiktigt på buren fronten för att styra djuret till slitsöppningen.
Obs: När djuret når en definierad standardvärde (t.ex. 50 framgångsrika pellets hämtning med tungan på mindre än 15 minuter), kvalificerar djuret för motorisk inlärning skede. På dag 1 och 2 av förberedande utbildning, kan de studerande redan skiljas från icke-studerande. Icke-elever kan uteslutas från studien vid det här steget. Detta minskar sannolikheten för att ha ett stort antal icke-elever under motorinlärningssteget (2.2). - Under förberedande utbildning, mat beröva råttor på en standardlaboratoriediet. Ge vatten ad libitum. Övervaka kroppsvikt dagligen genom hela studien. GöraAnvänd inte samma utrymme att träna han- och honråttor. Se till lugn och brusfri miljö för djuret.
- En dag efter förtrogenhet, placera djuret i träningsrutan och placera pelleten noggrant för att slitsöppningen så att den kan nås av djurets tunga. Uteslut djur som hämtar pellets med sina framben under pre-utbildning
- Fastställande av Paw preferens och motorisk inlärning
- Under det första mötet i motorisk inlärning, byt bilden framför fönstret med ett inlägg. Placera socker pellets ca 1,5 cm från fönstret på stolpen så att djuret inte kan nå pelleten med sin tunga, men bara hämta det med en exakt frambensgående och gripa rörelse.
- För att verkställa pellets hämtas av forelimb, använda en tång för att försiktigt föra pelleten nära djurets mun och dra in pelleten medan djuret försöker förbrukning med tungan. Utför denna uppgift repetitivt tills djuret sträcker ut forelimb och griper en pellet.
- Placera stolpen central för fönsteröppningen. För att bestämma tass preferens, noggrant följa de första 10 försök på utbildningsdag 1. Mer än 70% av REACHing försök (dvs 7 av 10) måste utföras med samma forelimb. Om detta inte sker, fortsätter med ytterligare en runda av 10 studier fram till tröskeln på 70% har uppnåtts.
- Efter tass preferens beslutsamhet, flytta posten till den föredragna forelimb och rikta centrala gränsen till fönsteröppningen. Föredragna tass inriktningsorgan stolpen skiftas i motsats till den respektive tass för att möjliggöra en optimal vinkel för att nå (Figur 1B, C).
- Klassificera en rättegång, definieras som en ny pellets presenteras för djuret, som framgångsrik (nå, grepp, hämta och äta pellets), släpp (nå, grepp och förlorar pellets under hämtning) eller underkänd (knock pellet tog i stolpen). Anteckna varje prövning i plåt och analysera data efter experimentet.
- Gör en daglig session består av ett bestämt antal försök (t.ex. 150) eller en maximal tid (t.ex. 1 timme) för varje djur.
- Undersök precision och finjusteringav rörelsen med hjälp av första försöket analys. Ett första försök definieras genom att greppa om pelleten i en enda monolitisk rörelse utan avbrott, tvekan eller upprepning av enskilda rörelsekomponenter. Noggrant följa varje grepp med råttan.
- Om råttan tvekar eller dras in under en räckvidd eller försöker flera försök att korrekt förstå pellets, notera respektive rättegång framgång, men inte första försöket. Om djuret griper framgångsrikt pelleten i en enda monolitisk räckvidd, anteckna respektive rättegång lyckad första försök i en separat kolumn i arket.
- Under motorisk inlärning, mat beröva råttor på en standardlaboratoriediet. Ge vatten ad libitum. Övervaka kroppsvikt dagligen genom hela studien.
- Under det första mötet i motorisk inlärning, byt bilden framför fönstret med ett inlägg. Placera socker pellets ca 1,5 cm från fönstret på stolpen så att djuret inte kan nå pelleten med sin tunga, men bara hämta det med en exakt frambensgående och gripa rörelse.
- För beteendeexperiment, vänja djuren till försöksledaren. Har dagligen hanterar sessioner som varar 10-15 minuter per djur. Rengör rutan efter varje djur session.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik motorisk förvärvet endast uppnås genom praxis. Trots en noggrann genomgång av alla aspekter, några råttor misslyckas att lära sig uppgiften (Figur 2). Dessa "icke-elevernas antingen saknar motivation vilket resulterar i några eller frånvarande försök pellets hämtning från början av experimentet eller allmänt tappar intresset för att nå för pellets leder till ständigt misslyckade försök. Däremot vissa djur visar aggressiva och över motiverat beteende resulterar i förhastad och rusade greppa försök som leder till misslyckanden. En tredje grupp av misslyckade elever är de djur som börjar med hög träffsäkerhet och inte gör betydande förbättring leder till stagnera eller till och med minskade inlärningskurvor.
Framgångsrik motorisk inlärning består av två faser: En snabb inlärning komponent som representerar primär förvärv observeras vanligtvis inom den första dagen av motorisk träning (inom period;
För att analysera utvecklingen under varje daglig session (inom sammanträdesperioden analys), dividera det totala antalet försök till 25 försökspapperskorgar (t.ex. 6 fack för 150 studier). Efter experimentet, beräkna andelen framgångsrikt förstått pellets för varje fack genom att dividera antalet lyckade försök i respektive fack med det totala antalet försök på respektive dag.
Det bör övervägas att motorisk förvärv kan variera mellan enskilda djur. Olika råttor behöver olika antal dagar för att nå platånivå. Således, individuella utbildnings kurvor är vanligaly inte så smidig som den genomsnittliga inlärningskurva.
Ett annat uttryck för framgångsrik motorisk inlärning är analysen av finjusteras motorisk inlärning. För att bedöma denna aspekt, mätte vi antalet pellets förstått på första försöket under en monolitisk rörelse utan tvekan eller störning i jämförelse med alla framgångsrikt uppmätta pellets (Figur 5).
Exemplen i figur 2-5 visar inlärningskurvor av 150 förstått pellets / dag under loppet av 6 dagar. Dag 1 avser den första dagen av motorisk inlärning.
Figur 1: Utformning av råtta utbildning rutan (A) Utbildningen låda med sina respektive dimensioner.. För att undvika hämtning av pellets som gick förlorade i rutan, är grunden för utbildningen kammaren gjord av metallstänger , Genom vilken förlorade pellets falla. (B) Stäng vy av slitsöppningen och stolpen. Notera positionen av stolpen i linje centralt till slitsöppningen. (C) Exempel på en råtta med framgång gripa en pellet genom slitsöppningen. Notera skiftade efter position och den resulterande vinkel mot djurets föredragna forelimb (i det här fallet till höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Exempel på ett djur som inte uppvisade framgångsrika förvärvet av motorisk under loppet av 6 dagar stagnerar Framgången cirka 20% med någon förbättring på vidareutbildning.
annons / 53010 / 53010fig3.jpg "/>
Figur 3: Inom dag analys av samma exempel som visas i figur 4. Framgången är uppdelad i 6 fack av 25 pellets som illustrerar förbättringen i motorisk inlärning under en enda daglig session. Notera den första framgång hastigheten under de första 25 prövningar av de första två dagarna i jämförelse med den genomsnittliga framgång av de respektive dagar i figur 4 liksom den allmänna förbättringen i dag 1 och 2 i jämförelse med figur 4.
Figur 4:. Exempel på ett djur med en typisk, framgångsrik inlärningskurva under loppet av 6 dagar ökar Andelen framgångsrikt förstått pellets (framgång) under de första 3 dagar och når en platå under de återstående dagarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den paradigm som visas i denna studie är anpassad från Buitrago et al 18 och skiljer sig från den klassiska enda pellet når paradigm 17 främst i två aspekter.:
Först studerar inom sammanträdesperioden förbättring möjliggör analys av den lärde uppgift inom en enda dag, som kan ge en annan nivå av information såsom undersökning av snabb inlärning komponent jämfört med den långsamma lärande komponenten som representeras av den genomsnittliga dagskursen (se figur 3 och 4). För det andra, beteende paradigm presenteras här ökar svårighetsgraden och komplexiteten i motorisk uppgift. Djuret tvingas omstrukturera sin kropp och nå orientering före varje pellet hämtning. Detta förhindrar enkla utförande repetitiva rörelser från samma vinkel och kräver djup rumslig orientering. Dessutom är pelletar hämtas från en tunn vertikal stolpe som är placerad framför the bur och matchar diametern hos pelleten vilket sålunda kräver en exakt grepp för framgångsrik hämtning och förhindra enkel dragning av pelleten mot djuret.
Ett viktigt steg är att lära djuret att löpa på baksidan av buren och återgå till slitsöppningen under förträning. Hinting råttan till önskad plats med hjälp av en pincett och försiktigt knacka på buren baksida hjälper djuret att förstå uppgiften. Försöksledaren ska använda det här verktyget noggrant som overtapping producerar för mycket buller och irriterar djuret. När råttan har återgått till den främre delen av buren, placera flera socker pellets vid slitsöppningen för djuret att vänja med smak, lukt och placering av pelleten. En annan avgörande steg är pellets hämtning med forelimb på den första dagen av motorisk inlärning. Djuret fortsätter ofta försök att hämta pellets med tungan som lärt sig under förberedande utbildning. Med hjälp av en pincett för att försiktigt föra the pelleten nära djurets mun och tillbakadragning av pelleten medan djurets försök förbrukningen med tungan verk råttan att sträcka ut forelimb för framgångsrik pellets hämtning. Målet är att göra det möjligt för djuret att förstå pellets från tången genom att använda forelimb och hämta socker pellets till sin mun. När detta har uppnåtts, kan pellets placeras på posten och tasspreferens beslutsamhet kan utvärderas. Dessa två steg är de viktigaste delarna av hela experimentet och kräver en noggrann inställning till djur samt försöks tålamod.
Det är viktigt att notera att skillnader i inlärnings existera mellan individuella djur och mellan kön (hanar lär långsammare än honor 18) och stammar (enligt vår observation, Sprague-Dawley-råttor användes i denna studie och Long-Evans råttor visar överlägsen inlärning jämfört med t.ex. Lewis-råttor). Således, för att möta det utmanande kräverkraven i uppgiften, kan andelen framgångsrika kräva ändringar av paradigm beroende på kön och påfrestningar. För att hålla variansen låg, inte blanda stammar och kön i en experimentell serie.
Välstrukturerat och kontrollerbara beteende paradigm är av avgörande betydelse för studier som undersöker cellulära korrelat bakomliggande mekanismerna av patologiska och fysiologiska beteende. De mer komplexa beteende uppgifter att råttor har förmåga att lära sig representera en viktig fördel med råttor över möss. De pågående framsteg inom teknik för genetiska manipulationer i råttan gör det möjligt inom en mycket snar framtid att göra experiment på råttor som var så långt endast möjlig hos möss 19-21. I kombination med ny teknik imaging och tekniker som gör det möjligt riktad manipulation av neuronala kretsar, kan beteende paradigm i råttor öppna nya vägar mot förståelsen av fysiologiska och patologiska principer för nervsystemets funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Swiss National Science Foundation (Grant 31003A-149.315 till 1 till MES och Grant IZK0Z3-150809 till AZ), till AZ Heidi Demetriades Foundation, att MES Europeiska forskningsrådet (Nogorise ") och Christopher och Dana Reeve Foundation (CDRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Training box | Self Made | ||
| Pedestal | Self Made | ||
| Sugar pellets | TSE Systems Intl. Group | 45 mg dustless precision pellets | |
| Sprague Dawley rats | 5-6 week old males | ||
| Laptop computer | Hewlett Packard | ||
| Stop Watch | |||
| Forceps | Fine Science Tools (FST) | ||
| Excel | Microsoft | ||
| Prism | GraphPad | ||
| Weighing scale | |||
| Counter |
References
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Fu, M., Zuo, Y.
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Yu, X., Zuo, Y.
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290, 533-536 (2000).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Hess, G., Donoghue, J. P. Strengthening of horizontal cortical connections following skill learning. Nature neuroscience. 1, 230-234 (1998).
- Rioult-Pedotti, M. S., Donoghue, J. P., Dunaevsky, A.
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66, 198-204 (2010).
- Ghiani, C. A., Ying, Z., de Vellis, J., Gomez-Pinilla, F. Exercise decreases myelin-associated glycoprotein expression in the spinal cord and positively modulates neuronal growth. Glia. 55, 966-975 (2007).
- Josephson, A., et al. Activity-induced and developmental downregulation of the Nogo receptor. Cell and tissue research. 311, 333-342 (2003).
- Karlen, A., et al. Nogo receptor 1 regulates formation of lasting memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20476-20481 (2009).
- Kleim, J. A., Lussnig, E., Schwarz, E. R., Comery, T. A., Greenough, W. T. Synaptogenesis and Fos expression in the motor cortex of the adult rat after motor skill learning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 4529-4535 (1996).
- Mironova, Y. A., Giger, R. J. Where no synapses go: gatekeepers of circuit remodeling and synaptic strength. Trends in neurosciences. 14, 7-23 (2013).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. Neuroscience. 14, 7-23 (2013).
- Zemmar, A., et al. Neutralization of Nogo-A enhances synaptic plasticity in the rodent motor cortex and improves motor learning in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 8685-8698 (2014).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural brain research. 41, 49-59 (1990).
- Buitrago, M. M., Ringer, T., Schulz, J. B., Dichgans, J., Luft, A. R. Characterization of motor skill and instrumental learning time scales in a skilled reaching task in rat. Behavioural brain research. 155, 249-256 (2004).
- Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Tews, B., et al. Synthetic microRNA-mediated downregulation of Nogo-A in transgenic rats reveals its role as regulator of synaptic plasticity and cognitive function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 681-683 (2013).
