Summary
Mens transport af celleoverfladeproteiner relativt let studeres, visualisere handel med intracellulære proteiner er meget vanskeligere. Her bruger vi konstruktioner inkorporerer fotoaktiverbare GFP og demonstrere en metode til nøjagtigt at følge amyloidprecursorproteinet fra Golgi-apparatet til ned-stream rum og følge dets clearance.
Abstract
Beta-amyloid (Ap) er den vigtigste bestanddel af senile plaques fundet i hjernen hos patienter med Alzheimers sygdom. Ap er afledt af den sekventielle kløvning af amyloidprecursorprotein (APP) ved β og y-sekretaser. Trods betydningen af Ap til AD patologi, er den subcellulære lokalisering af disse spaltninger ikke veletableret. Arbejde i vores laboratorium og andre implicerer den endosomale / lysosomale-system i APP behandling efter internalisering fra celleoverfladen. Men den intracellulære handel med APP er relativt dublerede.
Mens celleoverfladeproteiner er amendable for mange mærkningsteknikker, er der ingen enkle metoder til at følge handel med membranproteiner fra Golgi. Til dette formål har vi skabt APP konstruktioner, der blev mærket med foto-aktiverbar GFP (paGFP) ved C-terminalen. Efter syntese, paGFP har lav basal fluorescens, men det kan stimuleres med 413 nm lys to producere en stærk, stabil grøn fluorescens. Ved at bruge Golgi markør galactosyltransferase koblet til Cyan fluorescerende protein (GalT-FFP) som et mål, vi er i stand til præcist photoactivate APP i trans-Golgi netværket. Foto-aktiverede APP-paGFP kan derefter følges, da det trafikker til downstream rum identificeret med fluorescens-mærkede rum markørproteiner til tidlig endosom (Rab5), den afdøde endosom (Rab9) og lysosomet (LAMP1). Endvidere benyttes inhibitorer til APP-processering, herunder chloroquin eller γ-sekretase hæmmer L685, 458, er vi i stand til at udføre puls-chase-eksperimenter for at undersøge behandling af APP i enkelte celler.
Vi finder, at en stor del af APP hurtigt bevæger sig til lysosomet uden at virke på celleoverfladen og derefter fjernet fra lysosomet af sekretaselignende spaltninger. Denne teknik demonstrerer anvendeligheden af paGFP til at følge handel og forarbejdning af intracellulære proteiner from Golgi til downstream rum.
Introduction
Kendetegnende for Alzheimers sygdom (AD) er tilstedeværelsen af senile plaques og neurofibrillære tangles (NFT'er) i hjernen. Hovedbestanddelen af senile plaques er β-amyloid (Ap). Ap er afledt af dets precursor; amyloidprecursorprotein (APP) 1. Det amyloidogene spaltning af APP begynder med fjernelse af ektodomænet fra APP med β-sekretase 2. De resterende 99 rester carboxylterminale fragment (CTF) kan spaltes ved γ-sekretase til frembringelse af Ap 3-7. Mens mange eksperimenter har dokumenteret spaltningen af celleoverfladen APP efter internalisering fra celleoverfladen i endosomale / lysosomale system har en række nyere undersøgelser antydet, at intracellulær handel med APP er også vigtig i reguleringen forarbejdning 8-11.
Der har været en række forsøg på at modulere niveauerne af Ap med y-sekretase hæmmere og Ap Immunotherapies. De seneste kliniske forsøg med disse behandlinger viste ingen fordel, og i nogle tilfælde, forårsagede skade 12. Et uudnyttet strategi til at modulere Ap produktion er at ændre sub-cellulære lokalisering af APP og γ-secretase interaktion. Golgi, plasmamembran, og endosomer / lysosomer er alle blevet foreslået som mulige steder til γ-spaltning af APP. Forskning fra vores laboratorium viser, at APP og γ-sekretase er bosiddende proteiner af lysosomale membran 13. Endvidere har vi fundet, at det lysosomale γ-sekretase har en sur optimale pH 13. Desuden alkalisering af det endosomale / lysosomale systemet med chloroquin eller NH4CI, har vist sig at mindske produktionen af Ap 14. y-sekretase hæmning eller knockout eller Presenilin fører til APP-CTFs akkumulering i lysosomen 15-17. Desuden forstyrrer APP endocytose sænker AP-dannelse 18-20.
Trods betydningen af Golgi som sorteringsstation på vordende og proteiner genanvendt fra det endosomale / lysosomale system, har den intracellulære handel med APP ikke undersøgt i detaljer 21. Nyligt arbejde har vist, at APP kan recirkuleres til trans-Golgi-netværket (TGN) via interaktion med retromer kompleks. Nedregulering af retromer kompleks nedsætter Ap-produktion 8,22-24. Imidlertid udgang af APP fra Golgi er ikke godt undersøgt.
Mens efter endocytose af celleoverfladeproteiner, såsom transferrinreceptoren, let mærkes og følges, er mere udfordrende efter handel med intracellulære proteiner. Faktisk har nogle proteiner havde deres intracellulær transport afbildes. Fremkomsten af fluorescerende protein-tags, såsom foto-aktiverbar-GFP (paGFP), har givet nye redskaber til at undersøge intracellulær menneskehandel. Foto-aktiverbart-GFP er en form for GFP, som er næsten usynlig efter syntese, men udvikler en stærk grøn (GFP) fluorescens efter at være aktiveret ved 413 nm laserlys og dette signal er stabil i dage 25,26. Konstruktioner hjælp paGFP er blevet brugt til at demonstrere intralysosomal handel med det lysosomale protein membranprotein 1 (LAMP1) 25, levering celleoverfladen af vesikulær stomatitis Virus Glycoprotein (VSVG, en markør for sekretionsvejen) 27, og omsætningen af peroxisomer 28 og autophagosomes 29.
For at visualisere sorteringen af APP fra TGN i levende celler, har vi designet plasmid, der udtrykker de sidste 112 aminosyrer af APP koblet til foto-aktiverbar (paGFP) på C-terminalen (benævnt SAPP-paGFP) 30. Vi har også udført disse eksperimenter med fuld længde APP og opnået lignende resultater; Den PAPP-konstruktionen anvendes her, fordi det giver lysere billeder. Vi derefter foto-aktivere &# 946; APP-paGFP kun i TGN, som afgrænset af TGN markør galactosyltransferase (GalT). Selvom APP er blevet mærket med paGFP at visualisere hurtig axonal transport af APP og clearance fra perinukleære region, dette er den første demonstration af APP menneskehandel fra en nøje defineret rum til et andet 11,31,32. Her viser vi præcis foto-aktivering i TGN og udgang af APP til downstream rum og efterfølgende spaltning og clearance fra lysosomer 30. Den nøjagtige fotoaktivering i Golgi er bredt anvendelig til andre protein-systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Plating og transfektion
- I en cellekultur hætte, plade ~ 300.000 til ~ 500.000 SN56 celler (en venlig gave fra Dr. Jane Rylett) på en 35 mm med glasbund konfokal skål og dæk med præ-transfektion medier (Dulbeccos Modified Eagle Medium, DMEM, suppleret med 10% FBS).
- Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator for at formere sig.
Bemærk: Celler bør være ca. 50% -70% konfluente før transfektion. - I en cellekultur hætte, transficere celler med plasmider, der udtrykker et fluorescerende protein tagged TGN markering (galactosyltransferase koblet til Cyan fluorescerende protein, GalT-CFP), et fluorescerende protein tagged rum markør (her, lysosomer associeret membranprotein 1, LAMP1, mærket med mRFP), og proteinet af interesse tagget med paGFP (PAPP-paGFP). (Disse konstruktioner er tidligere blevet beskrevet 30)
- Cellerne inkuberes med transfektionsreagens og plasmid-DNA feller 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Brug et forhold på ~ 2 ug DNA til 5 pi transfektion middel (f.eks Lipofectamine 2000) til bedste balance cytotoksicitet og transfektionseffektivitet. Kan være nødvendigt at være optimeret til forskellige plasmider faktiske koncentrationer. I forsøgene er beskrevet her, skal du bruge 1 pg / konfokal skål SAPP-paGFP, 0,3 ug / konfokal skål LAMP1-mRFP, og 0,2 pg / konfokal fad for Galt-fælles fiskeripolitik.
Bemærk: Mængden af plasmid anvendes, vil afhænge transfektionseffektivitet. - For neuronale cellelinjer: Efter trin 1.4, i en cellekultur hætte, fjernes forud for transfektion medier og differentiere SN56 celler i 2 ml DMEM suppleret med 0,1% penicillin / streptomycin med 1 mM dibutyryl cyklisk AMP (dbcAMP) i 24 timer.
2. mikroskopbordet Forberedelse
- Pre-varm phosphatbufret saltvand (PBS) og Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) til 37 ° C. Warm-up mikroskopbordet før imaging til 37 ° C.
- Vask cellerne to gange med PBS for at fjerne differentiering medier og erstatte med 2 ml HBSS ved 37 ° C. Place celler på objektbordet opvarmet til 37 ° C.
Bemærk: Celler er levedygtige i ca. 1,5-2 timer i HBSS. - Tillad 5-10 min for konfokal pladetemperatur at ækvilibrere med objektbordet.
3. Foto-aktivering af ROIs over Golgi
- Med mikroskopet okular, find celler transficeret med GalT-fælles fiskeripolitik, LAMP1-mRFP, og PAPP-paGFP.
- Brug en olie-nedsænkning linse med høj forstørrelse (dvs. 63X eller 100X). Til visuel kropsbygning af fluorescens, bruge et filter sæt i stand til at visualisere FITC (til fælles fiskeripolitik og GFP-fluorescens) og rhodamin (til mRFP fluorescens).
- Indstil det konfokale skive for hver kanal til 1 um. Tag et billede med lav opløsning.
- Beskær til billedet kun cellen af interesse.
- Brug justeringsknappen, manuelt indstillebrændplanet til midten af cellen. Det er typisk den del af den celle, hvor kernen er den største.
- Tegn 3-5 cirkulære regioner Interesser (ROI'er) i TGN (GalT-FFP fluorescens).
- For at tegne ROIs (dvs. i Zeiss LSM-programmet), vælg knappen 'Rediger ROI "i kommando-konsollen.
- Vælg knappen cirkulære ROI.
- Klik og træk i GalT-FFP positive områder af cellen.
Bemærk: De foto-blegning pakker for mange mikroskoper har denne mulighed.
- Tag et billede af cellen med overlejret ROI'er. Gem en kopi af ROI'er til senere brug.
- Hvis du vil gemme ROI'er til billedet, skal du vælge 'Makro' knappen.
- Tryk på knappen 'Load' for at starte den "CopyRoisToOverlay« (filsti: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
Bemærk: En konfokal mikroskop udstyret med 475-525 nm (FFP) band pass (BP), en 500-530 nm BP (GFP),og en 560 nm lang pasning (LP) filter sæt er påkrævet. En argon laser til 458 nm og 488 nm emission og en HeNe laser til 540 nm emission er også påkrævet.
- Set-up mikroskopet for en blegemiddel tidsforløb.
- Indstil laser diode (25 mW 405 nm laser) til maksimal effekt.
Forsigtig: Overdreven foto-aktivering kan føre til foto-toksicitet eller skader på cellulære membraner. Brug øjenbeskyttelse for at undgå beskadigelse af nethinden. - Set-up mikroskopet for 120 cyklusser af billeddannelse.
Bemærk: En billedoptagelsescyklus består af blegning i ROI'er og billeddannelse af hele cellen. Dette er et blegemiddel tidsforløb. - Indstil mikroskopet at blege (foto-Aktivér) kun ROI'er i 20-30 gentagelser efter hvert billede. Tiden til billede og blegemiddel et billede vil variere. Indstil en tidsforsinkelse mellem billeder, så hver cyklus er ca. 30 sek.
Bemærk: billeddannende del af hver cyklus tager ca. 15-30 sek afhængigt af billedstørrelsen. Blegning for hver ROI er omkring 50 msek. Blegning af alle 4 ROI'er til 20 gentagelser vil tage 4 sek ved udgangen af hvert blegemiddel / billede cyklus.
- Indstil laser diode (25 mW 405 nm laser) til maksimal effekt.
- Start blegemiddel tidsforløbet.
- Sluk blegning efter 15 min (30 cyklusser af billeddannelse og blegning), men fortsætte med at tage billeder af cellen.
Bemærk: Tid 0 til 15 minutter er "puls" periode. - Fortsæt med at tage billeder i 45 min (uden blegning), til at følge clearance af PAPP-paGFP.
Bemærk: Tid 15 til 45 minutter er "jagt" periode. - Anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i trin 6 analysemetode, co-lokalisere proteinet af interesse (her PAPP-paGFP) med rum af interesse (her, LAMP1-mRFP) ved at overflader til hver kanal.
4. Bestem Downstream Rum
- For at bestemme om lysosomer (i disse forsøg) er den endelige rum, tilsæt membran-permeable proteaseinhibitorer at forårsage proteiner ophobes i lysosomet.
- For SAPP, bruge 0,5 uM L685, 458 (specifik γ-sekretase hæmmer) natten over eller 100 uM chloroquin (deacidifies lysosomer) i 30 minutter før billeddannelse.
- Find celler og photoactivate som i trin 3.1 - 3.8.
- Billede cellen yderligere 45-min (uden fotoaktivering) at bestemme, hvor PAPP-paGFP akkumuleres i fravær af spaltning.
- Analyser levering af protein til lysosomer (eller andre nedstrøms rum) og efterfølgende clearance ifølge fremgangsmåden beskrevet i trin 6 fremgangsmåde.
5. sikre nøjagtigheden af Photo-aktivering i Golgi
- Warm-up HBSS til 37 ° C.
- Der fremstilles en 2 ml opløsning for hvert konfokal plade, der skal afbildes, 66 pM nocodazol (behandling) eller DMSO (kontrol) i HBSS.
- For en konfokal plade, pipette 2 ml 37 ° C HBSS, og der tilsættes 7,96 pi nocodazol fra en 16,60 mM nocodazol lager.
- Som en kontrol, sålution afpipetteres 2 ml 37 ° C HBSS i en 2 ml rør, og der tilsættes 7,96 pi DMSO.
- Cellerne inkuberes i HBSS med nocodazol eller DMSO i 5 minutter før billeddannelse.
- Find celler som i trin 3.1.
- Før fotoaktivering, forberede mikroskopet til at tage en Z-stack efter den periode foto-aktivering.
- Klik på "Z Stack 'knappen. Starte scanning ved hjælp af Fast XY.
- Juster brændplanet med mikroskop justeringsknappen til toppen af cellen den. Tryk på 'Mark First' for at indstille den første position i stakken.
- Juster brændplanet med mikroskop justeringsknappen til bunden (tættest på glas) af cellen. Tryk på 'Markér sidste' for at indstille den sidste position i stakken.
- I Z stakken panelet, skal du trykke på 'Z sektionering' knappen. Indstil 'Interval' til 1 um.
Bemærk: Ved en højere rumlig opløsning stable en mindre stack interval, men flere billeder bliver nødt til attages forlænge imaging perioden for stakken.
- Blege cellerne, som beskrevet i trin 3,7-3,8. Foto-aktivere og billedet fra 0 min til 15 min (30 billeder).
- Stop billedbehandling efter 30 frames. Spare Umiddelbart et billede af videoen.
Advarsel: Nogle mikroskoper kan overskrive første video, hvis det ikke er gemt, før du starter en anden billeddannelse sekvens. - Når du har gemt videoen, straks erhverve en Z-stack, ved hjælp af parametrene fra trin 5.5.
- Co-lokalisere PAPP-paGFP med GalT-CFP (eller anden Golgi markør), som beskrevet i trin 6.
Bemærk: FFP photobleaches hurtigt, og må ikke være synlige ved udgangen af det billeddannende periode. Colokalisering måske ikke muligt med GalT-fælles fiskeripolitik. Hvis colokalisering er påkrævet, bruge mRFP at mærke GalT.
6. Vesikel Filtrering og colokalisering
- Brug et analyseprogram (f.eks Imaris) for at gøre overflader af rummet (f.eks LAMP1-mRFP) og et protein of interesse (f.eks PAPP-paGFP).
- Indtast afsnittet 'Overgå "af analysen programmet ved at klikke på knappen Overgå på den øverste menubjælke.
- Vælg Surface guiden knappen øverst til venstre mest panel (5 th knap fra venstre).
- Vælg en kanal for at filtrere vesikler (dvs. PAPP-paGFP fluorescens, protein af interesse).
- Udfør baggrundssubtraktion ved at indsende diameteren af den største vesikel i feltet til guiden og tryk næste. Analysen Programmet vælger automatisk - baseret på en tærskel afledt af største vesikel i marken - et område i kanalen af interesse.
- Manuelt justere tærsklen baggrunden for at forfine valget, hvis nødvendigt.
- I bunden af skærmen til valg Threshold, kontrollere 'Split rørende objekter' mulighed for at adskille den kombinerede overflader.
Bemærk: Hvis mange vesikler er tæt grupperet tilGether, analysen vil programmet gruppe disse objekter under en overflade.- Vælg 10-15 repræsentative vesikler og beregne den gennemsnitlige vesikel diameter og indtast resultatet i guiden.
- Forfine de valgte kimpunkter ved forøgelse eller formindskelse tærsklen på "kvalitet" (intensitet af kanalen i midten af hver plet).
Bemærk: Overflader af kanalen af interesse vil blive oprettet. Yderligere raffinering af de udvalgte overflader kan udføres på dette tidspunkt. Threshold vesikler baseret på antallet af pixels i hver vesikel. - Maskere oprindelige kanal med denne overflade. At maskere, vælg den 4. fane fra venstre i skabelsen overflade guiden (blyant) den.
- Vælg 'Mask Alle ". En ny kanal med vesikler af interesse vil blive oprettet.
Bemærk: Under masken proces en mulighed for at kopiere den oprindelige kanal, der tilbydes. Vælg denne indstilling, hvis den oprindelige data skal gemmes. - Gentag sbeskæftigelsespagterne 6.1 gennem 6.7 for ufiltreret kanal (dvs. LAMP1 mRFP, rum).
- Øverst værktøjslinjen, skal du vælge colokalisering værktøj.
- I toppanelet, som histogrammer af kanalerne skal colocalized vises, skal du vælge den nyligt oprettede maskerede kanaler.
- Vælg alle tilgængelige data. Der er mørke pixels, der undertiden til stede efter analyse. Vælg ikke disse pixels i histogrammet, vil de forvrænge resultaterne.
- I langt højre panel, vælg 'Build Coloc Channel'. Dette skaber en ny kanal, der kun indeholder de colocalized pixels. Dataene vil være i det samme panel under "kanalstatistikker 'knappen. Data kan eksporteres som en .csv-fil.
- Brug 'Procent af materiale colocalized' statistik. Denne indstilling tager hensyn til intensiteten af pixels og størrelse af objektet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske resultater viser SAPP forlader TGN og synes at trafikken hurtigt til LAMP1 (figur 1a og b). I perioden fotoaktivering, kan vesikler ses afgående Golgi bestemt til lysosomer (1b figur). Uden inhibitor behandling vil paGFP fluorescens være synlig i lysosomer mens der er fotoaktivering i TGN. Efter standsning fotoaktivering, er PAPP-paGFP hurtigt fra lysosomet (sammenlign figur 1a til 1b). Behandling med nocodazol fører til akkumulering af APP i GalT-FFP mærkede segmenter og forhindrer handel til lysosomer (figur 1c).
Den svenske mutation af APP (APPsw) forøger β-spaltning ved 10-fold 34. Med hurtig spaltning af βAPPsw-paGFP, vises paGFP fluorescens som en diffus fluorescenssignal i cytosolen. Formentlig dette jegs resultatet af en hurtig SAPP spaltning med γ-sekretase befriende den C-terminale paGFP i til cytoplasmaet (figur 2). I nærvær af γ-sekretase hæmmer, SAPP ophobes i lysosomerne.
Efter levering af pAPP til lysosomet er paGFP fluorescens ryddet hurtigt. Den korte opholdstid kunne være resultatet af handel fra lysosomet til et andet rum. Omvendt ville forventes spaltning af PAPP af γ-sekretase fører til diffusion af paGFP fluorescens fra den lysosomale membran (figur 3a). Den diffuse fluorescens er vanskeligere at påvise ved konfokal mikroskopi. For at bestemme om PAPP leveres til et andet rum eller ryddet, blev SN56 celler behandlet med en specifik inhibitor mod γ-sekretase (L685, 458) eller et alkaliniseringsmiddel (chloroquin). Tilsætningen af enten L685, 458 eller chloroquin resulterede i APP akkumulering i lysosomer (
Det er almindeligt accepteret, at APP leveres til celleoverfladen inden de endocytose og forarbejdet i endosomer og lysosomer 35. Men i vore ubehandlede celler, celle-overflade SAPP kunne ikke påvises ved konfokal mikroskopi. Foto-aktiveret SAPP må ikke være koncentreret i en specifik region af plasmamembranen. I stedet kan der være en diffus fluorescens over den store overfladeareal af plasmamembranen. Interessant, γ-sekretase hæmmer behandling fører til detekterbar PAPP-paGFP på celleoverfladen (fig 3b). γ-sekretase hæmmer behandling kan rute mere PAPP til celleoverfladen, udover at inhibere enzymet funktion. Derfor det store overfladeareal af plasmamembranen spreder paGFP over et større område og gør detektion vanskelig, selv om proteinet trafikerede til rummet.
1 "src =" / files / ftp_upload / 53153 / 53153fig1.jpg "/>
Figur 1. Imaging handel med APP til lysosomer. SN56 celler blev transficeret med LAMP1-mRFP, GalT-fælles fiskeripolitik, og PAPP-paGFP. A) Cellen var nøjagtigt foto-aktiveres inden ROIs placeret over Golgi (ROIs angivet med hvide cirkler ). Cellen var alternativt foto-aktiveret og filmede i 15 minutter for at afgøre PAPP-paGFP menneskehandel. Indsat viser menneskehandel i perinukleære område fra Golgi til lysosomer. Co-lokaliserede pixel vises gul. B) handel med en vesikel indeholdende PAPP-paGFP til lysosomet. Gule pixels angiver LAMP1 og PAPP-paGFP colokalisering. C) SN56 celler blev behandlet med nocodazol før billeddannelse at forhindre PAPP-paGFP udgang fra TGN. En repræsentativ billede taget fra slutningen af den periode fotoaktivering. I det højre panel, en Z-stak af den samme celle umiddelbart efter foto-aktivering. Th e GalT-fælles fiskeripolitik har været falsk farvet rødt for at forbedre visualisering af colocalized GalT-fælles fiskeripolitik og PAPP-paGFP. Gule pixels betegner colokalisering mellem GalT-fælles fiskeripolitik og PAPP-paGFP. Scale søjler repræsenterer 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. handel med βAPPsw-paGFP. SN56 celler blev transficeret med LAMP1-mRFP, GalT-fælles fiskeripolitik og βAPPsw-paGFP (pAPP med familiær svenske mutation). Den svenske mutation øger hastigheden, som APP spaltes. Celler blev alternativt inden Golgi foto-aktiveret og afbildes. En diffus fluorescens kan ses efter paGFP frigøres fra den lysosomale membran til at diffundere ind i cytoplasmaet. Skala søjle repræsenterer 5 um.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fastsættelse af terminalen organel. SN56 celler blev transficeret med LAMP1-mRFP, GalT-fælles fiskeripolitik og PAPP-paGFP. Efter fotoaktivering, blev celler fulgt i yderligere 45 min. De to venstre-de fleste paneler viser cellerne før fotoaktivering (længst til venstre) og 15 minutter efter fotoaktivering (midten). Panelet yderst til højre viser APP fluorescens efter 45 min af den samlede billeddannelse i a) ubehandlet, b) γ-sekretase hæmmer behandlet, eller c) chloroquin behandlet. Pilespidser peger på APP co-lokaliseret med LAMP1 efter 45 min af billeddannelse. Scale søjler repræsenterer 5 um. Klik her for at se en større version af ther figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknik beskriver den nøjagtige foto-aktivering af membranproteiner tagget med paGFP i TGN at visualisere efterfølgende handel og spaltning. Mens paGFP blev skabt over et årti siden 25, det er det første eksempel på præcis foto-aktivering at følge handel med spirende proteiner til downstream rum. Tidligere undersøgelser under anvendelse af APP-paGFP konstruktioner foto-aktiveret et peri-nuklear region af cellen, hvilket blev anset for at være Golgi 11. Imidlertid kan så tydeligt i vores mikrofotografier, lysosomer, endosomer tidlige og sene endosomer også findes i denne region (figur 1 og reference 30). Disse forsøg er blevet kørt med succes i HEK293-celler, COS7-celler, neuronale celler, SN56 SH-SY5Y-celler og muse-neuroner, selvom transfektionseffektiviteten af muse-neuroner er lav. Lignende forsøg er blevet udført ved hjælp af fuld længde APP konstruktioner og forkortede konstruktioner, som omfatter den sidste 112 aminosyrer af APP, med p- og γ-spaltningssteder, fusioneret til paGFP. De forkortede konstruktioner er lettere at transficere og give en højere fluorescerende signal, og disse er vist i de medfølgende figurer. Vores forkortede konstruktioner mangler også den N-terminale ectodomænet, som har udefinerede spaltninger og sortering signaler 38. På trods af disse N-terminale signaler og spaltninger, finder vi, at vores forkortet konstruktion har lignende lokalisering og menneskehandel som en fuld-længde APP-paGFP 30, 33.
På grund af de mange organeller i peri-nukleare område af cellen, blev alt tilrettelagt sikre nøjagtigheden af foto-aktivering. Under billedbehandling periode vil cellen og Golgi flytte. Derfor skal de foto-aktivering ROIs overvåges nøje i den periode, foto-aktivering og justeres til at forblive på toppen af Golgi. Konfokale mikroskoper er følsomme over for små ændringer i temperaturen. For eksempel AC eller opvarmning ventilationskanaler over microscope kunne resultere i en ændring af den billeddannende flyet.
For at opretholde overensstemmelsen mellem eksperimenter, vi har sat en tidsforsinkelse mellem hvert foto-aktivering / imaging cyklus. Tiden er forpligtet til at blege ROI'er og billede cellen. Afhængigt af størrelsen af cellen og antallet af ROI'er, at tiden blege og tage et billede vil variere. For at opretholde konsistens fra billede til billede, skal du indstille en tidsforsinkelse mellem billeder, så hvert billede, herunder blegning, kræver cirka 30 sekunder. Øget tidsopløsning kan opnås ved anvendelse af detektionssystemer, der anvender en stråle shaper (f.eks LSM5 live detektor). Disse mikroskoper kan billede på 120 billeder / sekund uden tab af opløsning.
For at bekræfte nøjagtigheden af foto-aktivering, er det bydende nødvendigt at udføre en nocodazol kontrol. Ved at blokere transport ud af Golgi under fotoaktivering, sikrer det, at paGFP ikke bliver væsentligt aktiveres i de andre rum.FFP foto-blegemidler hurtigt med gentagen billedbehandling og blegning og kan gøre colokalisering med GalT-CFP vanskelig. Hvis hovedparten af paGFP fluorescens forbliver i Golgi-området, kan dette også indikere præcis foto-aktivering. Alternativt kan GalT blive mærket med mRFP, som er mere tilgængeligt end stabil FFP i disse eksperimenter.
Forbedret aktivering inden for Golgi kan også opnås med en multi-foton mikroskop. Mens det konfokale afbildningsplanet i disse eksperimenter er typisk en 1 um udsnit, laseren til afbildning og foto-aktivering vil passere gennem hele cellen. En multi-foton laser kan anvendes til disse forsøg, og kan forbedre nøjagtigheden i alle tre dimensioner 35. Men som det fremgår her, en traditionel 405 nm laser diode er tilstrækkelig til nøjagtigt billede aktivere PAPP-paGFP i TGN.
Som kontrol har vi udført lignende forsøg for VSVG-paGFP fluorescens. VSVG-paGFP, som erkonstitutivt leveret til celleoverfladen 27,37, blev visualiseret bliver leveret til specifikke underregioner af plasmamembranen 30. Dette sikrer, at transport til intracellulære rum ikke udløses ved overekspression eller tilstedeværelsen af paGFP tag.
Diffus paGFP fluorescens kan være vanskeligt at lokalisere ved konfokal mikroskopi. Det er vores erfaring, er APP spaltes hurtigt og synes at have en kort levetid som protein i fuld længde på lysosomale membran. Dette problem forværres af den svenske FAD mutation, der accelererer hastigheden af APP spaltning 34. At anvende teknikken for hurtigt spaltede proteiner, en inhibitor er afgørende at bestemme den endelige nedstrøms rum. Inhibering af γ-sekretase af L685, 458 eller chloroquin fører til en betydelig akkumulering af APP i lysosomer; selv med den svenske mutation.
Hvis der anvendes for meget hæmmer, kan dette føre til intracellulær ackumulation af pAPP-paGFP, og kan føre til protein indeslutninger. Akkumuleret paGFP i inklusioner resulterer i fluorescerende paGFP indeslutninger i cellen før forsøget er begyndt (vores upublicerede observationer, dvs. behandling natten over med 40 pM chloroquin). En inhibitor koncentration, der forhindrer spaltning af proteinet af interesse, men ikke føre til dannelse integration bør anvendes. Over-transfektion af celler med paGFP kan også forårsage tydelige inklusioner af paGFP, som vil fluorescere uden fotoaktivering. Nyligt foto-aktiverede paGFP vil fortrinsvis trafik til disse indeslutninger og forstyrre fortolkningen af resultaterne. Når man ser for celler til billedet, undgå celler med åbenlyse paGFP inklusioner. Det er vores erfaring med SAPP-paGFP, der er en meget svag grøn fluorescens i celler, som udtrykker PAPP-paGFP på et passende niveau. Denne svag fluorescens typisk ikke kan afbildes og kan kun ses gennem okularet.
(dvs. plasmamembranen) kan være vanskelig at opdage. Dette kan være fordi det fluorescerende signal, spredes over et stort område, fortyndes eller fordi membranen profil i tværsnit er under opløsningen af det konfokale mikroskop. Det kan være muligt at omgå dette problem ved billeddannelse under anvendelse af et epifluorescensmikroskop. Dette vil dog reducere den rumlige opløsning af teknikken.
En fordel ved denne teknik er dens anvendelighed til andre membranproteiner. Mens denne teknik afhænger af overekspression af flere proteiner, fremgår det, at protein handel ikke er åbenlyst forstyrres, som det er blevet demonstreret med VSVG-paGFP og PAPP-paGFP 30. Ud over lysosom har andre markører for det endosomale / lysosomale systemet også blevet anvendt med held. Disse omfatter rab5-mRFP for den tidlige endeosome og rab9-mchFP (cherry fluorescerende protein) for den sene endosomet. Denne kraftfulde mikroskopi teknik kan udvides til at følge handel med andre proteiner fra TGN. Den kunne også anvendes til at følge menneskehandel mellem diskrete rum forudsat veldefinerede rum markører er tilgængelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al.
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
