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Immunology and Infection

अलगाव और Glioma-घुसपैठ परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear के प्रवाह cytometric विश्लेषण

Published: November 28, 2015 doi: 10.3791/53676
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Neurosurgery, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

Summary

जल्दी मस्तिष्क ट्यूमर microenvironment में प्रवेश प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या और सक्रियण स्थिति के बारे में समय पर निर्भर मात्रात्मक डेटा कि पैदावार तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear के अलगाव और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक सरल विधि यहाँ प्रस्तुत।

Abstract

हमारी प्रयोगशाला हाल ही में प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.) कैंसर की कोशिकाओं को β-galactoside बाध्यकारी लेक्टिन galectin की उनकी अभिव्यक्ति में कमी प्रदान कर रहे हैं, तो इंट्राक्रेनियल engraftment के बाद सीएनएस-एक घातक gliomas जल्द ही orthotopically प्रत्यारोपित माउस GL26 और चूहे को समाप्त करने में सक्षम हैं कि प्रदर्शन किया है -1 (लड़की -1)। अधिक हाल ही में काम अब जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं की आबादी इस आशय के लिए महत्वपूर्ण है कि पता चलता है। बेहतर एन.के. और माइलॉयड कोशिकाओं हम अलगाव और तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) के विश्लेषण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल विकसित किया है लड़की -1 की कमी ट्यूमर अस्वीकृति प्रदान करने के लिए सहयोग तंत्र है जिसके द्वारा समझने के लिए। विधि का ट्यूमर microenvironment में PBMC घुसपैठ की तुलना द्वारा यहां प्रदर्शन किया है shRNA पछाड़ना के माध्यम से लड़की -1 की कमी प्रदान की गई है उन लोगों के साथ GL26 gliomas लड़की -1 व्यक्त। प्रोटोकॉल के विवरण के साथ शुरू होता है कैसे संस्कृति को और GL26 सीई तैयारsyngeneic C57BL / 6J माउस मस्तिष्क में टीका के लिए LLS। यह तो जल्दी मस्तिष्क ट्यूमर microenvironment से तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs के अलगाव और प्रवाह cytometric विश्लेषण में शामिल कदम बताते हैं। विधि मस्तिष्क में प्रतिरक्षा घुसपैठ पर अस्थायी डेटा की आवश्यकता है जिसमें इन विवो प्रयोगात्मक डिजाइन की एक संख्या के लिए अनुकूल है। तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs स्वतंत्र प्रयोगों भर में समय बिंदु से मिलान ट्यूमर से मनाया समान सेल की गिनती के साथ 24 घंटे के बाद ट्यूमर engraftment जैसे ही intracranial ट्यूमर से अलग किया जा सकता के रूप में विधि, संवेदनशील और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। एक एकल प्रयोगवादी विश्लेषण किया जा करने के लिए नमूनों की संख्या के आधार पर मोटे तौर पर 4-6 घंटे में तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs की cytometric विश्लेषण प्रवाह करने के लिए मस्तिष्क कटाई से विधि प्रदर्शन कर सकते हैं। वैकल्पिक तंत्रिकाबंधार्बुद मॉडल और / या सेल विशिष्ट पहचान एंटीबॉडी भी कई अन्य Immun की घुसपैठ का आकलन करने के experimentalists 'विवेक पर इस्तेमाल किया जा सकता हैसमग्र प्रक्रिया के लिए परिवर्तन की आवश्यकता के बिना ब्याज के ई प्रकार की कोशिकाओं।

Introduction

Gliomas केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर तब्दील glia से उत्पन्न होने वाली neuroepithelial मस्तिष्क के कैंसर के एक वर्ग के हैं। सभी gliomas की, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ग्रेड चतुर्थ तंत्रिकाबंधार्बुद, या ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), सबसे आम है और एक घातक है। जीबीएम temozolomide 2 के साथ विकिरण प्लस सहवर्ती और सहायक कीमोथेरपी के द्वारा पीछा हद तक संभव करने के लिए ट्यूमर लकीर के होते हैं जो मौजूदा मानक की देखभाल करने के लिए अत्यधिक आग रोक है। ये घातक कैंसर 5 साल 3 के बाद बीमारी जीवित रोगियों का केवल 5% के साथ प्रारंभिक निदान के समय से अस्तित्व का केवल 15-18 महीने की निराशाजनक रोग का निदान ले।

रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की उपस्थिति, पेशेवर प्रतिजन कोशिकाओं की कमी (APCs), और मस्तिष्क 4 भीतर सदाशयी लसीका संरचनाओं के पहले से अज्ञात अस्तित्व विशेषाधिकार प्राप्त के रूप में प्रतिरक्षा जीबीएम की धारणा के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। हालांकि, कई अध्ययनों अब थानेदारइन मस्तिष्क के कैंसर वास्तव में monocytes, मैक्रोफेज, और माइलॉयड व्युत्पन्न शमन कोशिकाओं (MDSCs) 5 में शामिल हैं जो मूल में मुख्य रूप से माइलॉयड हैं कि परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती पैदा कि डब्ल्यू। जीबीएम भी 6.7 समर्थक tumorigenic बनने के लिए मस्तिष्क निवासी microglia की गतिविधि को प्रभावित करती है। ऐसी सीडी 8 + टी कोशिकाओं 8 और CD56 + प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के रूप में 9 लिम्फायड कोशिकाओं को भी ट्यूमर microenvironment के भीतर मौजूद हैं, लेकिन बहुत कम संख्या में सोचा, एक तथ्य (कारण ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज पर तंत्रिकाबंधार्बुद व्युत्पन्न कारकों द्वारा भड़काया प्रतिरक्षादमनकारी समारोह के लिए किया जाना है टैम्स-) 10। सीडी 4+ टी कोशिकाओं जीबीएम में भी मौजूद हैं, लेकिन इस आबादी का बहुत भी CD25 और Foxp3, प्रतिरक्षादमनकारी टी नियामक (टी रेग) 11 कोशिकाओं के निर्माताओं को व्यक्त करता है। जीबीएम के समग्र प्रतिरक्षादमनकारी राज्य immunologic तनाव कम करने और ट्यूमर प्रगति 12 की पदोन्नति में खत्म।

13-19 विकसित करने के क्रम में ब्रेन ट्यूमर immunosuppresson के तंत्र पर काबू पाने के लिए काम किया है। इस काम की परिणति अब नव निदान जीबीएम (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov पहचानकर्ता) के रोगियों के लिए एक संयुक्त साइटोटोक्सिक और प्रतिरक्षा उत्तेजक चिकित्सीय मूल्यांकन करने के लिए बनाया गया एक चिकित्सीय परीक्षण के लिए प्रेरित किया।

हमारी सबसे हाल ही में काम माउस GL26 और चूहे सीएनएस-1 जीबीएम कोशिकाओं β-galactoside बाध्यकारी लेक्टिन galectin -1 (लड़की -1) 20 की बड़ी मात्रा का निर्माण करके विरोधी ट्यूमर एन.के. सेल प्रतिरक्षा निगरानी है कि ब्लॉक से पता चलता है। इस shRNA की मध्यस्थता जीन पछाड़ना का उपयोग कर तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं में लड़की-1 की अभिव्यक्ति को दबाने के द्वारा प्रदर्शन किया गया था। इन विट्रो experimenटीएस लड़की -1 की कमी तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं संस्कृति में सामान्य रूप से प्रचूर मात्रा में पता चला है कि, अभी तक syngeneic C57BL / 6J या RAG1 में इंट्राक्रेनियल engraftment के बाद जल्द ही तेजी अस्वीकृति कराना पड़ा - / - चूहों, इस प्रकार के इस रूप पर टी या बी कोशिकाओं की स्वतंत्रता की स्थापना ट्यूमर अस्वीकृति। विरोधी asialo जीएम 1 विरोधी सीरम या लड़की -1 की कमी तंत्रिकाबंधार्बुद अस्वीकृति में एन.के. कोशिकाओं की भूमिका की स्थापना इंट्राक्रेनियल लड़की -1 की कमी तंत्रिकाबंधार्बुद विकास की पूर्ण बहाली के लिए नेतृत्व मोनोक्लोनल एंटीबॉडी NK1.1, साथ एन.के. सेल immunodepletion। अब हम जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं की है कि immunodepletion दिखाने के इस प्रकार एन.के. की मध्यस्थता लड़की की सहायता में माइलॉयड कोशिकाओं के लिए एक अपरिहार्य सहायक भूमिका का खुलासा, एन.के. कोशिकाओं की मौजूदगी के बावजूद लड़की -1 की कमी तंत्रिकाबंधार्बुद अस्वीकृति को रोकने के लिए पर्याप्त है -1 की कमी ट्यूमर सेल (अप्रकाशित डेटा)। इस अप्रत्याशित परिणाम परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear के अलगाव और विश्लेषण (PBMCs) के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए हमें प्रेरित किया है किहम बेहतर लड़की -1 की कमी तंत्रिकाबंधार्बुद अस्वीकृति विधेय है कि प्रतिरक्षा घुसपैठ की घटनाओं को चिह्नित कर सकते हैं कि इतनी जल्दी इंट्राक्रेनियल engraftment के बाद मस्तिष्क ट्यूमर microenvironment घुसपैठ।

विधि GL26-सीआईटी बुलाया अनिवार्यता से एक्सप्रेस mCitrine फ्लोरोसेंट प्रोटीन, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 21 से सीधा ट्यूमर सेल दृश्य अनुमति है, जो कि माउस GL26 तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं का उपयोग करके यहाँ प्रदर्शन किया है। इन कोशिकाओं को stereotactically syngeneic C57BL / 6J चूहों के मस्तिष्क में engrafted हैं और पूर्व माउस इच्छामृत्यु के लिए 24, 48, या 72 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है। Glioma-घुसपैठ PBMCs तो विरोधी -CD45 उपयोग कर अलग और immunolabeled कर रहे हैं, -GR -1, -CD11b और granzyme बी के लिए इंट्रासेल्युलर immunolabeling के साथ मिलकर -NK1.1 कोशिका की सतह एंटीबॉडी (GzmB)। एंटीबॉडी के इस विशिष्ट संयोजन हम ख है ट्यूमर घुसपैठ जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं की पहचान और NK1.1 +, एन.के. कोशिकाओं, सेल प्रकार के लिए अनुमति देता हैeen लड़की -1 की कमी ट्यूमर अस्वीकृति में फंसाया। लड़की -1 की कमी GL26-सीआईटी तंत्रिकाबंधार्बुद की प्रतिरक्षा घुसपैठ प्रोफाइल, GL26-सीआईटी-gal1i यहाँ के रूप में जाना जाता है, तो एक गैर होते हैं कि लड़की -1 GL26-सीआईटी-एनटी बुलाया के सामान्य स्तर व्यक्त gliomas की तुलना की जाती है नियंत्रण shRNA बाल के लिये कांटा निशाना बना। प्रोटोकॉल orthotopically syngeneic C57BL / 6J चूहों की स्ट्रिएटम में इन कोशिकाओं को टीका लगाना करने के बारे में एक स्पष्टीकरण द्वारा पीछा किया जाता है, जो इन विट्रो में कैसे करने के लिए संस्कृति GL26-सीआईटी तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं पर एक विवरण के साथ शुरू होता है। यह तो अलगाव और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs की immunolabeling में शामिल कदम की गणना करने के लिए आय। प्रोटोकॉल मानक डेटा विश्लेषण और ग्राफिकल प्रतिनिधित्व की एक व्याख्या के साथ समाप्त।

प्रदर्शन से पता चलता है कि दोनों जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं और NK1.1 + एन.के. कोशिकाओं अधिमान्यतया 48 के भीतर लड़की-1-कमी मस्तिष्क ट्यूमर microenvironment के भीतर जमाट्यूमर आरोपण, इन ट्यूमर को तेजी से पूरा ट्यूमर सेल लगभग 1 सप्ताह के बाद ट्यूमर engraftment 20 से गुजरना क्यों समझाने में मदद करता है, जो एक परिणाम के मानव संसाधन। विधि मस्तिष्क में प्रतिरक्षा घुसपैठ पर अस्थायी डेटा की आवश्यकता है जो इन विवो में विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन की एक नंबर करने के लिए आसानी से अनुकूल है। एक एकल प्रयोगवादी विश्लेषण किया जा करने के लिए नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है के बारे में 4-6 घंटे में तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs की cytometric विश्लेषण प्रवाह करने के लिए मस्तिष्क कटाई से प्रोटोकॉल प्रदर्शन कर सकते हैं। विधि को भी विशेष रूप से ट्यूमर microenvironment से प्रेरित प्रतिरक्षादमन phenotypes की पहचान करने के लिए इतना मस्तिष्क घुसपैठ कि उन लोगों के साथ तुलना के लिए ट्यूमर असर चूहों में PBMCs घूम के प्रोफ़ाइल को चिह्नित करने के उद्देश्य से प्रयोगों के साथ जोड़ा जा सकता है। इस और इसी तरह के तरीकों के आवेदन मस्तिष्क ट्यूमर microenvironment में परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तस्करी में शामिल कारकों में से एक बेहतर समझ की सुविधा चाहिए।

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Protocol

नोट: प्रयोगों प्रदर्शन करने से पहले पूरे प्रोटोकॉल की समीक्षा करें। जानवरों के इस्तेमाल और कल्याण पर उचित संस्थागत समिति से हड्डीवाला जानवरों के इस्तेमाल के लिए स्वीकृति कार्यवाही करने से पहले प्राप्त किया जाना चाहिए।

Intracranial engraftment के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के 1. तैयारी

  1. एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट में कार्य करना, (10% बाँझ फ़िल्टर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) की एक 500 मिलीलीटर की बोतल सप्लीमेंट द्वारा GL26-सीआईटी-NT / gal1i सेल संस्कृति मीडिया की तैयारी द्वारा एफबीएस शुरू ), 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, mCitrine अभिव्यक्ति वेक्टर के चयन के लिए / एमएल G418 सल्फेट (600 माइक्रोग्राम) और गैर के चयन के लिए puromycin dihydrochloride (3 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर ) को निशाना बनाने या लड़की-1-विशिष्ट shRNAs।
  2. संस्कृति GL26-सीआईटी-NT और / या GL26-सीआईटी-gal1i कोशिकाओं (चित्रा 1 ए और 1 बी 2 1-2 के लिए दिन पहले ट्यूमर engraftment प्रक्रिया करने के लिए या जब तक कंपनी के लिए एक टिशू कल्चर कैबिनेट सेट में बोतल 50-80 confluency% तक पहुँचने।
  3. सर्जरी के दिन, एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट और एक विंदुक बंदूक का इस्तेमाल तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं से सेल संस्कृति मीडिया को हटाने और बर्बादी बीकर में मीडिया त्यागें।
    1. टॉप पक्ष नीचे फ्लास्क पलटना और एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कुप्पी का जहाज़ की छत को DPBS के 10 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे धीरे DPBS में कोशिकाओं को कवर करने के लिए कुप्पी पलटना, तो कुप्पी खड़ी टिप और हटाने और बर्बादी बीकर में DPBS त्यागें।
  4. जोड़ें प्रत्येक T75 टिशू कल्चर फ्लास्क EDTA के साथ DPBS में गैर स्तनधारी ट्रिप्सिन विकल्प (विवरण के लिए सामग्री की सूची देखें) के 3-4 मिलीलीटर और 2-5 मिनट के लिए वापस टिशू कल्चर को मंत्रिमंडल में जगह है। एक उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, कोशिकाओं के सभी नीचे की सतह से पूर्व कार्यवाही करने के लिए अलग हो गए हैं कि जाँच करें।
  5. Furthe बाधितDPBS के 6 मिलीलीटर के साथ trypsin वैकल्पिक गिराए द्वारा आर enzymatic गतिविधि। पिपेट और कुप्पी के नीचे सतह कुल्ला करने के लिए एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग और यंत्रवत् किसी भी सेलुलर समुच्चय को अलग कर देना करने के लिए नीचे। कोशिकाओं Aspirate और क्रमशः लेबल 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह है। 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 सी) पर 5 मिनट के लिए 550 XG (अधिकतम आरसीएफ) में कोशिकाओं स्पिन।
  6. तैरनेवाला निकालें और धीरे संयुक्त राष्ट्र के पूरक DMEM के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend। एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए एक पी-1000 micropipette के साथ ऊपर और नीचे अच्छी तरह से कोशिकाओं पिपेट करना सुनिश्चित करें।
  7. ट्यूमर सेल निलंबन के 2 μl के अलावा द्वारा पीछा एक 0.6 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene microtube में संयुक्त राष्ट्र के पूरक DMEM के 18 μl रखकर 1.6 में उत्पन्न परिणामी सेल निलंबन के 1:10 कमजोर पड़ने बनाओ। ऊपर पिपेट और अच्छी तरह से कोशिकाओं homogenize करने के लिए एक पी 10 micropipette का उपयोग नीचे।
  8. 10 μl जोड़ें# 160; एक अलग 0.6 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene microtube 1.7 में उत्पन्न 01:10 ट्यूमर सेल कमजोर पड़ने की, तो ट्यूब को Trypan नीले दाग के 10 μl जोड़ें। अच्छी तरह से एक पी 10 micropipette के साथ मिश्रण और हवा के बुलबुले (चित्रा -1) लागू करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा एक hemocytometer के शीर्ष पर रखा एक गिलास को कवर पर्ची के तहत उसके एवज में ट्यूमर सेल / Trypan नीले समाधान के 10 μl जोड़ें।
    1. दी hemocytometer साथ जुड़े विशिष्ट प्रोटोकॉल के अनुसार एक 10x उद्देश्य का उपयोग एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की गणना। मूल 1 मिलीलीटर विभाज्य में सटीक सेल के आकलन के लिए कोशिकाओं की तैयारी के दौरान किए गए मूल ट्यूमर सेल निलंबन के 20 गुना कमजोर पड़ने में कारक सुनिश्चित करें। कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें: कुल कोशिकाओं / एमएल = [((Σcells प्रति वर्ग गिना) / गिना चौकों की #) 20 (यानी, कमजोर पड़ने कारक) 10,000 कोशिकाओं / एमएल एक्स]।
  9. घ के बाददिए गए प्रयोग में इस्तेमाल प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए कोशिकाओं की कुल संख्या etermining, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 550 XG (अधिकतम आरसीएफ) में उन्हें नीचे स्पिन। निम्न सूत्र के अनुसार प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए 3 एक्स 10 4 कोशिकाओं μl एक प्रति का लक्ष्य एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए संयुक्त राष्ट्र के पूरक DMEM का एक उचित मात्रा के साथ कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला (एस) को हटाने और resuspend: (कोशिकाओं की कुल # / 30,000)।
  10. बर्फ पर क्रमशः लेबल 0.6 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene ट्यूब और जगह में प्रत्येक कोशिका लाइन (चित्रा 1E) के एक बराबर मात्रा रखें। अलग T75s पहले वरीयता प्राप्त नहीं कर रहे थे, तो प्रत्येक कोशिका लाइन का प्रचार जारी रखने के लिए कुछ कोशिकाओं को बचाने के लिए सुनिश्चित करें।

C57BL / 6J चूहों की स्ट्रिएटम में Glioma प्रकोष्ठों के स्टीरियोटैक्टिक engraftment के लिए 2. प्रक्रिया

  1. इस प्रकार के रूप सर्जरी से पहले शल्य संज्ञाहरण, एनलजेसिया, और संज्ञाहरण उत्क्रमण के समाधान काम तैयार:
    1. Ketamine / dexmedetomidine S के लिएurgical संज्ञाहरण: बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड इंजेक्शन के एक 10 मिलीलीटर शीशी से 1.4 मिलीलीटर हटाने और ketamine हाइड्रोक्लोराइड की 100 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के 600 μl और एक उपज के लिए dexmedetomidine हाइड्रोक्लोराइड की एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के 800 μl के साथ की जगह ketamine हाइड्रोक्लोराइड (6 मिलीग्राम / एमएल) और dexmedetomidine हाइड्रोक्लोराइड (0.04 मिलीग्राम / एमएल) की मिश्रित काम कर समाधान।
    2. Buprenorphine analgesia के लिए: बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड इंजेक्शन के एक 10 मिलीलीटर शीशी से 1 मिलीलीटर हटाने और एक 0.03 मिलीग्राम / एमएल काम कर समाधान की उपज के लिए एक एकल 0.3 मिलीग्राम / एमएल शेयर buprenorphine हाइड्रोक्लोराइड ampul के पूरे 1 मिलीलीटर मात्रा के साथ बदलें।
    3. Atipamezole शल्य संज्ञाहरण उत्क्रमण के लिए: बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड इंजेक्शन के एक 10 मिलीलीटर शीशी से 1 मिलीलीटर हटाने और एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल काम कर समाधान की उपज के लिए atipamezole हाइड्रोक्लोराइड की 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  2. माउस अस्तित्व एस के लिए एक अनुमोदित स्थान में कार्य करनाurgery, तो अध्ययन के लिए आवश्यक पर्याप्त 8-10 सप्ताह पुराने महिला C57BL / 6J चूहों (GL26 तंत्रिकाबंधार्बुद साथ syngeneic) प्राप्त (2A चित्रा) के रूप में दिखाया autoclaved या मनका निष्फल सर्जिकल उपकरणों और अन्य अभिकर्मकों की स्थापना के द्वारा शुरू करते हैं; भोजन और पानी के लिए उनके निरंतर उपयोग किया जाता है।
  3. 75 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 0.5 मिलीग्राम / किग्रा dexmedetomidine (20 ग्राम माउस के लिए लगभग 250 μl) की एक खुराक देने से काम कर संज्ञाहरण के समाधान के लिए एक एकल intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के साथ पहली बार माउस anesthetize। इसके बाद, carprofen की 5 मिलीग्राम / किग्रा चमड़े के नीचे (सुप्रीम कोर्ट) इंजेक्शन दे (20 ग्राम माउस के लिए लगभग 100 μl)। माउस कार्यवाही करने से पहले पैर के अंगूठे और पूंछ चुटकी करने के लिए गैर जिम्मेदार है कि सुनिश्चित करें।
  4. शल्य क़ैंची का उपयोग, कपाल से फर दाढ़ी। मुंडा क्षेत्र के लिए povidone आयोडीन एंटीसेप्टिक समाधान को लागू करें, एक 70% isopropyl शराब प्रस्तुत करने का पैड के साथ हाथ धोने, तो povidone आयोडीन एंटीसेप्टिक समाधान को फिर से लागू होते हैं। इसके बाद, steri की एक छोटी राशि लागूLe सुखाने को रोकने के लिए प्रत्येक आंख के लिए नेत्र मरहम वेसिलीन।
  5. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में खोपड़ी सुरक्षित:
    1. ध्यान से धीरे जीभ बाहर खींचने के लिए और घुट को रोकने के लिए मुंह से एक तरफ करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए घुमावदार विदारक संदंश की एक जोड़ी के साथ में पहुँचने के द्वारा मुंह खुला। संदंश स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर दांत बार की ताली लगाने में शीर्ष दो कृन्तक खुले जबड़े में फैला है और मार्गदर्शन करने के लिए मुंह में जबकि वापस लेना करने की अनुमति दें। संबंधित शिकंजा समायोजन करके क्षैतिज या खड़ी पिवट से दांत बार सुरक्षित। माउस के कपाल बेंच के साथ शीर्ष स्तर है कि सुनिश्चित करें।
    2. सुरक्षित रूप से कुचल को रोकने के क्रम में खोपड़ी पर बहुत ज्यादा आवक दबाव लागू करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा कपाल की postorbital हड्डियों के खिलाफ कान सलाखों रखें।
    3. थूथन के ऊपर नाक पट्टी की जगह और सुखद तक नीचे पेंच। कोमल दबाव लागू करने से सिर में कोई खड़ी / पार्श्व आंदोलन है कि वहाँ चेकएक अंगूठे और तर्जनी के साथ। ठीक से एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में रखा एक माउस (चित्रा 2 बी) में दिखाया गया है।
    4. एक छुरी ब्लेड का प्रयोग, पश्चकपाल हड्डी को ललाट हड्डी से कपाल पर एक 1 सेमी midline चीरा बनाते हैं। Colibri retractors का उपयोग कर चीरा पर त्वचा वापस लेना।
    5. सीधे पर्वबिन्दु की स्थिति (चित्रा -2) ऊपर स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम के ऊर्ध्वाधर हाथ से जुड़ी एक 33 जी सुई के साथ सुसज्जित microliter सिरिंज कम करें। वहाँ से, ट्यूमर आरोपण के लिए लक्ष्य साइट तक पहुँचने के लिए सुई 0.5 मिमी एपी की स्थिति, 2.5 मिमी एमएल समायोजित। धीरे periosteum excoriating द्वारा इस स्थान को चिह्नित करने के लिए एक 26 जी सुई से लैस एक 1 मिलीलीटर टूबेरक्यूलिन सिरिंज का प्रयोग करें।
    6. एक 1/32 '(0.8 मिमी) बिट के साथ सुसज्जित एक ताररहित सटीक बिजली ड्रिल का उपयोग अंतर्निहित ड्यूरा मेटर तक पहुँचने तक लक्ष्य साइट पर कपाल में एक छेद ड्रिल। ड्रिलिंग, वहीं डीआरआई को हटाने के बाद रुक-रुक कर दबाव लागूकपाल की सतह से करूँगा सा अन्यथा अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों puncturing ड्रिल बिट करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि अत्यधिक गर्मी और बल से बचने के लिए।
  6. सुई भरा नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक 1.7 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene microtube में 0.9% सोडियम क्लोराइड के साथ microliter सिरिंज फ्लश। धीरे कोशिकाओं resuspend ट्यूमर कोशिकाओं को कई बार युक्त 0.6 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene microtube झटका।
  7. कोई हवाई बुलबुले सिरिंज में पेश कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने microliter सिरिंज में कोशिकाओं के 2 μl ड्रा। सिरिंज में शेष ट्यूमर कोशिकाओं के बिल्कुल 1 μl छोड़ने के एक 70% isopropyl शराब प्रस्तुत करने का पैड पर कोशिकाओं के 1 μl बांटना।
  8. यह ड्यूरा मेटर छू तक, उसके बाद -3.5 मिमी पेट के बल मस्तिष्क में सुई को लागू करने और 0.5 मिमी से वापस लेना नीचे सुई लाओ। धीरे से और आसानी से 1-2 मिनट के पाठ्यक्रम पर सिरिंज सवार निराशाजनक द्वारा कोशिकाओं देने के लिए।
  9. कोशिकाओं settl करने की अनुमति दें5 मिनट के लिए पहले धीरे धीरे सुई वापस लेने के लिए इंजेक्शन स्थल पर ई। एक स्वच्छ 70% isopropyl शराब प्रस्तुत करने का पैड के साथ सुई की नोक से किसी भी जमा हुआ रक्त या मस्तिष्क बात साफ कर लें। सुई कुल्ला और सुई अगले इंजेक्शन के लिए नहीं भरा हुआ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कदम 2.6 से 0.9% सोडियम क्लोराइड के साथ अच्छी तरह से सिरिंज।
  10. Colibri retractors निकालें और तीन 3-0 नायलॉन monofilament टांके का उपयोग खोपड़ी सीवन। स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से माउस निकालें और हाइड्रोक्लोराइड subcutaneously (सुप्रीम कोर्ट) buprenorphine के 0.1 मिलीग्राम / किग्रा से प्रशासन (लगभग 20 ग्राम माउस के लिए 0.03 मिलीग्राम / एमएल काम कर समाधान के 67 μl) 2.5 मिलीग्राम के द्वारा पीछा / किलो atipamezole हाइड्रोक्लोराइड intramuscularly (आईएम) ऑपरेशन के बाद दर्द से राहत और संज्ञाहरण उत्क्रमण के लिए (20 ग्राम माउस के लिए 0.5 मिलीग्राम / एमएल काम कर समाधान के लगभग 100 μl)। वापस ठीक करने के लिए एक हीटिंग दीपक के तहत उनके पिंजरों में शल्य चिकित्सा के बाद चूहों रखें।

3. माउस Transcardial Perfusमस्तिष्क के आयन और कटाई

  1. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार heparinized Tyrode समाधान तैयार:
    1. एक 1 एल कांच पेंच टोपी भंडारण की बोतल में एक चुंबकीय सरगर्मी बार रखो और ultrapure विआयनीकृत पानी के साथ मात्रा को भरने के लिए। एक भावप्रवण प्लेट पर बोतल रखें।
    2. सरगर्मी जबकि वजन और कांच की बोतल के लिए निम्न रसायनों को जोड़ने: 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड (NaCl), 0.264 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड (2 CaCl • 2H 2 ओ), 0.05 ग्राम सोडियम फास्फेट भस्मक (नाह 2 4 पीओ • 2H 2 ओ), 1.0 ग्राम डी ग्लूकोज (सी 6 एच 12 हे 6), 1.0 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट (3 NaHCO), 0.2 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (KCl)। लवण भंग करने के लिए, तो Tyrode समाधान करने के लिए हेपरिन सोडियम की एक 1,000U / एमएल शेयर समाधान के 100 μl जोड़ने की अनुमति दें।
    3. सरगर्मी थाली से कंटेनर को हटाने और एक चुंबकीय छड़ी का उपयोग कर सरगर्मी बार निकाल सकते हैं। 4 में heparinized Tyrode समाधान स्टोरसी।
  2. इस प्रकार के रूप टर्मिनल संज्ञाहरण के लिए काम कर रहे एक समाधान तैयार:
    1. Ketamine / xylazine टर्मिनल संज्ञाहरण के लिए: बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड इंजेक्शन के एक 10 मिलीलीटर शीशी से 1,360 μl हटाने और ketamine हाइड्रोक्लोराइड की 100 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान के 1,200 μl और xylazine की 100 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान के 160 μl के साथ की जगह हाइड्रोक्लोराइड ketamine हाइड्रोक्लोराइड (12 मिलीग्राम / एमएल) और xylazine हाइड्रोक्लोराइड (1.6 मिलीग्राम / एमएल) के एक मिश्रित काम कर समाधान उपज के लिए।
  3. एक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर में ultrapure विआयनीकृत पानी (3.93x) की 264 मिलीलीटर में 90 मिलीलीटर 10x की पीबीएस रखकर घनत्व centrifugation मीडिया मिश्रण समाधान तैयार है। एचसीएल के साथ पीएच 7.0-7.2 को titrate और 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  4. सामग्री सूची देख (घनत्व centrifugation मीडिया के 30 मिलीलीटर के साथ घनत्व centrifugation मीडिया मिश्रण समाधान के 18 मिलीलीटर के संयोजन से 70% घनत्व centrifugation मीडिया तैयारएक 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में विवरण) के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, लेकिन उपयोग करने से पहले आरटी के लिए लाने के लिए।
  5. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10.4 मिलीलीटर 70% घनत्व centrifugation मीडिया के साथ DPBS के 9.6 मिलीलीटर के संयोजन से 37% घनत्व centrifugation मीडिया तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, लेकिन उपयोग करने से पहले आरटी के लिए लाने के लिए।
  6. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में DPBS (~ 1% FBS) के 50 मिलीलीटर में एफबीएस के 500 μl रखकर प्रवाह बफर तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान पर दुकान
  7. बर्फ चिप्स के साथ क्षमता के लिए एक 4.5 एल polyurethane के बर्फ बाल्टी भरें।
  8. एक 10 मिलीग्राम / एमएल DNase-मैं शेयर समाधान 1:10 और एक 50 मिलीग्राम गिराए द्वारा 1 मिलीग्राम / एमएल कोलैजिनेज़ और 1 मिलीग्राम / अध्ययन में मस्तिष्क नमूना प्रति 1 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त मात्रा में DNase-मैं मिलीलीटर की एक संयुक्त समाधान करें / एक एकल 15 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में बाँझ DPBS के साथ मिलीलीटर कोलैजिनेज़ शेयर समाधान 01:50। धीरे से ऊपर pipetting द्वारा और एक पी-1000 micropipette के साथ नीचे समाधान मिश्रण। Polyureth में बर्फ पर दुकानकदम 3.7 से ane बाल्टी।
  9. दो 7 मिलीलीटर गिलास Dounce ऊतक ग्राइंडर प्राप्त करते हैं। एक "NT" और "gal1i" अन्य लेबल। बर्फ बाल्टी में ऊतक ग्राइंडर रखें और प्रत्येक के लिए DPBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  10. बर्फ बाल्टी में अध्ययन और जगह में प्रत्येक माउस से मस्तिष्क की बात को इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब प्राप्त करते हैं।
  11. बर्फ बाल्टी में तीन से 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के बीच DPBS के प्लेस ~ 150 मिलीलीटर।
  12. अध्ययन में प्रत्येक माउस के लिए पर्याप्त पॉलीस्टीरिन हेक्सागोनल वजन व्यंजन (शीर्ष भीतरी व्यास (आईडी) 115 मिमी, आधार आईडी 85 मिमी, 203 मिलीलीटर मात्रा) प्राप्त करते हैं। विच्छेदन और माउस दिमाग की विचूर्णन के लिए पूरा सेट अप में दिखाया गया है (चित्रा 3)
  13. चुना समय बिंदुओं पर, 150 मिलीग्राम की एक ही आईपी इंजेक्शन का उपयोग अध्ययन में पहली ट्यूमर असर माउस anesthetize / ketamine हाइड्रोक्लोराइड की किग्रा और 20 मिलीग्राम / किग्रा xylazine हाइड्रोक्लोराइड (संयुक्त 12 मिलीग्राम / एमएल ketamine के लगभग 250 μl / 1.6 मीटरजी 20 ग्राम माउस के लिए काम कर समाधान / मिलीलीटर xylazine) गहरी संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए। माउस से पहले कार्यवाही करने के लिए पैर के अंगूठे और पूंछ चुटकी करने के लिए गैर प्रतिक्रिया है कि सुनिश्चित करें।
  14. पहले से तैयार Tyrode समाधान निकालते हैं और टर्मिनल पशु शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए समर्पित एक लामिना का प्रवाह हुड में जगह है। Tyrode समाधान में एक carbogen टैंक से जुड़ी गैस अभेद्य polymeric ट्यूबिंग रखें। समाधान में लगातार बुलबुले के लिए 95% 2 हे / 5% सीओ 2 carbogen अनुमति देने के लिए टैंक वाल्व खुला।
  15. एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ी अतिरिक्त गैस अभेद्य polymeric ट्यूबिंग का अंत करने के लिए एक 20 जी एल्यूमीनियम हब कुंद सुई संलग्न। Tyrode समाधान में क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के दूसरे छोर पर ट्यूबिंग रखें और ट्यूबिंग ऑक्सीजन और heparinized Tyrode समाधान के साथ भरने के लिए अनुमति देने के लिए पर पंप की बारी है। माउस transcardial छिड़काव के लिए स्थापित (चित्रा 3 बी) में दिखाया गया है।
  16. चार 26 जी सुइयों का उपयोग करना, नीचे पिनलामिना का प्रवाह हुड में एक निपटान शोषक तौलिया के साथ कवर एक extruded polystyrene फोम ब्लॉक पर आगे और हिंद पंजे से anesthetized माउस उदर की ओर।
  17. पेरिटोनियल गुहा ऊपर त्वचा कुंद विच्छेदन संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, और विच्छेदन कैंची की एक बड़ी जोड़ी पर समाप्त करने के लिए उरोस्थि में विभाजित तो, डायाफ्राम पंचर करने के लिए cephalically काटने, पेरिटोनियल दीवार मर्मज्ञ द्वारा एक "वाई" चीरा बनाने का उपयोग कर काबू बाएँ और दाएँ axillae।
  18. उरोस्थि दबाना और माउस के बाएं कंधे पर रिब पिंजरे प्रतिबिंबित करने के लिए एक hemostat का प्रयोग करें। कुंद विच्छेदन संदंश की जोड़ी के साथ पेरीकार्डियम निकालें।
  19. ऑक्सीजन और heparinized Tyrode समाधान (मोटे तौर पर 2.3-2.5 मिलीग्राम / मिनट) की एक सतत ड्रिप शुरू करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप चालू करें।
  20. दिल के बाएं वेंट्रिकल में कुंद सुई डालें। Exsanguination के लिए अनुमति देने के लिए सही प्रांगण कटाव को विच्छेदन कैंची का एक छोटा सा जोड़ी का उपयोग (चित्रा3 सी)।
  21. जिगर और फेफड़ों पूरी तरह से होने के कारण खून की कमी के blanched है जब तक Tyrode समाधान अच्छी तरह से माउस संचार प्रणाली छिड़कना करने की अनुमति दें। रक्त का कोई सकल मात्रा में बाएं वेंट्रिकल से 20 जी एल्यूमीनियम हब कुंद सुई को हटाने के लिए पहले सही प्रांगण से बाहर निकलने के लिए जारी किया जाता है।
  22. Extruded polystyrene फोम ब्लॉक से माउस खोलना और नीचे माउस उदर पक्ष की बारी है। विच्छेदन कैंची की एक बड़ी जोड़ी का उपयोग करना, गर्दन के स्तर पर शरीर के बाकी हिस्सों से सिर अलग।
  23. विच्छेदन कैंची का एक छोटा सा जोड़ी का उपयोग, कपाल को बेनकाब करने के क्रम में थूथन की दिशा में आगे काम कर पश्चकपाल हड्डी में शुरुआत midline पर खोपड़ी में कटौती।
  24. एक अंगूठे और तर्जनी का उपयोग कपाल के दोनों किनारों पर त्वचा वापस लेना और सुरक्षित रूप से खोपड़ी पकड़ो। पूरी तरह से पृष्ठीय और पार्श्व को बेनकाब करने के पश्चकपाल हड्डी में शुरुआत कपाल के माध्यम से तोड़ने के लिए और आगे काम करने के लिए अस्थि Rongeurs की एक जोड़ी का उपयोगमस्तिष्क की सतहों। मस्तिष्क को नुकसान को कम करने के लिए सावधान रहें।
  25. कपाल हड्डियों को हटाया गया है एक बार, माउस उदर पक्ष के सिर बारी और खोपड़ी से यह आजाद कराने के लिए आदेश में मस्तिष्क के आधार पर कपाल नसों में कटौती करने विच्छेदन कैंची का एक छोटा सा जोड़ी का उपयोग करें।

Glioma-घुसपैठ PBMCs 4. अलगाव

  1. एक साफ एकल धार धार का प्रयोग, दो गोलार्द्धों दोटूक करने के लिए मस्तिष्क के केन्द्र नीचे एक बाण कटौती करके ट्यूमर युक्त मस्तिष्क के क्षेत्र को अलग। नीचे ipsilateral गोलार्द्ध औसत दर्जे का पक्ष मुड़ें और सेरिबैलम और ट्यूमर प्रत्यारोपण (चित्रा -4 ए) युक्त लक्ष्य ऊतक को अलग-थलग करने के लिए घ्राण बल्ब के स्तर पर दो राज्याभिषेक कटौती कर। Contralateral गोलार्द्ध के एक बराबर हिस्से को भी अलग है और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. 1 मिलीलीटर युक्त क्रमशः लेबल गिलास Dounce ऊतक चक्की में लक्ष्य के ऊतकों की जगह; DPBS के, ऊतक शुरू में बाधित करने के लिए 7 बार सभी तरह से नीचे सवार और मोड़ धक्का। सवार तरल ऊतक बनाने की मशीन के नीचे करने के लिए वापस व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए उठा। तीन बार इस चरण को दोहराएँ; हालांकि केवल ऊतक triturating से बचने के लिए पिछले दोहराने के दौरान सवार अगले दो दोहराता दौरान 4 बार और 3 बार मोड़।
  3. एक पी-1000 micropipette का प्रयोग, क्रमिक रूप से ऊतक चक्की में कुल्ला करने के लिए सवार के पक्ष के साथ (3.11 में तैयार) ठंडा DPBS के तीन 1 मिलीलीटर मात्रा में लागू होते हैं।
  4. ऊपर pipetting द्वारा triturated मस्तिष्क मामले Resuspend और नीचे और बर्फ पर एक लेबल 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह है। ठंडा DPBS के एक अतिरिक्त मिलीलीटर के साथ Dounce ऊतक बनाने की मशीन के पक्ष कुल्ला और एक ही 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब को जोड़ने। सभी नमूनों को संसाधित किया गया है जब तक बर्फ पर triturated मस्तिष्क मामले युक्त सभी ट्यूबों रखें।
  5. दोहराएँ अध्ययन में प्रत्येक माउस के लिए 3.13-3.25 और 4.1-4.4 कदम।
  6. सभी नमूनों हा एक बार4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 740 XG (अधिकतम आरसीएफ) में 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में triturated मस्तिष्क मामले नीचे स्पिन, संसाधित किया गया ve।
  7. एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट और विंदुक बंदूक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और पहले से तैयार कोलैजिनेज़ / के 1 मिलीलीटर में pelleted मस्तिष्क मामले resuspend DNase-मैं एक पी-1000 का उपयोग कर एंजाइमों पाचन। 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक टेस्ट ट्यूब रैक और जगह में 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों रखें।
  8. धीरे ऊतक disaggregation की सुविधा के लिए नलियों flicking द्वारा ऊष्मायन अवधि के दौरान दो बार नमूने आंदोलन।
  9. पाचक एंजाइम कमजोर करने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर ठंडा DPBS के 6 मिलीलीटर जोड़ें। पिपेट और नीचे resuspend के लिए, और बर्फ पर नया लेबल 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में बाँझ 70 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से कुल मात्रा फिल्टर।
  10. एक लक्ष्य को हासिल करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 740 XG (अधिकतम आरसीएफ) में मस्तिष्क कोशिका निलंबन स्पिनएकल सेल गोली (चित्रा 4 बी)। सेंट्रीफ्यूज से 15 मिलीलीटर ट्यूबों को हटाने के बाद उन्हें बर्फ पर जगह है और अगले कदम के लिए तैयार करने में लगभग 21 डिग्री सेल्सियस के लिए सेंट्रीफ्यूज पर स्थापित करने के तापमान में वृद्धि।
  11. पूरी तरह से मस्तिष्क कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला हटाने और शुरू में एक पी-1000 micropipette का उपयोग 70% घनत्व centrifugation मीडिया के 1 मिलीलीटर में छर्रों resuspend। तब एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब 70% घनत्व centrifugation मीडिया के 4 अतिरिक्त मिलीलीटर जोड़ें। सुरक्षित रूप पर टोपी भाड़ और धीरे कई बार ट्यूबों के लिए inverting द्वारा सेल निलंबन homogenize।
  12. आरटी पर एक टेस्ट ट्यूब रैक में 70% घनत्व centrifugation बर्फ से मीडिया, और जगह में resuspended मस्तिष्क कोशिकाओं से युक्त 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब निकालें। एक बार में एक, ध्यान से एसी के लिए फार्म का एक पी-1000 micropipette के साथ 70% घनत्व centrifugation मीडिया के 5 मिलीलीटर पर 2 मिलीलीटर घनत्व centrifugation मीडिया समाधान% 37 के ओवरलेदो घनत्व centrifugation मीडिया परतों (चित्रा 4C) के बीच दुबला इंटरफेस।
    1. भेद कम स्पष्ट हो जाता है जब यह आसानी से, centrifugation के बाद पहचाना जा सकता है तो इंटरफेस की स्थिति को इंगित करने के लिए एक ठीक इत्तला दे दी मार्कर का उपयोग करें।
  13. इंटरफेस में खलल न डालें से बचने के लिए कोई तोड़ने के साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए 740 XG (अधिकतम आरसीएफ) में 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब स्पिन।
  14. Centrifugation के बाद, ध्यान लिपिड परत को दरकिनार, अपने पक्ष के साथ ट्यूब में एक पी 200 micropipette शुरू करने से दो घनत्व centrifugation मीडिया परतों (चित्रा 4D) के बीच इंटरफेस में जमा है कि PBMCs इकट्ठा।
    1. एक बार जब PBMC बैंड के स्तर पर, धीरे-धीरे 70% घनत्व centrifugation मीडिया परत की सतह से 200 μl निकालने के लिए और बर्फ पर एक क्रमशः लेबल polypropylene FACS ट्यूब में जगह है। नमूना प्रति 400 μl की कुल मात्रा के लिए एक बार दोहराएँ।
  15. पर्याप्त रूप से तब, घनत्व centrifugation मीडिया पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 660 XG (अधिकतम आरसीएफ) में कोशिकाओं नीचे स्पिन करने के लिए PBMCs के 400 μl युक्त प्रत्येक FACS ट्यूब प्रवाह बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें।

Glioma-घुसपैठ PBMCs 5. immunolabeling

  1. किसी भी प्रयोगात्मक PBMC नमूनों का विश्लेषण करने से पहले, आधारभूत फाटकों की स्थापना के लिए एक एकल, स्वतंत्र, कोशिका की सतह निर्धारण नियंत्रण प्रयोग अनुसार तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs के आकलन के लिए समर्पित एक प्रवाह cytometric डेटा विश्लेषण टेम्पलेट के भीतर तय पीएमटी voltages के एक सेट के साथ जुड़े होने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए:
    1. , ट्यूमर के विकास के 72 घंटे के बाद धारा 2 में उल्लिखित प्रक्रिया के अनुसार GL26-सीआईटी-NT के साथ GL26-सीआईटी-gal1i और एक दूसरे के साथ C57BL / 6J माउस टीका लगाना दोनों चूहों euthanize और प्रक्रियाओं के अनुसार ट्यूमर घुसपैठ PBMCs को अलग-थलग धारा 3 और 4 के दौरान बताया।
    2. दो PBMC नमूने गठबंधन (एनटी एकएन डी एक मात्रा (यानी, 100 μl) में gal1i), तो आगे तीन FACS ट्यूबों (यानी, 33.3 "CD45 निर्धारण" लेबल ट्यूब प्रति μl), "जीआर 1 / CD11b निर्धारण", और "NK1 के बीच समान रूप से नमूना विभाजित। 1 निर्धारण "। (एक 1 पर प्रत्येक: 100 कमजोर पड़ने और प्रवाह बफर में 200 μl की कुल मात्रा को पतला) निम्नलिखित एंटीबॉडी जोड़ें क्रमशः लेबल FACS ट्यूबों के लिए: "CD45 निर्धारण": एलेक्सा स्त्राव 700 संयुग्मित चूहे IgG2b, κ (क्लोन: RTK4530 ); "जीआर 1 / CD11b निर्धारण": एलेक्सा स्त्राव 700 संयुग्मित चूहा विरोधी माउस CD45 (क्लोन: 30-F11), पीई संयुग्मित चूहे IgG2b, κ (क्लोन: eB149 / 10H5), और PerCP / Cy5.5 संयुग्मित चूहे IgG2b, κ (क्लोन: RTK4530); "NK1.1 निर्धारण": एलेक्सा स्त्राव 700 संयुग्मित चूहा विरोधी माउस CD45 (क्लोन: 30-F11), पीई संयुग्मित चूहा विरोधी माउस जीआर 1 (क्लोन: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5 संयुग्मित चूहा विरोधी माउस CD11b (क्लोन: एम 1/70), और एपीसी-conjugated माउस IgG2a, κ (क्लोन: eBM2a)।
    3. PBMCs 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर immunolabel करने की अनुमति दें। धीरे मिश्रण करने के लिए ऊष्मायन अवधि के माध्यम से एक बार आधे रास्ते नलियों झटका। , प्रवाह बफर के 1 मिलीलीटर के साथ धो 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 660 XG (अधिकतम आरसीएफ) पर नीचे स्पिन और प्रवाह बफर के 200 μl साथ PBMCs युक्त प्रत्येक FACS ट्यूब resuspend।
    4. एक 85 माइक्रोन एकीकृत नोक से लैस एक प्रवाह cytometer का उपयोग करना, एक आधारभूत CD45 अंतराल गेट स्थापित करने के लिए पहली "CD45 निर्धारण" ट्यूब का विश्लेषण। इसके बाद, इनपुट के रूप में केवल सच CD45 + कोशिकाओं का उपयोग कर एक आधारभूत जीआर 1 / CD11b चतुर्थ भाग गेट स्थापित करने के लिए "जीआर 1 / CD11b निर्धारण" ट्यूब चलाते हैं। अंत में, केवल सच CD45 इनपुट के रूप में / + जीआर 1 कम / CD11b +/- कोशिकाओं का उपयोग कर एक आधारभूत NK1.1 अंतराल गेट स्थापित करने के लिए "NK1.1 निर्धारण" ट्यूब चलाते हैं।
  2. भविष्य की सभी प्रयोगात्मक एक के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग करेंalysis:
    1. (GzmB निर्धारण के लिए प्लस 1) एक 200 μl नमूना प्रति मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रवाह बफर में कोशिका की सतह एंटीबॉडी के 100 कमजोर पड़ने: एक 1: की पर्याप्त मात्रा बनाने एलेक्सा स्त्राव 700 संयुग्मित चूहे-विरोधी माउस CD45 (क्लोन: 30-F11 ), पीई संयुग्मित चूहा विरोधी माउस जीआर 1 (क्लोन: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5 संयुग्मित चूहा विरोधी माउस CD11b (क्लोन: / 70 एम 1), एपीसी संयुग्मित माउस विरोधी माउस NK1.1 (क्लोन: PK136)।
    2. Meniscus सिर्फ सेल घाटे से बचने के लिए प्रत्येक FACS ट्यूब (~ 50 μl) के नीचे से ऊपर है जब तक ध्यान से 4.15 से नीचे काता PBMCs की सतह पर तैरनेवाला हटा दें। एक पी 200 micropipette के साथ अवशिष्ट प्रवाह बफर का उपयोग कर प्रत्येक FACS ट्यूब में PBMCs Resuspend और प्रत्येक FACS ट्यूब से (नमूने के 1 / #) की मात्रा के लायक हटाने और "जमा निर्धारण" नामक एक नई FACS ट्यूब में गठबंधन।
    3. प्रत्येक PBMC नमूना करने के लिए 5.2.1 में तैयार कोशिका की सतह एंटीबॉडी कॉकटेल के 200 μl जोड़ें। PBMCs 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर immunolabel करने की अनुमति दें। झाड़ टीऊष्मायन अवधि के माध्यम से आधे रास्ते धीरे मिश्रण करने के लिए एक बार वह ट्यूबों।
    4. प्रवाह बफर के 1 मिलीलीटर से धो लें; 660 XG (अधिकतम आरसीएफ) पर नीचे स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट x।
    5. अंधेरे में बर्फ पर 15 मिनट के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध formalin आधारित लगानेवाला के 200 μl में PBMCs (विवरण के लिए सामग्री की सूची देखें) युक्त सभी FACS ट्यूबों Resuspend। धीरे मिश्रण करने के लिए ऊष्मायन अवधि के माध्यम से एक बार आधे रास्ते नलियों झटका।
    6. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 1x permeabilization / धोने बफर के 1 मिलीलीटर (विवरण के लिए सामग्री की सूची देखें) से धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 660 XG (अधिकतम आरसीएफ) पर नीचे स्पिन।
    7. नमूना प्रति एक 200 μl मात्रा प्राप्त करने के लिए: (GB11 क्लोन) 1x permeabilization / धोने बफर में इंट्रासेल्युलर एंटीबॉडी प्रशांत ब्लू संयुग्मित माउस विरोधी माउस GzmB की: 100 कमजोर पड़ने PBMCs नीचे घूम रहे हैं, वहीं एक 1 के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार करते हैं।
    8. प्रशांत ब्लू-चोर की 100 कमजोर पड़ने: एक अलग ट्यूब में, एक एक के लिए एक एकल 200 μl मात्रा तैयारjugated माउस IgG1, κ (क्लोन: MOPC -21) निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी।
    9. निर्धारण एंटीबॉडी के 100 कमजोर पड़ने: 1 के 200 μl मात्रा के साथ "जमा निर्धारण" लेबल एकल FACS ट्यूब विरोधी माउस GzmB एंटीबॉडी के 100 कमजोर पड़ने और resuspend: 1 के 200 μl के साथ प्रयोगात्मक PBMC नमूने के प्रत्येक Resuspend।
    10. सभी PBMC नमूने 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर immunolabel करने की अनुमति दें। धीरे मिश्रण करने के लिए ऊष्मायन अवधि के माध्यम से एक बार आधे रास्ते नलियों झटका।
    11. प्रवाह बफर के 1 मिलीलीटर से धो लें; विश्लेषण के लिए प्रवाह बफर के 200 μl के साथ 4 डिग्री सेल्सियस और resuspend PBMCs पर 10 मिनट के लिए 660 XG (अधिकतम आरसीएफ) पर नीचे स्पिन।
    12. पहले खंड 5.1 22 में स्थापित तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ एक 85 माइक्रोन एकीकृत नोक का उपयोग PBMCs और फाटकों और पीएमटी voltages विश्लेषण cytometrically प्रवाह। कोशिकामापी तंत्रिकाबंधार्बुद-infilt की कुल संख्या का एक निष्पक्ष तुलना सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह पर प्रत्येक नमूने की पूरी मात्रा को चलाने के लिए सुनिश्चित करेंप्रत्येक नमूने में रेटिंग PBMCs।

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Representative Results

निम्नलिखित gating रणनीति एक ठेठ प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है: एफएससी-ए एसएससी-ए बनाम → एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू → एफएससी-एच FSC डब्ल्यू → CD45 बनाम बनाम गिनती → जीआर 1 बनाम CD11b → गिनती बनाम NK1.1। गेट्स तो GzmB अभिव्यक्ति (चित्रा 5 ए) के आधार पर स्तरीकृत रहे हैं जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं और NK1.1 + एन.के. कोशिकाओं पर रखा। NK1.1 + एन.के. कोशिकाओं और जीआर -1 / CD11b एसएससी-ए एन.के. कोशिकाओं के छोटे लसीकावत् आकार और माइलॉयड कोशिकाओं के अपेक्षाकृत बड़े आकार की पुष्टि बनाम एफएससी-ए पर हमारे प्रयोगों में + माइलॉयड कोशिकाओं (के रूप में पहचान उन कोशिकाओं Backgating चित्रा 5 ब)। कच्चे डेटा फ़ाइलों (यानी।, एफसीएस फ़ाइलें) ऐसे FlowJo के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह cytometric डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर से विश्लेषण कर रहे हैं।

18 C57BL / 6J चूहों की कुल इस विधि का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। नौ (9) GL26-सीआईटी-NT के साथ engrafted थे और 9 ही विकास पर GL26-सीआईटी-gal1i साथ engrafted थेप्र कोशिकाओं (3x10 4) के बराबर संख्या का उपयोग कर। प्रत्येक समूह से तीन चूहों 24, 48 में euthanized, और 72 घंटे बाद ट्यूमर engraftment थे। डेटा syngeneic C57BL / 6J चूहों के मस्तिष्क में GL26-सीआईटी-gal1i तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं के engraftment तेजी से CD45 + PBMCs (चित्रा 6A) की भर्ती लाती है दिखाते हैं। प्रदर्शन में इस्तेमाल विशिष्ट एंटीबॉडी कॉकटेल के आधार पर यह आगे जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं और NK1.1 + एन.के. कोशिकाओं विशेष रूप से ट्यूमर engraftment के 48 घंटा (चित्रा के भीतर लड़की -1 की कमी ट्यूमर microenvironment में प्रवेश कि दिखाया जा सकता है 6B और 6C); अब तक एन.के. कोशिकाओं की है कि outweighs तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ माइलॉयड कोशिकाओं की हालांकि कुल संख्या।

चित्र 1
चित्रा 1: Intracranial engraftment के लिए GL26-सीआईटी कोशिकाओं की तैयारी (ए।) प्रतिनिधि 10X उज्ज्वल क्षेत्र और GL26-सीआईटी-एनटी (बाएं चित्र) और GL26-सीआईटी-gal1i (सही चित्र) संस्कृति में विकसित कोशिकाओं का Epifluorescence micrographs। (बी) GL26-सीआईटी-एनटी (बाएं लेन) और GL26-सीआईटी-gal1i (सही लेन) पूरे सेल lysate के पश्चिमी धब्बा। गामा ट्यूबिलिन (γ-टब।) एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 550 XG (अधिकतम आरसीएफ) पर centrifugation के बाद एक लगभग 50% मिला हुआ T75 टिशू कल्चर कुप्पी से (सी) GL26-सीआईटी सेल गोली। सेल नंबर और व्यवहार्यता का आकलन करने के Trypan ब्लू के साथ 1: (डी) GL26-सीआईटी कोशिकाओं (सफेद डॉट्स) युक्त एक hemocytometer के उज्ज्वल क्षेत्र दृश्य 1 पतला। प्रकोष्ठों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर के विकास को सुनिश्चित करने के लिए 90% व्यवहार्य> होना चाहिए। 1 से 5 लेबल चौकों से कोशिकाओं की गिनती की औसत कोशिकाओं की संख्या के आकलन की शुद्धता बढ़ाने के लिए लिया जाना चाहिए। इंट्राक्रेनियल impla के लिए संयुक्त राष्ट्र के पूरक DMEM में 3 एक्स 10 4 कोशिकाओं / μl पर resuspended (ई) GL26-सीआईटी कोशिकाओंntation। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। C57BL / 6J चूहों की स्ट्रिएटम (ए) के लिए आवश्यक सर्जिकल उपकरणों और अभिकर्मकों दिखा शल्य सूट लेआउट में Glioma प्रकोष्ठों के स्टीरियोटैक्टिक engraftment। (बी) के 0.5 मिमी एपी पर उचित सुई स्थापन के साथ एक stereotactic फ्रेम में इस्तेमाल एक C57BL / 6J माउस के मद्देनजर बंद, 2.5 मिमी एमएल, और शीर्षस्थान के लिए -3.0 मिमी डीवी रिश्तेदार। पर्वबिन्दु की स्थिति और ट्यूमर सेल engraftment के लिए लक्ष्य साइट दिखा माउस खोपड़ी (सी) पृष्ठीय दृश्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3:। माउस Transcardial छिड़काव (ए) विच्छेदन, विचूर्णन, और माउस मस्तिष्क के ऊतकों के enzymatic पाचन के लिए आवश्यक अभिकर्मकों। (बी) के टर्मिनल माउस सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए समर्पित एक लामिना का प्रवाह हुड में दिखाया ऑक्सीजन और heparinized Tyrodes के समाधान के साथ transcardial छिड़काव माउस के लिए आवश्यक उपकरणों और अभिकर्मकों का लेआउट। (सी) उचित साधनों और transcardial छिड़काव के लिए आवश्यक प्लेसमेंट का प्रदर्शन दिल की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Glioma-घुसपैठ का अलगावPBMCs। प्रारंभिक चरण ओर्थोटोपिक तंत्रिकाबंधार्बुद प्रत्यारोपण युक्त माउस मस्तिष्क के ऊतकों के विच्छेदन के लिए (ए) रणनीति। शीर्ष पैनल दूर contralateral गोलार्द्ध से ipsilateral गोलार्द्ध के बाण द्विभाजन को दर्शाता है। नीचे के पैनल (बैंगनी में प्रकाश डाला) ट्यूमर प्रत्यारोपण युक्त लक्ष्य ऊतक को अलग-थलग करने के लिए आवश्यक दो अतिरिक्त राज्याभिषेक कटौती को दर्शाता है। Enzymatic पाचन के बाद (बी) एकल कोशिका मस्तिष्क के ऊतकों गोली (सफेद तीर), एक 70 माइक्रोन नायलॉन जाल और centrifugation के माध्यम से छानने का काम। (सी) से पहले centrifugation के लिए ठीक से डाला घनत्व centrifugation मीडिया ढाल। सफेद तीर दो घनत्व centrifugation मीडिया परतों के बीच का गठन साफ ​​इंटरफ़ेस इंगित करता है। (डी) 37% घनत्व centrifugation मीडिया परत सफेद तीर के शीर्ष पर है कि रूपों लिपिड परत) और PBMC बैंड का प्रदर्शन centrifugation के बाद घनत्व centrifugation मीडिया ढाल (ध द्वारा उल्लिखितदो परतों के बीच इंटरफेस में ई धराशायी काले लाइनों)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: प्रवाह cytometric gating रणनीति पहचान के लिए इस्तेमाल Glioma-घुसपैठ जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं और एन.के. कोशिकाओं (ए) चरण 1:। एक घनत्व centrifugation मीडिया ढाल के PBMC बैंड से अलग कुल immunolabeled कोशिकाओं पर gated हैं सेलुलर मलबे को बाहर कर (एफएससी-ए कम कश्मीर 50 ~ की तुलना में)। चरण 2 और 3: Doublet भेदभाव gating सेलुलर समुच्चय बाहर फिल्टर करने के लिए। चरण 4: CD45 गेट तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। निर्धारण नियंत्रण ग्रे सिल्हूट के रूप में दिखाया गया है। चरण 5: CD45 + कोशिकाओं जीआर -1 और CD11b पर आधारित स्तरीकृत। दोनों जीआर -1 और सीडी के लिए निर्धारण नियंत्रण 11b भूखंड पर मढ़ा और गोल्ड सर्किल से घिरा है। लाल वृत्त जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं को इंगित करता है। चरण 5 ': GzmB अभिव्यक्ति पर आधारित स्तरीकृत जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं। Predicated के रूप में, इन कोशिकाओं निर्धारण नियंत्रण (ग्रे सिल्हूट) पर विरोधी GzmB एंटीबॉडी के साथ लेबल नहीं है। चरण 6: जीआर 1 चरण 5 में काले आयत द्वारा उल्लिखित कम कोशिकाओं NK1.1 अभिव्यक्ति पर आधारित स्तरीकृत। निर्धारण नियंत्रण ग्रे सिल्हूट के रूप में दिखाया गया है। चरण 6 ': NK1.1 उच्च कोशिकाओं GzmB अभिव्यक्ति पर आधारित स्तरीकृत। इन कोशिकाओं को वास्तव में निर्धारण नियंत्रण (ग्रे सिल्हूट) के ऊपर विरोधी GzmB एंटीबॉडी के साथ लेबल। एन.के. कोशिकाओं के एक छोटे लसीकावत् आकार है कि एसएससी-ए प्रदर्शन बनाम एफएससी-ए पर जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं (बी) Backgating बड़े आकार जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं की तुलना में।"_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: Intracranial ट्यूमर के विकास के पहले तीन दिनों में GL26-सीआईटी-gal1i ट्यूमर microenvironment बनाम GL26-सीआईटी-एनटी में PBMC घुसपैठ की तुलना (ए) कुल CD45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं।। (बी) CD45 + / जीआर -1 / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं। (सी) CD45 + /NK1.1 + एन.के. कोशिकाओं। GL26-सीआईटी-gal1i gliomas से अलग PBMCs से डाटा अंक चिकनी लाइनों से जुड़े हुए हैं, whiles GL26-सीआईटी-एनटी gliomas से अलग उन धराशायी लाइनों से जुड़े हुए हैं। तीन चूहों से Glioma-घुसपैठ PBMCs हर समय बिंदु पर ट्यूमर के प्रकार के अनुसार विश्लेषण किया गया। GL26-सीआईटी-gal1i घटता पर प्रत्येक डेटा बिंदु के साथ जुड़े संख्या GL26-सीआई के ऊपर है कि विशेष रूप PBMC प्रकार के गुना-प्रेरण का प्रतिनिधित्वटी एनटी निर्दिष्ट घंटे के बाद ट्यूमर आरोपण पर (एचपीआई)। डेटा मतलब (SEM) के मानक त्रुटि ± गिना प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मतलब संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण विचरण के 2 तरह के विश्लेषण के द्वारा किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल जल्दी माउस मस्तिष्क ट्यूमर microenvironment में घुसपैठ की है कि PBMCs के अलगाव और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन है। Glioma सेल निलंबन stereotactically माउस मस्तिष्क के स्ट्रिएटम में engrafted कर रहे हैं कि प्रयोगवादी द्वारा निर्दिष्ट एक एकाग्रता में उत्पन्न कर रहे हैं। चूहे तो प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्दिष्ट पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर euthanized हैं और उनके दिमाग काटा और fluorochrome संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के संयोजन के साथ immunolabeled रहे हैं, जो तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs को अलग-थलग करने के लिए कार्रवाई कर रहे हैं; immunolabeled कोशिकाओं को फिर से फ्लो द्वारा मात्रा कर रहे हैं। यहाँ प्रस्तुत प्रदर्शन जल्दी समय बिंदुओं पर केंद्रित है, तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs माउस moribundity तक किसी भी समय बिंदु के बाद ट्यूमर engraftment अप पर मूल्यांकन किया जा सकता है। अलग एंटीबॉडी संयोजनों की संख्या किसी भी ब्याज मैं की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में विधि अत्यधिक मॉड्यूलर हैटी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं, monocytes, और मैक्रोफेज ncluding। प्रोटोकॉल महिला C57BL / 6J चूहों की उम्र के 8-10 हफ्तों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है कि ध्यान दें। इस उम्र सीमा के बाहर चूहे यहां प्रस्तुत आंकड़ों के प्रतिनिधि नहीं हैं कि बराबर समय बिंदुओं पर कोशिकाओं की गिनती करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो घूम PBMCs, का प्रतिशत परिवर्तित हो सकता है। (जैक्सन प्रयोगशाला; माउस phenome डाटाबेस Jaxpheno6) वैकल्पिक ट्यूमर मॉडलों का इस्तेमाल कर रहे हैं या बी -6 पृष्ठभूमि पर उन लोगों की तुलना में अन्य चूहों की वजह से उपयोग किया जाता है, तो उपभेदों उनकी PBMC प्रोफाइल में अलग कर सकते हैं कि यदि लक्षण वर्णन प्रयोगों की भी आवश्यकता हो सकती है। लिंग और पर्यावरण की स्थिति भी PBMC आवृत्तियों और प्रतिशत के बीच असमानता के स्रोत हो सकता है।

इस विधि का पता लगाने के लिए सक्षम है कि चार कोशिका की सतह एंटीबॉडी का एक संयोजन का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है जीआर -1 माइलॉयड कोशिकाओं और NK1.1 + एन.के. कोशिकाओं, सेल प्रकार गा की अस्वीकृति में फंसा / + CD11bएल -1 की कमी तंत्रिकाबंधार्बुद। इंट्रासेल्युलर GzmB एंटीबॉडी के शामिल किए जाने के आगे एन.के. सेल सबसेट में साइटोटोक्सिक क्षमता का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है। प्रतिनिधि परिणाम के कारण या तो shRNA की मध्यस्थता जीन पछाड़ना के लिए स्तर को कम कर दिया लड़की -1 का स्तर सामान्य व्यक्त या जो कि syngeneic C57BL / 6J चूहों में जल्दी GL26-सीआईटी gliomas में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के लिए प्रदान की जाती हैं। प्रदर्शन तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs reproducibly अलग है और जैसे ही 24 घंटे के बाद ट्यूमर engraftment के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि दिखाने के द्वारा तकनीक की संवेदनशीलता और reproducibility दर्शाती है। एक तरफ ट्यूमर घुसपैठ जीआर 1 उच्च / CD11b + माइलॉयड कोशिकाओं की आबादी खुलासा से, प्रदर्शन भी जीआर 1 पूर्णांक की आबादी का पता चलता है जिसकी पहचान वर्तमान में अपरिभाषित है / CD11b + कोशिकाओं। अतिरिक्त प्रयोगों आगे इस सेल की आबादी के चरित्र को समझने के लिए जरूरी हैं। हम यह भी हम CD45 के एक आसानी से अलग पहचाना आबादी का पालन नहीं करते कि ध्यान दें - / CD11b उच्च /NK1.1 - पहले दूसरों 23,24 द्वारा वर्णित के रूप microglia के साथ संगत कोशिकाओं। इस परिणाम के लिए एक सरल व्याख्या यहां इस्तेमाल विशिष्ट अलगाव प्रोटोकॉल 37/70 घनत्व centrifugation मीडिया इंटरफेस में उनके संचय का निवारण होता है। यह 37/70 घनत्व centrifugation इंटरफ़ेस से एकत्र की कोशिकाओं तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं को खुद शामिल करने के लिए नहीं दिखाई देते हैं कि बाहर बात करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। यह इस तथ्य से स्पष्ट है कि एसएससी-A पर 100-200K के बीच दिखाई देते हैं और की 100K जो GL26-सीआईटी तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं, एफएससी-ए इस प्रदर्शन में इस्तेमाल उन लोगों के बराबर पीएमटी voltages का उपयोग कर (नहीं दिखाया डेटा) FSC- से अनुपस्थित रहे हैं एक बनाम एसएससी-ए भूखंडों (5 ए चित्रा को देखें, चरण 1)।

विरोधी जीआर 1 एंटीबॉडी Polymorphonuclear और क्रमश: 25 मोनोन्यूक्लियर माइलॉयड कोशिकाओं, के लिए विशिष्ट हैं Ly6G और Ly6C कोशिका की सतह प्रोटीन दोनों को पहचानते हैं। विरोधी जीआर 1 antibod का उपयोगएँ इस प्रकार इन दो सेल आबादी के बीच भेद अलग करता है। हमारी प्रयोगशाला में प्रारंभिक परिणाम अब लड़की-1-कमी तंत्रिकाबंधार्बुद microenvironment घुसपैठ कि जल्दी जीआर -1 / CD11b + कोशिकाओं का एक और अधिक सटीक वर्णन पर प्रकाश डाला करने के लिए शुरुआत कर रहे हैं। (: 1A8 क्लोन) और विरोधी Ly6C (क्लोन: अल-21) विरोधी Ly6G को शामिल प्रयोगों विरोधी CCR2 एंटीबॉडी के साथ एक साथ एंटीबॉडी अब जीआर 1 उच्च / CD11b + कोशिकाओं जल्दी लड़की -1 की कमी ट्यूमर microenvironment घुसपैठ संकेत मिलता है कि आगे के प्रयोगों इस परिणाम की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं, हालांकि, Ly6C उच्च / CCR2 उच्च भड़काऊ monocytes के साथ संगत कर रहे हैं (डेटा) नहीं दिखाया।

कारण सेल करने के लिए कि तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs को अलग-थलग करने में शामिल दोहराने centrifugation और मेजबान कदम दौरान हो सकता है खो देता है, यह कोशिकाओं की गिनती वास्तव में बरकरार मस्तिष्क में मौजूद हैं क्या कम है कि वास्तव में कर रहे मनाया कि संभावना है। ई के बीच हालांकि, मतभेदxperimental समूहों 37/70 घनत्व centrifugation मीडिया इंटरफेस के बराबर मात्रा में निकाले जाते हैं, तो धारण करना चाहिए और प्रत्येक नमूने की पूरी मात्रा प्रवाह से विश्लेषण किया जाता है। इन चरणों का पालन करने में विफलता के नमूनों के बीच अनुचित तुलना में परिणाम होगा और निष्पक्ष विश्लेषण रोकना होगा। मस्तिष्क ट्यूमर microenvironment में प्रवेश PBMCs की सही संख्या यों की अक्षमता इस प्रोटोकॉल के लिए एक सीमा विशिष्ट नहीं है। ऐसे immunohistological सेल गिनती रणनीति के रूप में वैकल्पिक तरीकों के कारण पृष्ठभूमि धुंधला के अपने स्तर में अलग हो सकता है, जो stereological मायने रखता है और ऊतक अनुभाग micrographs पर बराबर की छवि thresholding की आवश्यकता के आधार पर कुल सेल नंबर की extrapolations, संभवतः गलत करने के लिए अग्रणी करने के लिए भी त्रुटि के अधीन हैं -negative या झूठी सकारात्मक संकेत है। फिर भी, अलग विश्लेषणात्मक तरीकों के बीच समय बेशक विश्लेषण की तुलना समान समग्र आकार के साथ समय पर निर्भर प्रतिरक्षा तांता घटता प्रकट करना चाहिए। एकप्रतिरक्षाऊतकरसायन तरीकों के लिए अतिरिक्त दोष cytometry formalin तय मस्तिष्क ऊतक वर्गों के संदर्भ में बराबर प्रतिजनी मिलान करने के लिए बाध्य करने के लिए प्रवाह के लिए मान्य निश्चित एंटीबॉडी की अक्षमता है।

इसकी कार्यप्रणाली के साथ अपरिचित उन लोगों के लिए सीमाओं के रूप में सेवा कर सकते हैं कि इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। ऐसा ही एक कदम यह नुकसान पहुँचाए बिना कपाल से मस्तिष्क की कटाई है। हम पहले उचित प्रयोग चलाने के लिए तकनीक कई बार अभ्यास कर सुझाव देते हैं। मस्तिष्क अंततः triturated किया जाएगा, हालांकि, बाद से, मस्तिष्क की ऊपरी परत को मामूली क्षति तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs की सही मात्रा का ठहराव के लिए अप्रासंगिक होने की संभावना है। अनुभवहीन जांचकर्ताओं शुरू में मुश्किल लगता है कि हो सकता है एक दूसरे कदम के घनत्व centrifugation मीडिया ढाल की घनघोर है। के शीर्ष पर 37% घनत्व centrifugation मीडिया के 2 मिलीलीटर overlying जबकि एक साफ इंटरफ़ेस के लिए फार्म का experimentalists की क्षमता70% परत PBMCs की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। इस कदम के शुरू में चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है, यद्यपि यह बेहद PBMCs के लिए समृद्ध करती है और नाटकीय रूप से जहां पूरे मस्तिष्क के ऊतकों cytometrically प्रवाह विश्लेषण किया जाना है, तो समय की अवधि अन्यथा नमूना विश्लेषण के लिए आवश्यक कम हो जाती है। PBMC संवर्धन भी इस प्रकार .fcs फ़ाइल आकार को कम करने और दुर्लभ मस्तिष्क घुसपैठ प्रतिरक्षा सेल आबादी को हल करने के लिए मदद कर रहा है, प्रवाह द्वारा कब्जा कर लिया घटनाओं की कुल संख्या कम कर देता है। एक साफ घनत्व centrifugation इंटरफ़ेस हम चिकनी सवार कार्रवाई के साथ एक पी-1000 micropipette का उपयोग 37% घनत्व centrifugation मीडिया डालने का कार्य करने की सलाह देते स्थापित करने में अच्छे परिणाम के लिए। 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब लगभग 20-30 ° बेंच शीर्ष ऊपर कोण। 70% घनत्व centrifugation मीडिया परत की सतह से ऊपर ट्यूब 3-5 मिलीलीटर चिह्नों के पक्ष में micropipette की नोक आराम करें। Extru के रूप में यह 37% घनत्व centrifugation मीडिया का खुला जावक गति को कम करने के लिए धीरे-धीरे इतनी तेजी से डालो औरआदेश में micropipette सिरे से देस अंतर्निहित 70% घनत्व centrifugation मीडिया को परेशान करने से बचने के लिए। अन्त में, मस्तिष्क के ऊतकों वास्तुकला जरूरी अलग-थलग करने की प्रक्रिया में नष्ट हो जाता है कि इस तथ्य तंत्रिकाबंधार्बुद-घुसपैठ PBMCs अतिरिक्त चूहों समय बिंदु से मिलान ऊतकीय डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा मतलब है।

सामान्य कृंतक मस्तिष्क में ऑन्कोजेनिक प्लास्मिड डीएनए के इंजेक्शन के माध्यम से उत्पन्न नई तंत्रिकाबंधार्बुद मॉडल हाल के वर्षों 26-32 में विकसित किया गया है। ये "अंतर्जात" ट्यूमर मॉडल stereotactically पूर्व vivo कैंसर की कोशिकाओं को engrafting और अधिक बारीकी से नैदानिक ​​तंत्रिकाबंधार्बुद के histological पहचान की नकल की वजह से संभावित कलाकृतियों को नाकाम। इस के साथ साथ वर्णित विधि इन अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक मॉडल प्रणाली की विशेषताएँ कि प्रतिरक्षा घुसपैठ की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। नवजात चूहों में प्रतिरक्षा तांता पर अध्ययन भी नवजात समझौता ज्ञापनों का घनत्व, हालांकि इस विधि का उपयोग किया जा सकता हैई मस्तिष्क मस्तिष्क के ऊतकों की पाचन पर रोकने के लिए आदेश में enzymatic पाचन कदम के एक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, जो वयस्कों की तुलना में कम है। तकनीक के अतिरिक्त अनुप्रयोगों जैसे प्रयोगात्मक एलर्जी encephalomyelitis (EAE) और वायरल संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में अलग घातक ट्यूमर से भड़काऊ मस्तिष्क रोग के वैकल्पिक वर्गों पर जांच में शामिल हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (एनआईएच / NINDS) एमजीसी के लिए R01-NS074387, R01-NS057711 और R21-NS091555 अनुदान की / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था; एनआईएच / NINDS पीआरएल के लिए R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 और R21-NS084275 अनुदान; लिआ खुश दिल से अनुदान, एमजीसी और पीआरएल को सम्मानित किया मिशिगन व्यापक कैंसर केंद्र के विश्वविद्यालय; न्यूरोसर्जरी, मेडिसिन के मिशिगन विश्वविद्यालय के स्कूल के विभाग; एनआईएच अनुदान 2UL1-TR000433 द्वारा समर्थित नैदानिक ​​के लिए मिशिगन संस्थान और स्वास्थ्य अनुसंधान; एनआईएच / NCI (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) अनुदान T32-CA009676 द्वारा समर्थित मिशिगन विश्वविद्यालय के कैंसर जीवविज्ञान प्रशिक्षण अनुदान; एनआईएच / NINDS द्वारा समर्थित नैदानिक ​​और बुनियादी तंत्रिका विज्ञान में मिशिगन प्रशिक्षण विश्वविद्यालय T32-NS007222 अनुदान; और एनआईएच / NIGMS (सामान्य चिकित्सा विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान) द्वारा समर्थित मिशिगन चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम के विश्वविद्यालय T32-GM007863 अनुदान। लेखक एकडॉ कैरिन Muraszko और न्यूरोसर्जरी विभाग से प्राप्त शैक्षिक नेतृत्व और समर्थन के लिए आभारी पुन; एम Dahlgren, डी Tomford है, और शानदार प्रशासनिक सहायता के लिए एस Napolitan करने के लिए; बकाया तकनीकी सहायता के लिए एम Dzaman करने के लिए; और एक जीस 3 डी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की खरीद की ओर उदार सहायता के लिए फिल एफ जेनकींस करने के लिए। हम यह भी मस्तिष्क कोशिकाओं mononuclear के अलगाव के लिए घनत्व centrifugation मीडिया की मध्यस्थता की रणनीति का एक संशोधित संस्करण तैयार किया गया था, जिसमें से हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में Kuchroo प्रयोगशाला स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modification of Eagles Medium Gibco 12430-054 with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red 
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline  Gibco 14190-144  without calcium chloride or Magnesium chloride
Fetal bovine serum Omega Scientific Inc. FB-11
Penicillin Streptomycin  Gibco 15140-122 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin 
L-glutamine Gibco 25030-081 200 mM
G418 sulfate  Omega Scientific Inc. GN-04
Puromycin dihydrochloride   Sigma-Aldrich P8833 from Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative  Thermo Scientific SV30030.01 in DPBS with EDTA 
Phase contrast hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629 0.1 mm deep
Trypan blue stain Gibco 15250-061
Sterile 0.9% NaCl injection, USP Hospira NDC: 0409-4888 10 ml vials
0.6 ml conical polypropylenemi microtubes Genesee Scientific 22-272
Atipamezole hydrochloride injection Orion Pharma NDC: 52483-6298 5 mg/ml solution
Ketamine hydrochloride injection Fort Dodge NDC: 0409-2051 100 mg/ml solution
Dexmedetomidine hydrochloride injection Zoetis NDC: 54771-2805 0.5 mg/ml solution
Xylazine hydrochloride injection Lloyd NDC: 61311-481 100 mg/ml solution
Carprofen injection Pfizer NDC: 61106-8501 50 mg/ml solution
Buprenorphine hydrochloride injection Reckitt Benckiser NDC: 12496-0757 0.3 mg/ml ampuls
1 ml tuberculin syringes  Covidien 8881501400
26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles  BD 305111
Surgical clippers 3M 9661
Providone-iodine solution Aplicare 82-217 NDC: 52380-1905
Sterile petrolatum ophthalmic ointment  Dechra NDC: 17033-211
70% isopropyl alcohol prep pads Kendall 6818
Sterile gauze Covidien 8044 non-woven, 4" x 4", 4-ply 
1.7 ml conical polypropylene microtubes Genesee Scientific 22-281
Mouse stereotactic frame Stoelting 51730
Surgical lamp Philips Burton CS316W Coolspot II Variable Spotlight
Curved dissecting forceps Ted Pella Inc. 5431
Colibri retractors  FST 17000-03
Cordless precision power drill Dremel  1100-01 Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station
Engraving Cutter Dremel 105 1/32" or 0.8 mm bit diameter
Microliter syringe Hamilton 75 Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume
Microliter syringe needles Hamilton 7762-06 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK
Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures  Ethicon 1663
Magnetic stir bar VWR 74950-296 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length)
1 L glass screw-cap storage bottle Corning 1395 Type 1, Class A borosilicate glass
Heparin sodium  Sagent NDC: 25021-400 1,000 U/ml solution
Peristaltic pump Cole Parmer Instruments Group 77200-60 Master Flex Easy Load II console drive
compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) available from local vendor N/A A-type, large cylinder 
20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles Kendall 8881202363 0.9 mm x 38.1 mm
Polyurethane ice bucket Fisherbrand 02-591-45 Capacity: 0.152 oz. (4.5L)
Collagenase (Type I-S) Sigma Aldrich C1639 from Clostridium histolyticum 
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical Corp. LS002007 >2,000 Kunitz units per mg dry weight
Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes Ted Pella Inc. 20157-3 top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume 
Stainless steel single edged razor blades  Garvey 40475
Bone rongeurs FST 16001-15
Hemostat FST 13014-14
Large dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Small dissection scissors FST 14094-11
Blunt end forceps Ted Pella Inc. 13250
7 ml glass Dounce tissue grinder Kontes KT885300-0007
Percoll Density Centrifugation Media  GE Healthcare GE17-0891-01
10 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-104 single use; sterile
70 μm sterile nylon mesh cell strainers  Fisherbrand 22363548
Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) Biolegend 103128
APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) eBiosciences  17-5941-82
PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) BD Pharmigen 553128
PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70)  Biolegend 101228
Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control  Biolegend 400628
APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control  eBioscience 17-4724
PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control  eBioscience 12-4031-82
PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control Biolegend 400632
Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)  Biolegend 515403
Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control  Biolegend 400151
Cytofix/Cytoperm BD 554714
15 ml polypropylene centrifuge tubes Genesee Scientific 21-103 conical bottom 
50 ml polypropylene centrifuge tubes Genesee Scientific 21-108 conical bottom
12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes  Fisherbrand 14-956-1B
FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter BD  650033
Class II Biological Safety Cabinet The Baker Company SG603 model: SterilGARD III Advance

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 105 तंत्रिकाबंधार्बुद परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) galectin -1 (लड़की -1) GL26-सीआईटी-gal1i GL26-सीआईटी-एनटी जीआर 1 प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.)
अलगाव और Glioma-घुसपैठ परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear के प्रवाह cytometric विश्लेषण
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Baker, G. J., Castro, M. G., Lowenstein, P. R. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (105), e53676, doi:10.3791/53676 (2015).

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