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Biology

Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFP fotoactivable

Published: October 17, 2015 doi: 10.3791/53153
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University

Summary

Mientras se estudia de forma relativamente fácil el transporte de proteínas de superficie celular, visualizando el tráfico de proteínas intracelulares es mucho más difícil. Aquí, utilizamos construcciones que incorporen buenas prácticas agrarias fotoactivable y demostrar un método para seguir con precisión la proteína precursora de amiloide del aparato de Golgi compartimentos río abajo y siga su aclaramiento.

Abstract

Beta-amiloide (Aß) es el constituyente principal de las placas seniles que se encuentran en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Aß se deriva de la escisión secuencial de Proteína Precursora de Amiloide (APP) por β y gamma-secretasas. A pesar de la importancia de Aß a la patología AD, la localización subcelular de estas divisiones no está bien establecida. El trabajo en nuestro laboratorio y otros implican el sistema endosomal / lisosomal en el procesamiento de APP después de la internalización de la superficie celular. Sin embargo, el tráfico intracelular de APP es relativamente poco estudiada.

Mientras que las proteínas de la superficie celular son modificables a muchas técnicas de etiquetado, no hay métodos simples para seguir el tráfico de proteínas de la membrana del Golgi. Para ello, hemos creado construcciones APP que fueron etiquetadas fotoactivable GFP (paGFP) en el C-terminal. Después de la síntesis, paGFP tiene baja fluorescencia basal, pero puede ser estimulado con 413 nm luz to producir una fluorescencia de color verde fuerte y estable. Al utilizar el aparato de Golgi marcador galactosiltransferasa acoplado a cian proteína fluorescente (GalT-PPC) como un objetivo, estamos en condiciones de precisión fotoactivar APP en la red trans-Golgi. Activada por fotos APP-paGFP puede entonces ser seguido, ya que trafica a los compartimentos posteriores identificados con fluorescencia etiquetados proteínas marcadoras de compartimentos para el endosoma temprano (Rab5), a finales del endosoma (Rab9) y el lisosoma (LAMP1). Por otra parte, el uso de inhibidores de procesamiento de APP incluyendo cloroquina o el inhibidor de la γ-secretasa L685, 458, estamos en condiciones de realizar experimentos de pulso-caza para examinar el procesamiento de APP en las células individuales.

Nos encontramos con que una gran parte de APP se mueve rápidamente hacia el lisosoma sin aparecer en la superficie celular, y luego se elimina del lisosoma por divisiones-secretasa similares. Esta técnica demuestra la utilidad de paGFP para seguir el tráfico y el procesamiento de las proteínas intracelulares from el Golgi a los compartimentos aguas abajo.

Introduction

El sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (AD) es la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares (NFTs) en el cerebro. El principal componente de las placas seniles es β-amiloide (Aß). Aß se deriva de su precursor; proteína precursora amiloide (APP) 1. La escisión de APP amiloidogénico comienza con la eliminación del ectodominio de APP por la β-secretasa 2. El fragmento carboxilo terminal 99-residuo restante (CTF) puede ser escindido por γ-secretasa para producir Aß 3-7. Mientras que muchos experimentos han documentado la escisión de APP de la superficie celular después de la internalización de la superficie celular en el sistema endosomal / lisosomal, un número de estudios recientes han sugerido que el tráfico intracelular de APP también es importante en la regulación de su procesamiento 8 a 11.

Ha habido un número de intentos en la modulación de los niveles de Aß con inhibidores de la gamma secretasa y-Aß Immunotherapies. Sin embargo, los ensayos clínicos recientes con estas terapias no mostraron ningún beneficio, y, en algunos casos, causó daños 12. Una estrategia sin explotar para modular la producción de Aß es alterar la localización subcelular de la APP y la interacción-γ-secretasa. El aparato de Golgi, membrana plasmática, y los endosomas / lisosomas han sido sugeridos como posibles localizaciones para γ-escisión de APP. La investigación de nuestro laboratorio sugiere que la APP y la γ-secretasa son proteínas residentes de la membrana lisosomal 13. Además, hemos encontrado que la γ-secretasa lisosomales tiene un pH óptimo ácido 13. Además, la alcalinización del sistema endosomal / lisosomal con cloroquina o NH 4 Cl, se ha demostrado que disminuye la producción de Aß 14. gamma-secretasa inhibición o nocaut o presenilina conduce a la acumulación de APP-FASC en el lisosoma 15-17. Por otra parte, la interrupción de APP endocitosis disminuye la producción de Aß de 18-20.

A pesar de la importancia del Golgi como una estación de clasificación para las proteínas y las proteínas reciclados desde el sistema endosomal / lisosomal nacientes, el tráfico intracelular de APP no se ha estudiado en detalle 21. Trabajos recientes han demostrado que la APP puede ser reciclado a la red trans-Golgi (TGN) a través de la interacción con el complejo retromer. Regulación a la baja del complejo retromer disminuye la producción de Aß 8,22-24. Sin embargo, la salida de APP desde el Golgi no ha sido bien estudiado.

Mientras que después de la endocitosis de las proteínas de la superficie celular, tales como el receptor de transferrina, son fácilmente etiquetados y seguido, tras el tráfico de proteínas intracelulares es más difícil. De hecho, pocas proteínas han tenido su tráfico intracelular fotografiada. El advenimiento de las etiquetas de proteínas fluorescentes, tales como foto-activable-GFP (paGFP), ha proporcionado nuevas herramientas para examinar el tráfico intracelular. Photo-activable-GFP es una forma de GFP que es casi invisible después de la síntesis, pero desarrolla verde fuerte (GFP) de fluorescencia después de ser activado por luz láser 413 nm y esta señal es estable por día 25,26. Las construcciones utilizando paGFP se han utilizado para demostrar el tráfico intralisosomal de la proteína lisosómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, la entrega de la superficie celular del virus de estomatitis vesicular glicoproteína (VSVG, un marcador de la ruta secretora) 27, y el volumen de los peroxisomas 28 y 29 autofagosomas.

Con el fin de visualizar la clasificación de APP desde el TGN en células vivas, hemos diseñado plásmido que expresa los últimos 112 aminoácidos de APP acoplados a la foto-activable (paGFP) en el C-terminal (referido como βAPP-paGFP) 30. También hemos realizado estos experimentos con APP de longitud completa y ha logrado resultados similares; el constructo ΒAPP se utiliza aquí, ya que proporciona imágenes más brillantes. A continuación, la foto-activación y# 946; APP-paGFP sólo en el TGN, como demarcada por el TGN marcador galactosiltransferasa (GalT). Aunque APP ha sido etiquetado con paGFP para visualizar el transporte axonal rápido de la APP y el aclaramiento de la región perinuclear, esta es la primera demostración de tráfico de APP de un compartimento a otro cuidadosamente definido 11,31,32. Aquí, demostramos exacta foto-activación dentro del TGN y la salida de APP en compartimentos de bajada y posterior escisión y el visto bueno de los lisosomas 30. La foto-activación precisa dentro del Golgi es ampliamente aplicable a otros sistemas de proteínas.

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Protocol

1. célula de recubrimiento y transfección

  1. En una campana de cultivo celular, placa ~ 300,000 a ~ 500.000 SN56 células (una especie de regalo del Dr. Jane Rylett) en una placa de 35 mm confocal con fondo de cristal y cubrir con los medios de comunicación antes de la transfección (medio Eagle modificado por Dulbecco, DMEM, suplementado con 10% FBS).
  2. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora a proliferar.
    Nota: Las células deben ser aproximadamente 50% -70% confluentes antes de la transfección.
  3. En una campana de cultivo de células, las células transfectar con plásmidos que expresan una proteína fluorescente etiquetados TGN marcador (galactosiltransferasa acoplado a Cyan Proteína Fluorescente, GalT-PPC), una proteína fluorescente etiquetada marcador compartimento (en este caso, lisosoma asociada proteína de membrana 1, LAMP1, etiquetadas con mRFP), y la proteína de interés etiquetado con paGFP (βAPP-paGFP). (Estos constructos se han descrito previamente 30)
  4. Se incuban las células con reactivo de transfección de ADN y el plásmido fo 24 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Utilice una proporción de ~ 2 g de ADN a 5 l de agente de transfección (por ejemplo, Lipofectamine 2000) para la citotoxicidad mejor equilibrio y la eficiencia de transfección. Las concentraciones reales pueden necesitar ser optimizada para diferentes plásmidos. En los experimentos descritos aquí, utilizar 1 g / plato confocal de βAPP-paGFP, 0,3 mg / placa confocal de LAMP1-mRFP, y 0,2 g / plato confocal de GalT-PPC.
    Nota: La cantidad de plásmido utilizado dependerá de la eficacia de transfección.
  5. Para las líneas de células neuronales: Después de la etapa 1.4, en una campana de cultivo de células, retirar el medio de transfección pre-y diferenciar células SN56 en 2 ml de DMEM suplementado con 0,1% de penicilina / estreptomicina con 1 mM dibutiril AMP cíclico (dbcAMP) durante 24 horas.

2. Microscopio Preparación Etapa

  1. Pre-caliente-buffer fosfato salino (PBS) y solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 37 ° C. Platina del microscopio de calentamiento antes de imaging a 37 ° C.
  2. Lavar las células dos veces con PBS, para eliminar los medios de diferenciación y reemplazan con 2 ml de HBSS a 37 ° C. Coloque las células en fase de microscopio calentado a 37 ° C.
    Nota: Las células son viables por aproximadamente 1,5-2 horas en HBSS.
  3. Permitir 5-10 minutos para la temperatura de la placa confocal se equilibre con la platina del microscopio.

3. Foto-activación de regiones de interés sobre el aparato de Golgi

  1. Con el ocular del microscopio, encontrar células transfectadas con GalT-PPC, LAMP1-mRFP y βAPP-paGFP.
    1. Utilice una lente de inmersión en aceite con una gran ampliación (es decir, 63X o 100X). Para la conformación visual de fluorescencia, utilice un conjunto de filtros capaces de visualizar FITC (por PPC y la fluorescencia de GFP) y rodamina (por mRFP fluorescencia).
  2. Establezca la rebanada confocal para cada canal a 1 micras. Tome una imagen de baja resolución.
  3. Recortar para imagen sólo la célula de interés.
  4. Usando el botón de ajuste, ajuste manualel plano focal a la mitad de la célula. Esta es típicamente la parte de la célula donde el núcleo es la más grande.
  5. Dibujar 3-5 Regiones circulares de Interés (ROI) dentro del TGN (GalT-PPC fluorescencia).
    1. Para dibujar regiones de interés (es decir, en el programa Zeiss LSM), seleccione el botón 'Editar ROI' en la consola de comandos.
    2. Seleccione el botón ROI circular.
    3. Haga clic y arrastre sobre la GalT-PPC regiones positivos de la célula.
      Nota: Los paquetes de foto-blanqueadores para muchos microscopios tienen esta capacidad.
  6. Tome una imagen de la célula con el superpuesto ROIs. Guardar una copia de las regiones de interés para su posterior consulta.
    1. Para guardar el rendimiento de la inversión a la imagen, seleccione el botón 'Macro'.
    2. Pulse el botón 'Load' para iniciar el 'CopyRoisToOverlay' (ruta de archivo: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
      Nota: Un microscopio confocal equipado con 475 a 525 nm (PPC) banda de paso (BP), un 500-530 nm BP (GFP),y se requieren unos 560 nm pase largo (LP) los conjuntos de filtros. También se requiere un láser de argón para 458 nm y 488 nm de emisión y un láser de HeNe para la emisión de 540 nm.
  7. Puesta en marcha del microscopio para un curso de tiempo de lejía.
    1. Ajuste el diodo láser (25 mW 405 nm láser) a la máxima potencia.
      Precaución: El exceso de foto-activación podría llevar a la foto-toxicidad o daño a las membranas celulares. Utilice protección para los ojos para evitar daños en la retina.
    2. Puesta en marcha del microscopio para 120 ciclos de formación de imágenes.
      Nota: Un ciclo de imagen consiste en el blanqueo en el rendimiento de la inversión y la imagen de toda la célula. Este es un curso de tiempo lejía.
    3. Ajuste el microscopio para blanquear (foto-activación) sólo el ROI por 20-30 iteraciones después de cada imagen. El tiempo para la imagen y la lejía una imagen variará. Establecer un retardo de tiempo entre las imágenes de manera que cada ciclo es de aproximadamente 30 seg.
      Nota: La parte de la imagen de cada ciclo dura aproximadamente 15 a 30 segundos dependiendo del tamaño de la imagen. El blanqueo para cada ROI es de unos 50 ms. El blanqueo de los 4 regiones de interés para 20 iteraciones se llevará a 4 segundos al final de cada ciclo de lejía / imagen.
  8. Empieza el curso temporal de lejía.
  9. Apagar el blanqueo después de 15 min (30 ciclos de formación de imágenes y blanqueo), pero seguir capturando imágenes de la célula.
    Nota: El tiempo de 0 a 15 minutos es el periodo de 'pulso'.
  10. Continuar capturar imágenes durante 45 minutos (sin blanquear), seguir la liquidación de βAPP-paGFP.
    Nota: El tiempo de 15 a 45 minutos es el periodo de 'persecución'.
  11. Utilizando el método de análisis descrito en el paso 6, co-localizar la proteína de interés (en este caso, βAPP-paGFP) con el compartimento de interés (en este caso, LAMP1-mRFP) haciendo superficies a cada canal.

4. Determinar el compartimiento de Downstream

  1. Para determinar si los lisosomas (en estos experimentos) son el compartimiento final, añadir inhibidores de la proteasa-membrana permeable para causar proteínas se acumulen en el lisosoma.
    1. Para βAPP, utilice 0,5 M L685, 458 (inhibidor de la γ-secretasa específica) durante la noche o la cloroquina 100 micras (deacidifies lisosomas) durante 30 min antes de formación de imágenes.
  2. Encuentra células y fotoactivar como en el paso 3,1-3,8.
  3. Image la célula por un adicional de 45-min (sin foto-activación) para determinar dónde βAPP-paGFP se acumula en ausencia de la escisión.
  4. Analizar la entrega de la proteína a los lisosomas (u otro compartimiento de corriente abajo) y el aclaramiento posterior de acuerdo con el método descrito en el paso 6.

5. Asegurar la precisión de Photo-activación en el aparato de Golgi

  1. Calentamiento HBSS a 37 ° C.
  2. Preparar una solución de 2 ml, por cada placa confocal para obtener imágenes, de 66 M nocodazole (tratamiento) o DMSO (control) en HBSS.
    1. Para una placa confocal, pipeta 2 ml de HBSS 37 ° C y añadir 7,96 l de nocodazol de una población de nocodazol 16.60 mM.
    2. Como control tanlución, pipeta 2 ml de HBSS 37 ° C en un tubo de 2 ml y añadir 7,96 l de DMSO.
  3. Se incuban las células en HBSS con nocodazol o DMSO durante 5 min antes de formación de imágenes.
  4. Encuentra las células como en el paso 3.1.
  5. Antes de fotoactivación, preparar el microscopio para tomar un Z-pila después del período de la foto-activación.
    1. Haga clic en el botón 'Z Stack'. Comenzar a escanear utilizando XY rápida.
    2. Ajuste el plano focal con la perilla de ajuste microscopio para la parte superior de la celda. Pulse 'Marcos Primera' para establecer la primera posición en la pila.
    3. Ajuste el plano focal con la perilla de ajuste microscopio para la parte inferior (la más cercana al vidrio) de la célula. Pulse 'Marcos Última' para establecer la última posición en la pila.
    4. En el panel de pila Z, pulse el botón 'Z seccionar'. Ajuste el 'Intervalo' a 1 micras.
      Nota: Para obtener una resolución espacial más alta pila de un intervalo de pila más pequeña, pero más imágenes tendrán quetomarse alargar el período de formación de imágenes para la pila.
  6. Bleach las células, tal como se describe en el paso 3/7 a 3/8. Foto desactivar e imagen desde 0 min y 15 min (30 cuadros).
  7. Deje de imagen después de 30 marcos. Inmediatamente guardar una imagen del vídeo.
    Precaución: Algunos microscopios pueden sobrescribir primer video si no se guarda antes de iniciar una segunda secuencia de imágenes.
  8. Después de guardar el video, adquirir de inmediato una Z-pila, utilizando los parámetros desde el paso 5.5.
  9. Co-localizar βAPP-paGFP con GalT-PPC (u otro marcador de Golgi), como se describe en el paso 6.
    Nota: PPC fotoblanqueadores rápidamente y puede que no sea visible por el final del período de formación de imágenes. Colocalización puede que no sea posible con la GalT-PPC. Si se requiere colocalización, mRFP utilizar para etiquetar GalT.

6. Vesícula Filtrado y Colocalización

  1. Utilice un programa de análisis (por ejemplo Imaris) para hacer superficies del compartimento (por ejemplo LAMP1-mRFP) y una o proteínaf interés (por ejemplo βAPP-paGFP).
  2. Introduzca la sección 'Supera' del programa de análisis haciendo clic en el botón Surpass en la barra de menú superior.
  3. Seleccione el botón Asistente de superficie en la parte superior de los más panel izquierdo (5ª botón desde la izquierda).
  4. Seleccione un canal para filtrar vesículas (es decir, la fluorescencia βAPP-paGFP, proteína de interés).
  5. Realizar sustracción de fondo mediante la presentación del diámetro de la mayor de la vesícula en el campo para el asistente y pulse siguiente. El programa de análisis selecciona automáticamente - basado en un umbral derivado de la vesícula más grande en el campo - un área en el canal de interés.
    1. Para ajustar manualmente el fondo umbral para refinar la selección si es necesario.
  6. En la parte inferior de la pantalla de selección de umbral, compruebe la opción 'tocar objetos divididos' para separar las superficies combinado.
    Nota: Si muchas vesículas están estrechamente agrupados ajuntos, el grupo voluntad programa de análisis de estos objetos en una superficie.
    1. Elija 10-15 vesículas representativas y calcular el diámetro medio de vesículas y escriba el resultado en el asistente.
  7. Refinar los puntos de arranque seleccionados aumentando o disminuyendo el umbral en "Calidad" (intensidad del canal en el centro de cada mancha).
    Nota: Las superficies del canal de interés se creará. El perfeccionamiento de las superficies seleccionadas se puede realizar en este momento. Vesículas umbral basado en el número de píxeles en cada vesícula.
  8. Máscara del canal original con esta superficie. Para enmascarar, seleccione la cuarta pestaña de la izquierda en el asistente de creación de superficies (lápiz).
  9. Seleccione 'Máscara All'. Se creará un nuevo canal con las vesículas de interés.
    Nota: Durante el proceso de la máscara, se ofrece la opción de duplicar el canal original. Seleccione esta opción si los datos originales necesita ser salvado.
  10. Repita steps 6.1 a 6.7 para el canal sin filtrar (es decir LAMP1 mRFP, compartimiento).
  11. En la barra de herramientas superior, seleccione la herramienta de colocalización.
    1. En el panel superior, como aparezcan los histogramas de los canales que se colocalized, seleccionar los canales enmascarados de reciente creación.
    2. Seleccione todos los datos disponibles. Hay píxeles oscuros que a veces se presente después del análisis. No seleccione estos píxeles en el histograma, van a sesgar los resultados.
    3. En el panel de la derecha, seleccione 'Construir Coloc Channel'. Esto crea un nuevo canal que contiene sólo los píxeles colocalized. Los datos estarán en el mismo panel bajo el botón 'Estadísticas Channel'. Los datos se pueden exportar como un archivo CSV.
    4. Utilice la estadística 'Porcentaje de material colocalized'. Esta opción tiene en cuenta la intensidad de los píxeles y el tamaño del objeto.

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Representative Results

Los resultados típicos muestran βAPP dejando el TGN y parece tráfico rápidamente a LAMP1 (Figura 1a y b). Durante el período de fotoactivación, las vesículas se pueden ver saliendo el aparato de Golgi con destino a los lisosomas (Figura 1b). Sin tratamiento inhibidor, paGFP fluorescencia será visible en los lisosomas mientras que hay foto-activación en el TGN. Después de parar la fotoactivación, la βAPP-paGFP se elimina rápidamente de la lisosoma (comparar Figura 1a a 1b). El tratamiento con nocodazol conduce a la acumulación de APP dentro de la GalT-PPC marcado compartimentos y evita el tráfico a los lisosomas (Figura 1C).

La mutación sueca de APP (APPsw) aumenta la tasa de β-escisión por 10 veces 34. Con el rápido escisión de βAPPsw-paGFP, la fluorescencia paGFP aparece como una señal de fluorescencia difusa en el citosol. Es de suponer que esta is el resultado de la rápida escisión βAPP por γ-secretasa liberar la paGFP C-terminal en el citoplasma (Figura 2). En presencia de inhibidor de γ-secretasa, βAPP se acumula dentro de los lisosomas.

Después de la entrega de βAPP al lisosoma, la fluorescencia paGFP se elimina rápidamente. El corto tiempo de residencia podría ser el resultado de la trata desde el lisosoma a otro compartimiento. A la inversa, se esperaría que la escisión de βAPP por γ-secretasa para dirigir a la difusión de paGFP de fluorescencia de la membrana lisosomal (Figura 3a). La fluorescencia difusa es más difícil de detectar por microscopía confocal. Para determinar si βAPP se entrega a otro compartimento o se despeja, las células SN56 fueron tratados con un inhibidor específico contra la γ-secretasa (L685, 458) o un agente alcalinizante (cloroquina). La adición de L685, 458 o cloroquina dio lugar a la acumulación de APP en el lisosoma ( rong> Figura 3b y c).

Se acepta comúnmente que APP se entrega a la superficie de la célula antes de ser endocitosis y procesada en los endosomas y lisosomas 35. Sin embargo, en nuestras células no tratadas, células de la superficie βAPP podría no ser detectado por microscopía confocal. Foto activado βAPP no puede concentrarse en una región específica de la membrana plasmática. En lugar de ello, puede haber una fluorescencia difusa a través de la gran área superficial de la membrana plasmática. Curiosamente, el tratamiento inhibidor de la γ-secretasa conduce a detectable βAPP-paGFP en la superficie celular (Figura 3b). γ-secretasa tratamiento inhibidor puede ruta más βAPP a la superficie celular, además de inhibir la función de la enzima. Por lo tanto, la gran superficie de la membrana plasmática se propaga paGFP sobre un área más grande y hace que la detección difícil, aunque la proteína se trafica en el compartimento.

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Figura 1. Imaging el tráfico de APP a los lisosomas. SN56 células fueron transfectadas con LAMP1-mRFP, GalT-PPC, y βAPP-paGFP. A) La célula se activan con precisión foto-dentro de ROIs colocado sobre el aparato de Golgi (ROIs denotado por círculos blancos ). La celda era alternativamente foto-activado y fotografiado durante 15 min para determinar el tráfico de βAPP-paGFP. El recuadro muestra el tráfico en la zona perinuclear de Golgi a los lisosomas. Co-localizada píxeles aparecen amarilla. B) La trata de una vesícula que contiene βAPP-paGFP al lisosoma. Píxeles amarillos denotan LAMP1 y βAPP-paGFP colocalización. C) SN56 células fueron tratadas con nocodazole antes de formación de imágenes para evitar βAPP-paGFP salida de la TGN. Una imagen representativa tomada desde el final del período de la foto-activación. En el panel de la derecha, un Z-pila de la misma célula tomada inmediatamente después de la foto-activación. Th e GalT-PPC ha sido falso color rojo para mejorar la visualización de colocalized GalT-PPC y βAPP-paGFP. Píxeles amarillos denotan colocalización entre GalT-PPC y βAPP-paGFP. Las barras de escala representan 5 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Tráfico de βAPPsw-paGFP. SN56 células fueron transfectadas con LAMP1-mRFP, GalT-PPC y βAPPsw-paGFP (βAPP con la mutación sueca familiar). La mutación sueca aumenta la tasa de APP que se escinde. Las células fueron alternativamente dentro de la foto-activado Golgi y fotografiado. Una fluorescencia difusa se puede ver después de paGFP se separa de la membrana lisosomal se difunda en el citoplasma. La barra de escala representa 5 micras.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Determinación de la orgánulo terminal. SN56 células fueron transfectadas con LAMP1-mRFP, GalT-PPC y βAPP-paGFP. Después de la foto-activación, las células fueron seguidos durante un adicional de 45 min. Los dos más a la izquierda paneles muestran las células antes de la fotoactivación (extremo izquierdo) y 15 minutos después de la fotoactivación (en el centro). El panel de la derecha muestra APP fluorescencia después de 45 minutos de la imagen total a), b) inhibidor de γ-secretasa sin tratar tratada, o c) la cloroquina tratada. Puntas de flecha apuntan a APP co-localizada con LAMP1 después de 45 minutos de imágenes. Las barras de escala representan 5 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de les figura.

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Discussion

Esta técnica se describe la precisión de foto-activación de las proteínas de membrana etiquetados con paGFP en el TGN para visualizar su posterior tráfico y escote. Mientras paGFP fue creado hace una década 25, este es el primer ejemplo de la foto-activación precisa para seguir el tráfico de proteínas nacientes en los diferentes compartimentos aguas abajo. Estudios anteriores utilizando APP-paGFP construye foto activada una región peri-nuclear de la célula, que fue considerado como el Golgi 11. Sin embargo, como es evidente en nuestros micrografías, lisosomas, endosomas tempranos y endosomas tardíos también se pueden encontrar en esta región (Figura 1 y la referencia 30). Estos experimentos han llevado a cabo con éxito en células HEK293, células COS7, células SN56 neuronales, células SH-SY5Y, y las neuronas de ratón, aunque la eficacia de transfección de las neuronas de ratón es baja. Experimentos similares se han realizado utilizando completos construcciones longitud APP y construcciones acortadas, que incluyen la última 112 aminoácidos de APP, con los sitios de ß-y γ-escisión, fusionado a paGFP. Las construcciones más cortas son más fáciles de transfectar y proporcionar una señal fluorescente superior, y estos se muestran en las figuras adjuntas. Nuestros constructos acortadas también carecen de la ectodominio N-terminal, que tiene divisiones no definidos y las señales de clasificación 38. A pesar de estas señales y las divisiones N-terminal, nos encontramos con que nuestra construcción acortada tiene localización y tráfico similar a un larga duración APP-paGFP 30, 33.

Debido a los numerosos orgánulos en el área peri-nuclear de la célula, se hizo todo lo posible para garantizar la exactitud de la foto-activación. Durante el período de formación de imágenes, la célula y el aparato de Golgi se moverán. Por lo tanto, las ROIs foto-activación deben ser monitorizados cuidadosamente durante el período de la foto-activación y se ajustaron a permanecer en la cima de las Golgi. Microscopios confocal son sensibles a pequeños cambios en las temperaturas. Por ejemplo, CA o calefacción respiraderos durante el microscope podría resultar en un cambio del plano de la imagen.

Con el fin de mantener la coherencia entre los experimentos, hemos creado un retardo de tiempo entre cada ciclo / imágenes de foto-activación. Se necesita tiempo para blanquear las regiones de interés y la imagen de la célula. Dependiendo del tamaño de la célula y el número de ROIs, el tiempo para blanquear y tomar una imagen puede variar. Con el fin de mantener la coherencia de imagen a imagen, establezca un retardo de tiempo entre las imágenes de manera que cada imagen, incluido el blanqueo, requiere aproximadamente 30 segundos. El aumento de la resolución temporal se puede lograr mediante el uso de sistemas de detección que emplean un conformador de haz (por ejemplo LSM5 detector Live). Estos microscopios pueden tomar imágenes a 120 fotogramas / segundo sin pérdida de resolución.

Para confirmar la exactitud de la foto-activación, es imprescindible llevar a cabo un control nocodazol. Mediante el bloqueo de transporte fuera del Golgi durante la foto-activación, esto asegura que paGFP no está siendo activado de manera significativa en los otros compartimientos.PPC foto-blanqueadores rápidamente con repitieron imágenes y blanqueo y pueden hacer colocalización con GalT-PPC difícil. Si la mayor parte de paGFP fluorescencia permanece en el área de Golgi, esto también puede indicar precisa la foto-activación. Alternativamente, GalT puede ser etiquetado con mRFP, que es más estable que el foto-PPC en estos experimentos.

Mejora de activación dentro del Golgi también se puede lograr con un microscopio multi-fotón. Mientras que el plano de la imagen confocal en estos experimentos es típicamente un 1 m rebanada, el láser para imágenes y foto-activación pasará a través de toda la célula. Un láser multi-fotón podría ser utilizado para estos experimentos, y puede mejorar la precisión en las tres dimensiones 35. Sin embargo, como se ha demostrado aquí, un tradicional diodo láser 405 nm es suficiente para activar precisión foto-βAPP-paGFP dentro del TGN.

Como control, hemos realizado experimentos similares para VSVG-paGFP fluorescencia. VSVG-paGFP, que esconstitutivamente entregado a la superficie celular 27,37, se visualizó de ser entregado a subregiones específicas de la membrana plasmática 30. Esto asegura que el transporte a compartimentos intracelulares no se desencadena por la sobre expresión o la presencia de la etiqueta paGFP.

PaGFP fluorescencia difusa puede ser difícil de localizar por microscopía confocal. En nuestra experiencia, la APP se escinde rápidamente y parece tener una corta vida como una larga duración de proteínas en la membrana lisosomal. Este problema se agrava por la mutación FAD sueca que acelera la velocidad de escisión de APP 34. Para emplear la técnica para las proteínas escindidas rápidamente, un inhibidor es crucial para determinar el compartimiento de corriente abajo final. La inhibición de la γ-secretasa por L685, 458 o cloroquina conducen a una acumulación significativa de APP en los lisosomas; incluso con la mutación sueca.

Si se usa demasiado inhibidor, esto podría llevar a ca intracelularacumulación de βAPP-paGFP, y puede conducir a inclusiones de proteínas. Acumulado paGFP en inclusiones resultados en inclusiones paGFP fluorescentes en la celda antes de que haya comenzado el experimento (nuestras observaciones no publicadas, es decir, el tratamiento durante la noche con 40 M cloroquina). Una concentración de inhibidor que impide la escisión de la proteína de interés, pero no conduce a la formación de inclusión se debe utilizar. El exceso de transfección de células con paGFP también puede causar inclusiones obvias de paGFP, que son fluorescentes sin foto-activación. Recién paGFP foto activada preferencialmente tráfico a estas inclusiones e interferir con la interpretación de los resultados. En la búsqueda de las células a la imagen, evite células con inclusiones obvias paGFP. En nuestra experiencia con βAPP-paGFP, hay una fluorescencia verde muy débil en las células que expresan βAPP-paGFP en el nivel adecuado. Esta fluorescencia débil normalmente no se pueden obtener imágenes y sólo puede ser vista a través del ocular.

(es decir, membrana plasmática) puede ser difícil de detectar. Esto puede ser debido a que la señal fluorescente, que se extiende sobre un área grande, se diluye o porque el perfil de la membrana en sección transversal es inferior a la resolución del microscopio confocal. Puede ser posible eludir este problema mediante la formación de imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia. Sin embargo, esto reducirá significativamente la resolución espacial de la técnica.

Una ventaja de esta técnica es su aplicabilidad a otras proteínas de membrana. Si bien esta técnica depende de más de expresión de varias proteínas, parece que el tráfico de proteínas no es abiertamente interrumpido, como se ha demostrado con VSVG-paGFP y βAPP-paGFP 30. Además de los lisosomas, otros marcadores del sistema endosomal / lisosomal también se han utilizado con éxito. Estos incluyen Rab5-mRFP para el pronto finOsome y Rab9-mchFP (proteína fluorescente cereza) para finales del endosoma. Esta técnica de microscopía de gran alcance puede ser extendido para seguir el tráfico de otras proteínas de la TGN. Se podría aplicarse igualmente a seguir el tráfico entre los compartimentos discretos proporcionan marcadores de compartimentos bien definidos están disponibles.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros en competencia o conflictos de intereses.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

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References

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Tam, J. H. K., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

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